何建萍 ，呂夢(mèng)欣 ，秦茂華 ，朱麗虹 ，黨峰博 ，孫永波 ，羅勝軍 ，羅 蘭 ，唐 健

（1）昆明市婦幼保健院醫(yī)學(xué)遺傳與產(chǎn)前診斷科，云南 昆明 650031;2）昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

吉爾伯特綜合征（gilbert syndrome，GS）又稱Gilbert 綜合征，是一種較為常見(jiàn)的家族遺傳性先天血清高膽紅素血癥，由于尿苷二磷酸葡萄糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶1A1（uridine diphosphate glucuronosyltransferase 1A1，UGT1A1）基因變異導(dǎo)致該酶活性部分或完全喪失，使得肝臟內(nèi)非結(jié)合膽紅素向結(jié)合膽紅素的轉(zhuǎn)化過(guò)程發(fā)生障礙，從而引起以非結(jié)合膽紅素水平升高為主的臨床綜合征[1-3]。有研究表明[4-6]，UGT1A1基因變異譜在不同地區(qū)和人群間存在著明顯差異。云南省位于我國(guó)西南邊陲，其少數(shù)民族種類較多，奎莉越等[7]發(fā)現(xiàn)云南怒江、保山、臨滄等邊界地區(qū)非結(jié)合性膽紅素血癥發(fā)病原因與UGT1A1基因c.211G >A、c.1456T >G、c.1061C >T 等位點(diǎn)變異有關(guān)。而昆明地區(qū)人群中UGT1A1基因變異譜尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。本研究對(duì)357 例昆明地區(qū)GS 患兒進(jìn)行高通量測(cè)序與生物信息學(xué)分析，探討本地區(qū)人群中UGT1A1基因變異譜，為昆明地區(qū)非結(jié)合高膽紅素血癥疾病的診斷、預(yù)防及治療提供參考依據(jù)，同時(shí)也為該疾病分子機(jī)制研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選自2020 年4 月至2022 年12 月昆明市婦幼保健院診療的昆明地區(qū)出生的357 例基因型明確的Gilbert 綜合征患兒，其中男性患兒243 例，女性患兒114 例，男女比例約為2.1∶1；患兒年齡1～33 d，平均年齡為17.44 d，樣本年齡均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差為（17.44±7.61）d；其臨床癥狀有且不限于高膽紅素血癥、不明原因非結(jié)合型高膽紅素血癥、核黃疸、新生兒病理性黃疸、黃疸反復(fù)不退、黃疸消退延遲，皮膚重度黃染、肝功能異常等；共有臨床癥狀均為黃疸類型。本項(xiàng)目通過(guò)昆明市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核，倫理審核批號(hào)：昆婦幼倫審〔2020〕3 號(hào)，家屬均充分知情后，簽署知情同意。

1.2 研究方法

1.2.1 基因組DNA 提取采用深圳聯(lián)合醫(yī)學(xué)科技有限公司提供的磁珠法血斑&血卡基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA，操作嚴(yán)格按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.2.2 目標(biāo)基因序列捕獲及文庫(kù)構(gòu)建采用超多重PCR 擴(kuò)增法，經(jīng)擴(kuò)增、純化、再擴(kuò)增、再純化等方法后得到目標(biāo)序列文庫(kù)，使用Thermo Qubit Flurometer 3.0 熒光定量?jī)x進(jìn)行文庫(kù)定量、Aglient2100 生物分析儀進(jìn)行文庫(kù)長(zhǎng)度測(cè)定。

1.2.3 高通量測(cè)序采用Illumina NextSeq 550 測(cè)序儀進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.2.4 生物信息分析測(cè)序原始數(shù)據(jù)經(jīng)堿基識(shí)別分析轉(zhuǎn)化為原始測(cè)序序列文件，過(guò)濾去除低質(zhì)量序列后獲得有效測(cè)序數(shù)據(jù)，再采用BWA 軟件與人參考基因組作比對(duì)，應(yīng)用GATK 軟件、ANNOVAR軟件分析變異信息并注釋。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

數(shù)據(jù)采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS20.0 分析處理。其中計(jì)量資料數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示；計(jì)數(shù)資料數(shù)據(jù)采用頻數(shù)（n）、率或者構(gòu)成比（%）表示。

2 結(jié)果

2.1 昆明地區(qū)357 例Gilbert 綜合征基因變異情況結(jié)果

在357 例Gilbert 綜合征患者中，檢出UGT1A1基因純合變異82 例。其中c.211G >A 純合變異77 例，占UGT1A1基因純合變異總數(shù)的93.9%；c.1091C >T 純合變異3 例，占UGT1A1基因純合變異總數(shù)的3.7%；c.1198A >C 純合變異2 例，占UGT1A1基因純合變異總數(shù)的2.4%。檢出UGT1A1基因雜合變異275 例，其中c.211G >A雜合變異190 例，占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的69.1%；c.1091C >T 雜合變異為49 例，占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的17.8%；c.1456T >G 雜合變異15 例，占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的5.5%；c.1198A >C 雜合變異7 例，占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的2.5%；c.1352C >T、c.596C >G 雜合變異各3 例，各占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的1.1%；c.1423C >T 雜合變異2 例，占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的0.7%；c.1100G >A、c.1389G >C、c.610A >G、c.163C >T、c.715C >T、c.1021C >T 雜合變異各1 例，各占UGT1A1基因雜合變異總數(shù)的0.4%。Gilbert 綜合征基因變異情況，見(jiàn)表1，Gilbert 綜合征基因變異位點(diǎn)測(cè)序圖，見(jiàn)圖1。

圖1 昆明地區(qū)357 例Gilbert 綜合征基因變異位點(diǎn)測(cè)序圖Fig.1 357 cases of Gilbert syndrome gene variant site sequencing diagram in Kunming

表1 昆明地區(qū)357 例Gilbert 綜合征基因變異表Tab.1 Gene variation of 357 cases with Gilbert Syndrome in Kunming

3 討論

Gilbert 綜合征是由Augustine Gilbert 和Pierre Lerebullet 首先報(bào)道的一種先天性血清膽紅素增高血癥，其分子遺傳學(xué)基礎(chǔ)是由于UGT1A1 酶基因多態(tài)性導(dǎo)致[8]。UGT1A1基因變異導(dǎo)致尿苷二磷酸葡萄糖苷酸基轉(zhuǎn)移酶蛋白水平下降，從而導(dǎo)致血清中非結(jié)合膽紅素水平升高并引發(fā)相應(yīng)的臨床表現(xiàn)[9-11]。新生兒期出現(xiàn)不明原因非結(jié)合型高膽紅素血癥、核黃疸、新生兒病理性黃疸、黃疸反復(fù)不退、黃疸消退延遲，皮膚重度黃染等臨床癥狀可能是GS 的早期表現(xiàn)，患兒臨床癥狀多較為輕微，不引起肝臟器質(zhì)性病變，易被誤診和漏診[12]，早期診斷對(duì)患兒的及時(shí)治療尤為重要。UGT1A1基因定位于2q37.1，目前已發(fā)現(xiàn)UGT1A1基因變異類型300 余種，其突變方式主要為缺失突變、插入突變及錯(cuò)義突變等[13]。隨著分子生物學(xué)的飛速發(fā)展，高通量測(cè)序技術(shù)已在臨床廣泛應(yīng)用，在新生兒期明確Gilbert 綜合征基因變異情況，能為臨床及時(shí)治療提供診斷依據(jù)。

本研究對(duì)昆明地區(qū)357 例Gilbert 綜合征患兒基因變異情況進(jìn)行測(cè)序分析，檢出的第1 順位基因變異為UGT1A1基因外顯子第211 位堿基由G變異為A，使編碼氨基酸的密碼子由甘氨酸（GGA）變?yōu)榫彼幔ˋGA）。該變異位點(diǎn)為功能性多態(tài)變異，在亞洲黃種人中最為常見(jiàn)，大多數(shù)患者癥狀不明顯，主要表現(xiàn)為輕度黃疸，是一種間歇性、長(zhǎng)期性的以非溶血性黃疸為病理特征的良性遺傳性疾病[14-16]。檢出的第2 順位基因變異為UGT1A1基因外顯子第1 091 位堿基由C 變異為T，使編碼氨基酸的密碼子由脯氨酸（CCG）變?yōu)榱涟彼幔–UG），該變異為可能致病性變異，有研究表明該位點(diǎn)變異可使UGT1A1 酶活性下降[17-18]。檢出的第3 順位基因變異為UGT1A1基因外顯子第1 456位堿基由T 變異為G，使該編碼氨基酸的密碼子由絡(luò)氨酸（UAC）變?yōu)樘於彼幔℅AC）。該變異為致病性變異，有研究顯示該位點(diǎn)發(fā)生純合變異時(shí)，膽紅素尿二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)酶活性會(huì)降至正常水平的7.6%左右，導(dǎo)致非結(jié)合膽紅素與結(jié)合膽紅素的轉(zhuǎn)化發(fā)生障礙，從而體內(nèi)非結(jié)合膽紅素升高[10]。綜上，昆明地區(qū)Gilbert 綜合征基因變異譜順位前3 位為c.211G >A、c.1091C >T 和c.1456T >G 變異，與奎莉越[7]研究結(jié)果存在差異，提示昆明地區(qū)Gilbert 綜合征基因變異譜與云南邊界地區(qū)有所不同。

本研究檢出的c.715C >T 變異與c.1021C >T變異均為致病性變異，c.715C >T 為無(wú)義突變，曾在致死性疾病Crigler-Najjar 綜合征I 型中檢出，當(dāng)該變異發(fā)生純合變異時(shí)，使編碼氨基酸的密碼子由終止密碼子（TAG）替換了谷氨酰胺（CAG），導(dǎo)致膽紅素尿二磷酸葡糖醛酸轉(zhuǎn)酶失去功能，導(dǎo)致嚴(yán)重的非結(jié)合高膽紅素血癥[19]。c.1021C >T 變異則為巴基斯坦兒童持續(xù)非結(jié)合性高膽紅素血癥的UGT1A1基因變異中最常見(jiàn)的變異類型[20]，但在國(guó)內(nèi)文獻(xiàn)中報(bào)道較少。本研究檢出的C.1198A >C、1352C >T、c.596C >G、c.1423C >T、c.1100G >A、c.610A >G 變異在人類基因突變數(shù)據(jù)庫(kù)（the human gene mutation database，HGMD）與Clinvar 數(shù)據(jù)庫(kù)中雖歸于意義不明性變異，但也有研究[21]通過(guò)SIFT、Polyphen-2、Mutation Taster、PROVEAN、Mutation Assessor 軟件預(yù)測(cè)這些變異可能致病，這提示該類變異有待于進(jìn)一步隨訪觀察其臨床表現(xiàn)，探討其是否具有致病性。

此外，本研究首次檢出了c.1389G >C 及c.163C >T 2 種變異類型，HGMD 與Clinvar 數(shù)據(jù)庫(kù)中尚未收錄該變異位點(diǎn)，既往文獻(xiàn)也尚無(wú)報(bào)道，該變異位點(diǎn)需進(jìn)一步隨訪其臨床表現(xiàn)，探討其是否具有致病性。

綜上所述，昆明地區(qū)Gilbert 綜合征基因變異譜順位前3 位為c.211G >A、c.1091C >T 和c.1456T >G 變異，與云南邊境地區(qū)變異類型存在差異，并首次發(fā)現(xiàn)新變異類型。這為昆明地區(qū)非結(jié)合高膽紅素血癥疾病的診斷、預(yù)防及治療提供了重要的參考依據(jù)，同時(shí)也為進(jìn)一步探索非結(jié)合高膽紅素血癥的疾病發(fā)生機(jī)制提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。