周 儀，米 鍇，馮曉麗

（昆明醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，云南 昆明 650500）

微小RNA（microRNA，miRNA）是一類長(zhǎng)約22 個(gè)核苷酸的非編碼RNA[1]，可通過(guò)加速mRNA 降解或抑制其翻譯，進(jìn)而抑制許多基因的表達(dá)，導(dǎo)致蛋白質(zhì)水平降低[2]。miR-25 屬于miR-106b-25 簇，其中還包括miR-93 和miR-106b。它在人類中定位于7 號(hào)染色體長(zhǎng)臂（7q22.1）上的微染色體維持蛋白7（MCM7）基因的內(nèi)含子上[3]。miR-25 在細(xì)胞增殖、分化、凋亡、氧化應(yīng)激、炎癥等生物過(guò)程起著非常重要的調(diào)控作用[4]。當(dāng)前關(guān)于miR-25 的研究主要集中在癌癥方面，其在胃癌、食管癌、乳腺癌等癌癥組織中的表達(dá)要高于其他正常的組織，因此miR-25 也被認(rèn)為是一種誘癌基因[5-7]。王博等[8]的研究發(fā)現(xiàn)miR-25 在鱖肌肉組織中有一定的表達(dá)量，但其在鱖中的時(shí)空表達(dá)特征以及作用機(jī)制還未明確，因此本研究對(duì)miR-25 在鱖組織和胚胎中的表達(dá)水平進(jìn)行初步分析。

生物節(jié)律是生物為了能夠適應(yīng)以地球自轉(zhuǎn)一圈（約為24 h）為規(guī)律的晝夜交替變化，而進(jìn)化出了一種內(nèi)在的調(diào)控機(jī)制。機(jī)體的各項(xiàng)功能活動(dòng)都會(huì)受到生物節(jié)律的影響，其紊亂會(huì)導(dǎo)致肥胖、糖尿病等代謝類疾病的增加[9]。急性的晝夜節(jié)律紊亂還可能導(dǎo)致大腦炎癥[10]。miRNAs 可與節(jié)律基因靶向結(jié)合從而參與生物節(jié)律的調(diào)控過(guò)程。有研究表明在小鼠中，miR-25-3p 能與節(jié)律基因Per的3’UTR 靶向結(jié)合，從而調(diào)節(jié)其震蕩[11]。可見(jiàn)，miR-25 在節(jié)律調(diào)控方面也有著重要的作用。在饑餓條件下，miR-21、miR-125b 在鱖（Siniperca chuatsi）肌肉組織中均表現(xiàn)出晝夜節(jié)律性，并且可能通過(guò)調(diào)節(jié)生物節(jié)律參與饑餓脅迫下的動(dòng)態(tài)調(diào)節(jié)過(guò)程[12-13]，因此miRNAs 對(duì)魚類節(jié)律的調(diào)節(jié)具有重要的意義，但是其相關(guān)研究還較少，并且目前還未發(fā)現(xiàn)miR-25 在鱖節(jié)律方面的研究，因此本研究初步對(duì)miR-25 在鱖中的靶向核心生物鐘基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。

鱖屬于鱸形目、真鱸科、鱖屬，具有非常高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是一種名貴的淡水經(jīng)濟(jì)魚類。Jeffrey 等[14]的研究表明肌肉的代謝和生長(zhǎng)會(huì)直接受到生物鐘的調(diào)節(jié)。正常的生物節(jié)律可以降低鱖炎癥以及代謝類疾病的發(fā)生，并且促進(jìn)肌肉的正常發(fā)育和生長(zhǎng)。為了探究miR-25 在鱖的時(shí)空表達(dá)特征與其對(duì)生物節(jié)律基因的調(diào)控作用，該研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)，分析了鱖不同組織和胚胎中miR-25 的表達(dá)差異性，同時(shí)預(yù)測(cè)其靶向核心生物鐘基因，用來(lái)初步揭示miR-25 對(duì)鱖生物鐘的影響，并且為后續(xù)研究miR-25 的生理作用以及在生物節(jié)律方面的調(diào)節(jié)機(jī)制提供一些參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

RNA 提?。═RIzol）試劑、One Step PrimeScript?miRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒和SYBR Premix Ex TaqTMII 均購(gòu)自寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司。熒光定量PCR 儀購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)公司（BioRad）。

1.2 樣品來(lái)源

本次實(shí)驗(yàn)所用的鱖及胚胎均來(lái)自于湖南省水產(chǎn)科學(xué)研究所。

1.3 實(shí)驗(yàn)方法

1.3.1 鱖不同組織取樣隨機(jī)挑選健康、體重相近（約為200 g）的幼齡鱖3 尾，將其麻醉后置于冰上進(jìn)行解剖，收集其脾、心、腸、肝、腎、白肌以及紅肌組織，用液氮將組織迅速冷凍后置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 鱖不同時(shí)期胚胎取樣鱖人工繁殖與胚胎孵化技術(shù)參照劉希良等[15]的方法。收集培養(yǎng)至2細(xì)胞、囊胚早、囊胚晚、原腸早、原腸晚、神經(jīng)胚、視泡期、尾芽期、腦分化期、肌效期、心搏期以及出膜期的鱖胚胎各30 枚，分別保存于1 mL Trizol 溶液中，用液氮將其速凍后，置于-80 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.3 總RNA 提取使用Trizol 試劑（中國(guó)，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）提取鱖組織和胚胎樣品的總RNA，將提取出的RNA 進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其質(zhì)量，用核酸檢測(cè)儀檢測(cè)其濃度及純度。

1.3.4 cDNA 合成cDNA 合成使用One Step PrimeScript? miRNA cDNA Synthesis Kit 試劑盒（中國(guó)，寶日醫(yī)生物技術(shù)有限公司）?？偡磻?yīng)體系為20 μL，具體操作過(guò)程及反應(yīng)條件都按照試劑盒說(shuō)明書進(jìn)行。

1.3.5 引物設(shè)計(jì)及合成按照鱖miRNA 數(shù)據(jù)庫(kù)[16]，使用 Primer 5.0 軟件對(duì)miR-25 的熒光定量 PCR 引物進(jìn)行設(shè)計(jì)，見(jiàn)表1，熒光定量?jī)?nèi)參基因?yàn)閁6基因。引物合成由北京擎科生物科技有限公司完成。

表1 實(shí)時(shí)熒光定量PCR 引物Tab.1 The Primer Sequences for RT-qPCR

1.3.6 熒光定量PCR熒光定量PCR 反應(yīng)體系包括cDNA 模板1 μL、SYBR Premix Ex TaqTMII（中國(guó)，寶日醫(yī)生物有限公司）6 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL，無(wú)酶水補(bǔ)足總體系12.5 μL。反應(yīng)程序參照朱鑫等[12]的方法。每個(gè)樣品3 次重復(fù)。

1.3.7 靶向核心生物鐘基因預(yù)測(cè)本實(shí)驗(yàn)采用的是TargetScan 預(yù)測(cè)軟件對(duì)miR-25 在鱖中的靶向核心生物鐘基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。TargetScan 能鏈接microRNA 相應(yīng)靶基因的研究數(shù)據(jù)，并能提供靶基因3’UTR 的相關(guān)信息。在TargetScan（www.targetscan.org）中搜索獲得可能與miR-25 靶向互補(bǔ)配對(duì)的靶基因，從這些靶基因中篩選出與生物鐘調(diào)控有關(guān)的靶mRNA，再利用鱖基因組和轉(zhuǎn)錄組的數(shù)據(jù)庫(kù)獲得它們3’UTR 的序列，最后依照堿基之間的互補(bǔ)配對(duì)原則，查找這些靶mRNA 中是否有能夠與miR-25 結(jié)合的靶點(diǎn)。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

根據(jù)所得到的內(nèi)參基因以及目的基因的Ct 值，采用2-??Ct方法計(jì)算目的基因在不同樣品中的表達(dá)[17]。使用SPSS 16.0 對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差分析（One-Way ANOVA），再采用Duncan 檢驗(yàn)對(duì)樣本進(jìn)行兩兩比較。分析結(jié)果表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（）。P<0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 miR-25 在鱖不同組織中的表達(dá)分析

采用RT-qPCR 技術(shù)檢測(cè)miR-25 在鱖各組織中的相對(duì)表達(dá)水平。miR-25 在所檢測(cè)的紅肌、白肌、心等7 個(gè)樣品組織中都有表達(dá)。在鱖紅肌中的相對(duì)表達(dá)量最高，與其他組織相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；在心肌中次之（P<0.05）；在脾、腎、腸以及肝中的相對(duì)表達(dá)量較低，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖1。

圖1 miR-25 在鱖不同組織中的相對(duì)表達(dá)量Fig.1 Relative expression of miR-25 in different tissues of Siniperca chuatsi

2.2 miR-25 在鱖不同發(fā)育時(shí)期胚胎中的表達(dá)分析

使用RT-qPCR 檢測(cè)miR-25 在處于12 個(gè)不同發(fā)育階段的鱖胚胎中的表達(dá)特征。miR-25 在所檢測(cè)的胚胎中均有表達(dá)，其在鱖胚胎的2 細(xì)胞期表達(dá)量最高，與其他時(shí)期胚胎相比，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05），并且隨著胚胎發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)量逐漸降低，且在原腸早期后，除神經(jīng)胚期外各時(shí)期胚胎間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），見(jiàn)圖2。

2.3 miR-25 靶向核心生物鐘基因預(yù)測(cè)分析

利用與鱖成熟序列互補(bǔ)配對(duì)的反向互補(bǔ)序列中的種子序列，在鱖基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與miR-25 種子序列互補(bǔ)配對(duì)的靶基因序列。在數(shù)據(jù)庫(kù)中找到miR-25 種子序列的第2-8 位堿基能夠與節(jié)律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 的3’UTR 互補(bǔ)配對(duì)，見(jiàn)圖3、圖4。在TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)中搜索發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中與miR-25 有結(jié)合位點(diǎn)的靶基因有5 087 個(gè)，并且在斑馬魚中，節(jié)律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 同樣有一段與miR-25 互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列即靶點(diǎn)。由此推測(cè)在鱖和斑馬魚體內(nèi)，miR-25 調(diào)控Arntl2、Nr1d2b的表達(dá)具有保守性，在鱖體內(nèi)miR-25 可能通過(guò)對(duì)這2個(gè)核心生物鐘基因的靶向調(diào)控來(lái)參與鱖生物節(jié)律的調(diào)控。

圖3 miR-25 與Arntl2 結(jié)合靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.3 The prediction of target site on target gene Arntl2 of miR-25

圖4 miR-25 與Nr1d2b 結(jié)合靶位點(diǎn)預(yù)測(cè)Fig.4 The prediction of target site on target gene Nr1d2b of miR-25

3 討論

組織內(nèi)高表達(dá)的miRNA 往往發(fā)揮著重要的作用，本研究通過(guò)對(duì)miR-25 在鱖紅肌、白肌、心、肝、脾、腎、腸中的表達(dá)進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)其在這些組織中均有表達(dá)，并且在紅肌和心肌組織中呈高水平表達(dá)。Wang 等[18]研究表明，在斑馬魚中過(guò)表達(dá)的miR-25 可通過(guò)靶向FBXW7基因來(lái)促進(jìn)心肌細(xì)胞的增殖，然而Li 等[19]研究表明，miR-25 在正常小鼠中過(guò)表達(dá)可通過(guò)靶點(diǎn)改變導(dǎo)致心肌細(xì)胞纖維化和凋亡。miR-25 在鱖心肌組織中的高水平表達(dá)，筆者推測(cè)miR-25 可能參與調(diào)控鱖心肌組織的生長(zhǎng)、增殖或凋亡等生理過(guò)程，但其具體作用、功能及機(jī)制還需進(jìn)一步研究。miR-25 在不同物種的心肌組織中可能發(fā)揮著不同的作用，但其對(duì)心肌組織產(chǎn)生的影響不可忽視，這凸顯了miR-25 對(duì)治療心臟相關(guān)疾病進(jìn)一步研究的必要性。此外，在本研究中發(fā)現(xiàn)miR-25 在鱖紅肌組織中表達(dá)水平較高，表明其在鱖紅肌發(fā)育生長(zhǎng)過(guò)程中同樣發(fā)揮著非常重要的調(diào)控作用，但其目前關(guān)于miR-25 在鱖紅肌中的功能及作用機(jī)理還未明確，有待進(jìn)一步研究。

miRNA 的調(diào)控可以在胚胎發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮重要作用。有研究表明，miR-449b 在綿羊精子中高表達(dá)，且能顯著提高綿羊早期胚胎的發(fā)育率[20]。miR-430 能使斑馬魚早期胚胎發(fā)生期間的母體mRNA 去烯化和清除加速[21]。此外，在小鼠和人類卵母細(xì)胞中，miR-451 的下調(diào)會(huì)影響著床前胚胎的發(fā)生[22]。在鱖中發(fā)現(xiàn)，miR-21 在其胚胎2細(xì)胞時(shí)期的表達(dá)水平最高，表明其具有母源性，并在胚胎早期發(fā)揮抑制靶基因的功能[12]。本研究通過(guò)對(duì)miR-25 在鱖胚胎的不同發(fā)育時(shí)期進(jìn)行表達(dá)水平的檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)miR-25 同樣在鱖胚胎的2細(xì)胞期的表達(dá)水平最高，并且隨著發(fā)育的進(jìn)行，其表達(dá)水平不斷降低，說(shuō)明miR-25 具有母源性，這也表明了miR-25 在鱖胚胎中以母源性因子的形式發(fā)揮著重要的作用，但其具體的作用機(jī)制還未明確。

在生物的晝夜節(jié)律調(diào)控過(guò)程中，miRNAs 可與靶向生物鐘基因結(jié)合而發(fā)揮重要作用。Park等[11]研究表明在小鼠中，miR-25-3p 在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)控時(shí)鐘基因Per2振蕩，參與晝夜節(jié)律的調(diào)控，并且可與miR-24-3p 協(xié)同作用來(lái)影響Per2的振蕩。本研究通過(guò)堿基互補(bǔ)配對(duì)原則，在鱖基因組和轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)庫(kù)中尋找與miR-25 種子序列互補(bǔ)配對(duì)的靶基因序列，結(jié)果表明節(jié)律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 的3’UTR 有miR-25 的靶點(diǎn)。此外，筆者通過(guò)TargetScan 數(shù)據(jù)庫(kù)查找發(fā)現(xiàn)，在斑馬魚中節(jié)律基因Arntl2、Nr1d2bmRNA 同樣有一段與miR-25 互補(bǔ)配對(duì)的堿基序列，這更加說(shuō)明了在鱖中，miR-25 可能通過(guò)靶向結(jié)合Arntl2、Nr1d2b來(lái)參與其節(jié)律的調(diào)控，但miR-25 在鱖中的晝夜節(jié)律性以及調(diào)控機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。目前miR-25 在節(jié)律方面的研究極少，但從當(dāng)前研究可看出，miR-25 在節(jié)律調(diào)控方面同樣有著重要的意義，進(jìn)一步研究其在生物節(jié)律方面的作用可能對(duì)減少許多健康風(fēng)險(xiǎn)的增加有著積極的作用。

本研究利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR 的方法首次對(duì)miR-25 在鱖中的時(shí)空表達(dá)特性進(jìn)行檢測(cè)分析，并且對(duì)其靶向核心生物鐘基因進(jìn)行預(yù)測(cè)分析。結(jié)果表明，miR-25 在鱖不同組織以及不同發(fā)育階段中的表達(dá)具有差異性，在鱖心肌、紅肌以及胚胎發(fā)育早期可能具有重要的調(diào)控作用。通過(guò)靶基因預(yù)測(cè)分析，推測(cè)miR-25 可通過(guò)調(diào)控節(jié)律基因Arntl2、Nr1d2b的表達(dá)，從而參與鱖生長(zhǎng)發(fā)育等生理過(guò)程的調(diào)節(jié)。本研究通過(guò)對(duì)miR-25 在鱖中的時(shí)空表達(dá)特征以及靶向核心生物鐘基因進(jìn)行初步研究，為后續(xù)研究其生理功能以及調(diào)控晝夜節(jié)律從而預(yù)防相關(guān)疾病提供參考依據(jù)。