劉邦卿 ，李劍鋒 ，劉曉輝 ，張勁男 ，梁金屏

（1）唐山市人民醫(yī)院胸外二科;2）頭頸外科，河北 唐山 063000）

肺腺癌（lung adenocarcinoma，LUAD）是最常見的非小細胞肺癌（non-small cell lung cancer，NSCLC）類型，其特征是淋巴細胞浸潤密集，并且在早期容易發(fā)生轉(zhuǎn)移[1]。近年來，隨著LUAD 的治療逐漸從傳統(tǒng)治療演變?yōu)榛诎┘毎蛱卣鞫ㄖ频膫€性化治療，肺癌患者的預(yù)后大幅改善[2]。但目前LUAD 仍然容易復(fù)發(fā)并造成患者死亡，5 a總生存率仍低于15%[3]。因此，有必要探索LUAD 發(fā)生和轉(zhuǎn)移的潛在機制，這可以為開發(fā)LUAD 治療的新方法提供新的途徑。

微小RNA（microRNA，miRNA）是介導(dǎo)不同分子過程的關(guān)鍵參與者，它們比蛋白質(zhì)編碼基因更常參與腫瘤發(fā)生[4]。據(jù)報道，miR-196b 作為致癌基因參與調(diào)控幾種癌癥的進展，例如結(jié)直腸癌[5]和胃癌[6-7]；同時，抑制miR-196b 的表達還能夠促進神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對替莫唑胺化療和放療的敏感性[5]。在肺腺癌中，人們同樣發(fā)現(xiàn)miR-196b 具有促癌作用[8-10]?？梢妋iR-196b 在多個癌癥中都起到了促癌的作用，但其在LUAD 中的作用機制仍需完善。ETS 相關(guān)基因（ETS-related gene，ERG）是E-26 轉(zhuǎn)換特異性（E-26 transformation-specific，ETS）轉(zhuǎn)錄因子家族成員之一，在血管生成、造血和骨發(fā)育等發(fā)育過程中發(fā)揮重要作用[11]。ERG 作為致癌基因在前列腺癌中起到了很重要的作用，研究發(fā)現(xiàn)，ERG 是前列腺癌潛在的診斷和預(yù)后生物標志物，能夠促進前列腺癌細胞的增殖和遷移[12-13]；而在肝癌中，著色性干皮病基因G 組（xeroderma pigmentosum group D，XPG）基因過表達可下調(diào)ERG 的表達，進而抑制肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）細胞的增殖，促進其凋亡[14]。然而，目前ERG 在肺腺癌中的作用仍不明確。

本研究前期總結(jié)了前人的研究成果，同時利用生信分析發(fā)現(xiàn)miR-196b 在LUAD 中高表達，通過設(shè)計實驗探究miR-196b 是否在LUAD 中發(fā)揮關(guān)鍵作用，發(fā)現(xiàn)miR-196b 對LUAD 增殖、遷移和侵襲的促進作用是通過靶向負調(diào)控ERG 基因的表達來實現(xiàn)的。這項研究可能為闡明LUAD 腫瘤發(fā)生的機制提供新的機會。

1 材料與方法

1.1 主要材料

本研究使用的培養(yǎng)基DMEM-H 和RPMI-1640 購自中國北納生物公司，Lipofectamine?3000 試劑盒、Trizol 試劑盒購買自美國Invitrogen公司，PrimeScript RT 試劑盒、SYBR Premix Ex Taq 購買自日本Takara 公司，1 %蛋白酶抑制劑購自美國Sigma 公司，聚偏二氟乙烯膜購自美國Millipore 公司，基質(zhì)膠購于美國BD Bioscience公司，ERG（ab92513，1∶1 000）、GAPDH（ab181602，1∶10 000）、IgG（ab205718，1∶20 000）抗體購自英國Abcam 公司，miR-196b-mimic（miR-mimic）及其陰性對照NC-mimic、miR-196b-inhibitor（miR-inhibitor）及其陰性對照NC-inhibitor、ERG過表達載體（oe-ERG）及其空載體（oe-NC）均購買于GenePharma 公司（中國），載體pmiRGLO、熒光素酶測定系統(tǒng)來自美國Promega 公司，Applied Biosystems ABI 7500 實時PCR 系統(tǒng)、RIPA 裂解緩沖液、化學(xué)發(fā)光發(fā)色底物、MTT、二甲亞砜購于美國Thermo Fisher Scientific 公司，Image Lab軟件、酶標儀來自美國Bio-Rad 公司，Transwell小室購于美國Corning Costar 公司。

1.2 生信分析

從癌癥基因組圖譜（the cancer genome atlas，TCGA）（https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫下載TCGA-LUAD 疾病Isoform Expression 數(shù)據(jù)（癌旁組織：46 例，腫瘤組織：521 例），將樣本文件合并成表達量矩陣。從miRBase（http://www.mirbase.org/）數(shù)據(jù)庫下載人類miRNA 注釋文件對表達量進行注釋，利用‘edgeR’包[15]對mRNA進行差異分析（|logFC| >1.5，F(xiàn)DR <0.05）?；赥CGA 數(shù)據(jù)庫下載患者miR-196b 的表達量數(shù)據(jù)與患者生存狀況數(shù)據(jù)，根據(jù)這些數(shù)據(jù)通過‘survive’包繪制K-M 曲線。

通過 TargetScan 數(shù)據(jù)庫（http://www.target scan.org/vert_72/），對差異miRNA 的下游靶基因進行預(yù)測。從TCGA（https://portal.gdc.cancer.gov/）數(shù)據(jù)庫選擇TCGA-LUAD 疾病Gene Expression 數(shù)據(jù)，下載count 數(shù)據(jù)類型（癌旁組織：59 例，腫瘤組織：535 例）。將樣本文件進行合并成表達量矩陣。從GENECODE（https://www.gencodegenes.org/）數(shù)據(jù)庫下載人類基因組注釋文件對表達量矩陣進行注釋提取mRNA 表達量矩陣數(shù)據(jù)，利用‘edgeR’包對mRNA 進行差異分析（|logFC| >1.5，F(xiàn)DR <0.05）。

1.3 細胞培養(yǎng)

本研究使用的細胞系均購自北納生物公司，在37 ℃，5 %CO2的條件下培養(yǎng)，培養(yǎng)條件與Zhang 等[16]相同。各細胞使用的培養(yǎng)基，見表1。

表1 研究使用的細胞系及培養(yǎng)基Tab.1 Cell lines and media used in the study

1.4 細胞轉(zhuǎn)染

實驗方法參考Sheng K 等[17]。利用Lipofectamine? 3000 試劑盒將miR-196b-mimic、NCmimic、miR-196b-inhibitor、NC-inhibitor 轉(zhuǎn)染到HCC-78 細胞系中，使用定量qRT-PCR 確定轉(zhuǎn)染是否成功。同樣，利用Lipofectamine? 3000 試劑盒將oe-ERG、oe-NC 轉(zhuǎn)染到HCC-78 細胞系中，使用定量qRT-PCR 或Western blot 分析確定轉(zhuǎn)染是否成功。

1.5 實時熒光定量PCR

使用Trizol 試劑盒從LUAD 細胞中提取總RNA。miRNA 和mRNA 通過PrimeScript RT 試劑盒逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。qRT-PCR 由SYBR Premix Ex Taq 在Applied Biosystems ABI 7 500 實時PCR 系統(tǒng)下進行。使用GAPDH 作為ERG 內(nèi)源性參照，U6 作為miR-196b 的內(nèi)源性參照；引物序列，見表2，所有檢測結(jié)果均采用2-ΔΔCt值的方法進行分析[18]。

表2 引物序列表Tab.2 Primer Sequence Table

1.6 蛋白質(zhì)印跡法

將細胞在含有1 %蛋白酶抑制劑的RIPA 裂解緩沖液中裂解。在4 ℃下以16 000 r/min 離心20 min 后，用BCA 蛋白測定試劑盒對總蛋白進行定量，然后在98 ℃下變性10 min。通過SDSPAGE 凝膠電泳分離蛋白質(zhì)，然后將其轉(zhuǎn)移至聚偏二氟乙烯膜，在含有0.1 % Tween 20（TBST）的配制的5 %脫脂牛奶中封閉1 h，隨后，將膜與一抗ERG，GAPDH 在4 ℃下過夜孵育。第2 天用TBST 在室溫下洗滌3 次后，將膜與辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗IgG 在室溫下孵育2 h，然后使用TBST 洗膜3 次。最后通過使用增強的化學(xué)發(fā)光發(fā)色底物進行發(fā)光反應(yīng)，并使用Image Lab 軟件進行分析[19]。

1.7 細胞增殖實驗

將HCC-78 以每孔3 000 個細胞的密度接種到96 孔板中。分別在培養(yǎng)時間0 h、24 h、48 h或72 h 時，將細胞與MTT 溶液相互作用4 h，棄去上清液，添加100 μL 二甲基亞砜溶解甲瓚。使用酶標儀檢測570 nm 處的吸光度[20]。

1.8 劃痕愈合實驗

將轉(zhuǎn)染的HCC-78 細胞以1×105的細胞密度接種在6 孔板中并生長至80 %融合。使用200 μL 移液器吸頭沿直線劃傷單層細胞。通過PBS 洗滌去除細胞碎片，隨后將劃傷的細胞在無血清培養(yǎng)基中培養(yǎng)。在劃痕后0 h 和48 h 使用顯微鏡拍攝圖像并記錄劃痕寬度[21]。

1.9 Transwell 實驗

對于遷移測定，將2×104個細胞懸浮在無血清培養(yǎng)基中并接種于上層小室，下室填滿30%FBS 培養(yǎng)基。對于侵襲測定，根據(jù)制造商的方案，用基質(zhì)膠包被上室，然后加入含2×104個細胞的無血清培養(yǎng)基，下室填滿30% FBS 培養(yǎng)基[22]。最后，在顯微鏡下分別計數(shù)用0.1%結(jié)晶紫染色的遷移和侵襲細胞并拍照。

1.10 雙熒光素酶實驗

將含有miR-196b 假定結(jié)合位點的ERG 的3′非翻譯區(qū)（untranslated region，UTR）以及對應(yīng)的突變序列插入到載體pmiRGLO 中，構(gòu)建pmiRGLOERG-WT、pmiRGLO-ERG-MUT。根據(jù)制造商的規(guī)程，使用Lipofectamine 3000 將ERG-WT 或ERG-MUT 與miR-mimic 或miR-NC 共轉(zhuǎn)染到HCC-78 細胞中。轉(zhuǎn)染 48 h 后，使用熒光素酶測定系統(tǒng)檢測熒光素酶活性[23]。

1.11 統(tǒng)計學(xué)處理

所有統(tǒng)計分析均由 GraphPad Prism 6.0 進行。數(shù)據(jù)表示為平均值±標準偏差（SD），通過t檢驗或單向方差分析（兩兩比較采用最小二乘法）用于比較組間差異。P<0.05 被認為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 在肺癌組織中miR-196b 高表達，ERG 低表達

為預(yù)測肺腺癌中的差異表達基因，基于TCGA-LUAD 進行差異分析。肺腺癌的miRNA 表達量數(shù)據(jù)和臨床數(shù)據(jù)分析結(jié)果顯示，miR-196b在肺腺癌組織中表達升高[癌旁樣本中的相對表達為（4.422±1.045），腫瘤樣本中的相對表達為（6.317±2.468）]，見圖1A。以miR-196b 表達的中位值為界線將LUAD 患者分為miR-196b 高表達組和miR-196b 低表達組，K-M（Kaplan-Meier）曲線分析發(fā)現(xiàn)miR-196b 高表達患者的5 a 生存率低于miR-196b 低表達患者（P=0.001 6），說 明miR-196b 高表達與患者的生存率呈負相關(guān)，見圖1B。在得到以上的研究結(jié)果后，筆者想進一步了解miR-196b 的調(diào)控機制?；赥CGA 數(shù)據(jù)庫結(jié)合文獻[24]確定研究對象ERG，發(fā)現(xiàn)ERG 在肺腺癌組織中下調(diào)[癌旁樣本中的相對表達為（11.544±0.606），腫瘤樣本中的相對表達為（9.300±0.844），P=3.50e-17]，見圖1C。

圖1 miR-196b 和ERG 在肺腺癌中的表達情況Fig.1 Expression of miR-196b and ERG in lung adenocarcinoma

2.2 miR-196b 在肺腺癌細胞中高表達

基于以上生信結(jié)果，在細胞實驗中進一步檢測miR-196b 表達量。結(jié)果顯示，與BEAS-2B 細胞（1±0.08）相比，miR-196b 在HCC-78、PC-9、H1395、Calu-3 細胞系中的表達均升高[分別為（4.55±0.23），（2.07±0.18），（3.14±0.22）和（2.54±0.18），（P<0.05）]。且在HCC-78 中升高的最多，見圖2，在后續(xù)分析中選用HCC-78 細胞系做相關(guān)的實驗。

圖2 miR-196b 在肺腺癌細胞中的表達情況Fig.2 Expression of miR-196b in lung adenocarcinoma cells

2.3 miR-196b 可影響肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲

對miR-196b 進行過表達和敲低處理（miRmimic，miR-inhibitor），同時設(shè)置對照組（NCmimic，NC-inhibitor）以研究miR-196b 對LUAD進展的影響。過表達處理后的細胞系中miR-196b 的表達量（22.71±1.19）較對照組（1±0.07）上調(diào)（P<0.05），過表達效率為22 倍；而敲低處理后的細胞系中miR-196b 的表達量（0.25±0.03）較對照組表達水平（1±0.07）下調(diào)（P<0.05），達到75 %的沉默效率（P<0.05），見圖3A。說明轉(zhuǎn)染結(jié)果良好，可以用于后續(xù)的實驗。

圖3 miR-196b 可影響肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲Fig.3 miR-196b can affect the proliferation，migration and invasion of lung adenocarcinoma cells

為了探究轉(zhuǎn)染處理后細胞增殖能力的變化情況，利用MTT 實驗進行檢測，結(jié)果顯示過表達處理組[72 h 時光密度值為（1.687±0.123）]與對照組[72 h 時光密度值為（1.245±0.108）]相比增殖能力上調(diào)，而敲低處理組[72 h 光密度值為（0.925±0.094）]的增殖能力與對照組[72 h 光密度值為（1.245±0.108）]相比下調(diào)，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3B。

劃痕愈合實驗和Transwell 實驗結(jié)果表明過表達處理后的細胞系遷移和侵襲能力[劃痕愈合率為（35.57±2.08），遷移細胞個數(shù)為（314±27），侵襲細胞個數(shù)為（288±21）]與對照組[劃痕愈合率為（20.94±1.73），遷移細胞個數(shù)為（201±16），侵襲細胞個數(shù)為（166±11）]相比增強，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），而敲低處理后細胞系遷移和侵襲能力[劃痕愈合率為（18.13±1.61），遷移細胞個數(shù)為（179±14），侵襲細胞個數(shù)為（106±9）]與對照組[劃痕愈合率為（43.64±2.51），遷移細胞個數(shù)為（298±21），侵襲細胞個數(shù)為（249±12）]相比減弱，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3C～3D。

2.4 ERG 是miR-196b 的靶基因

筆者搜索TargetScan 數(shù)據(jù)庫發(fā)現(xiàn)，ERG 3′-UTR 與miR-196b 有一段互補序列，見圖4A，推測ERG 是miR-196b 的潛在靶基因。雙熒光素酶實驗結(jié)果顯示，miR-mimic 降低了轉(zhuǎn)染ERG 3′-UTR WT 的細胞的熒光素酶活性，但不能降低轉(zhuǎn)染 ERG 3′-UTR MUT 的細胞的熒光素酶活性，見圖4B。這說明miR-196b 與ERG 之間存在物理上的相互作用，即miR-196b 能靶向結(jié)合ERG。

圖4 miR-196b 的靶點檢測及不同處理組細胞中ERG 的表達情況Fig.4 Target detection of miR-196b and expression of ERG in cells of different treatment groups

然后探究了ERG 在各個細胞系的表達情況，結(jié)果顯示，ERG 的mRNA 和蛋白表達水平在肺腺癌細胞系中下調(diào)[BSEA-2B 細胞的ERG 相對mRNA 表達水平是（1±0.09），HCC-78、PC-9、H1395、Calu-3 細胞系中ERG 的mRNA 表達水平分別為（0.31±0.02），（0.72±0.04），（0.83±0.06）和（0.51±0.03），（P<0.05）]，且在HCC-78 中表達最低，見圖4C。此外，為驗證ERG 和miR-196b 功能上的關(guān)系，通過qRT-PCR 和Western blot 檢測miR-196b 在HCC-78 細胞中過表達后ERG 的mRNA 和蛋白表達量，結(jié)果發(fā)現(xiàn)miR-196b 過表達組中 ERG 的 mRNA 表達量（0.35±0.03）較對照組（1±0.11）下調(diào)，蛋白表達也呈降低趨勢，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖4D。

2.5 miR-196b 能靶向下調(diào)ERG 促進肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力

為驗證miR-196b 是否通過靶向ERG 在LUAD 進展中發(fā)揮作用。構(gòu)建單獨過表達/沉默miR-196b，同時過表達miR-196b 和ERG，同時沉默miR-196b 和ERG 的LUAD 細胞系HCC-78，并通過qRT-PCR 和Western blot 檢測轉(zhuǎn)染效果。結(jié)果顯示單獨過表達miR-196b 時，ERG 的mRNA 和蛋白表達量下調(diào)（P<0.05），而miR-196b 與ERG 同時進行過表達處理時，ERG 的mRNA 和蛋白表達量較單獨過表達miR-196b 時上升（P<0.05）。單獨沉默miR-196b 時，ERG 的mRNA 和蛋白表達量得到了升高（P<0.05），而miR-196b 與ERG 同時沉默處理時，ERG 的mRNA 和蛋白表達量較單獨沉默miR-196b 時下降（P<0.05），見圖5A。接下來，利用MTT、劃痕愈合和Transwell 實驗對不同處理組細胞增殖、遷移和侵襲能力進行檢測。結(jié)果顯示，單獨過表達miR-196b 的處理組細胞系增殖、遷移和侵襲能力較對照組增強，而同時過表達miR-196b 與ERG 的處理組細胞增殖、遷移和侵襲能力又得到了恢復(fù)。單獨沉默miR-196b 的處理組細胞系增殖、遷移和侵襲能力較對照組下降（P<0.05），而同時沉默miR-196b 與ERG 的處理組細胞增殖、遷移和侵襲能力又得到了恢復(fù)，見圖5B～圖5D。

圖5 miR-196b 能靶向下調(diào)ERG 促進肺腺癌細胞的增殖、遷移和侵襲能力Fig.5 miR-196b can target down regulate ERG to promote the proliferation，migration and invasion of lung adenocarcinoma cells

3 討論

miRNA 基于調(diào)節(jié)腫瘤相關(guān)基因表達的能力，在調(diào)節(jié)腫瘤特性中起著關(guān)鍵作用[25]。miR-196b在癌癥中發(fā)揮雙重作用，研究報道m(xù)iR-196b 低表達在胃癌[7]，白血病[26]中具有腫瘤抑制作用。最新研究表明，在頭頸部鱗狀細胞癌中miR-196b 高表達與不良預(yù)后相關(guān)[27]。這些發(fā)現(xiàn)表明，miR-196b 有作為腫瘤治療靶點的潛力。在肺腺癌中，miR-196b 已被發(fā)現(xiàn)能夠通過靶向AQP4[8]促進肺腺癌的增殖和遷移。結(jié)合前人的研究，miR-196b 可能通過靶向多個基因發(fā)揮作用，其對LUAD 的影響機制還需繼續(xù)探究。研究結(jié)果顯示，與正常對照相比，miR-196b 在肺腺癌中的表達水平上調(diào)，過表達miR-196b 能夠增強LUAD 細胞的增殖、遷移和侵襲能力，這與前人的研究一致，敲低miR-196b 后則可明顯抑制LUAD 細胞的增殖、遷移和侵襲能力。本研究進一步表明miR-196b 在LUAD 中可能充當腫瘤促進因子。

為了闡明miR-196b 參與LUAD 發(fā)病機制，筆者分析了受miR-196b 調(diào)控的靶基因，利用TargetScan 數(shù)據(jù)庫搜索 miR-196b 靶基因，并選擇ERG 為進一步研究的候選者。ERG 于1987 年發(fā)現(xiàn)，是E-26 家族的成員，對整個組織和細胞的生長發(fā)育至關(guān)重要[28]。ERG 是一種著名的致癌基因，人們發(fā)現(xiàn)在前列腺癌中，ERG 的高表達與患者臨床特征（晚期腫瘤分期、發(fā)生遠端轉(zhuǎn)移等）[29-30]和促進細胞行為（增殖、遷移和侵襲）[12,31]有關(guān)。還有研究發(fā)現(xiàn)ERG 的過表達能夠促進肝細胞癌的血管生成[32]，下調(diào)ERG 的表達可抑制肝癌細胞增殖，促進凋亡[14]。在肺腺癌中，ERG 可作為預(yù)測LUAD 患者的預(yù)后標志物[33]。然而，ERG 在肺腺癌中的具體調(diào)控作用仍然不能確定。本研究發(fā)現(xiàn)ERG 在肺腺癌中下調(diào)，miR-196b 能夠靶向抑制ERG 的表達，過表達ERG 回復(fù)過表達miR-196b 對肺腺癌細胞增殖、遷移侵襲能力的促進作用。結(jié)果顯示，miR-196b 在LUAD 中表現(xiàn)出明顯的促癌作用，并可以被ERG 過表達所逆轉(zhuǎn)。但該結(jié)果與前列腺癌和肝細胞癌中的研究并不一致，筆者猜測這可能是因為腫瘤存在異質(zhì)性造成的。LUAD 細胞由于其分化特征與肝細胞、前列腺細胞存在區(qū)別而導(dǎo)致基因?qū)δ[瘤細胞的生長存在不同的影響。早前也有研究報道TM4SF1等基因由于腫瘤異質(zhì)性的存在導(dǎo)致其在不同癌種中表現(xiàn)出不同的作用，筆者猜測ERG 在不同癌種中存在不同的表現(xiàn)也是因為類似原因[34-36]。筆者的研究創(chuàng)新性地發(fā)現(xiàn)miR-196b 與ERG 在LUAD中的靶向調(diào)節(jié)關(guān)系，并發(fā)現(xiàn)了ERG 基因?qū)UAD細胞表性的影響與在其他癌種中的差異。表明miR-196b 在LUAD 中可能通過調(diào)節(jié)多個靶點發(fā)揮作用。這為miR-196b 可能作為癌癥治療靶點提供依據(jù)。

但本研究仍存在不足之處，例如目前本研究僅限于體外實驗，缺乏體內(nèi)驗證；驗證的細胞生物學(xué)功能較少；對miR-196b-ERG 調(diào)控軸的上下游因子缺乏進一步挖掘。在未來的工作中，將在此基礎(chǔ)上，利用體內(nèi)實驗對本研究的結(jié)論進行驗證；探究miR-196b/ERG 調(diào)控軸對LUAD 其他生物學(xué)功能的影響；同時進一步探索miR-196b/ERG 調(diào)控軸的上下游因子，完善LUAD 發(fā)生發(fā)展的分子調(diào)控網(wǎng)路。總而言之，筆者目前的研究表明，miR-196b 在LUAD 中上調(diào)，并且能通過靶向下調(diào)ERG 的表達來促進肺腺癌的增殖、遷移和侵襲，該研究為探索miR-196b 和ERG 在癌癥中的功能提供了重要見解。