屠金晶，張亮，陳益女，董肖琦，徐曙光，湯耀東

支氣管擴(kuò)張癥典型的癥狀有慢性咳嗽、咳大量膿痰和反復(fù)咯血，可導(dǎo)致呼吸功能障礙及慢性肺源性心臟病[1]。在我國是一種非常普遍的慢性呼吸道疾病，但卻遠(yuǎn)不及支氣管哮喘和慢阻肺一樣受到重視。廣泛性支氣管擴(kuò)張可嚴(yán)重?fù)p害患者肺組織和功能、影響患者的生活質(zhì)量，造成巨大的社會經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，是當(dāng)前我國基層醫(yī)院面臨的嚴(yán)重挑戰(zhàn)。

銅綠假單胞菌（PA）是導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張癥患者急性或慢性感染的主要病原體之一[2]?，F(xiàn)有研究表明PA 感染與支氣管擴(kuò)張癥的嚴(yán)重程度及病情進(jìn)展密切相關(guān)。然而，針對支氣管擴(kuò)張癥患者合并PA 感染的治療研究非常有限。目前，多重耐藥和廣泛耐藥PA的檢出率呈逐年上升趨勢，給臨床治療帶來了嚴(yán)重威脅[3]。近年研究發(fā)現(xiàn)難治性PA 感染患者的校正死亡率高于碳青霉烯類耐藥PA[4]。本研究分析2022年寧波市醫(yī)療中心李惠利醫(yī)院分離的支氣管擴(kuò)張癥患者PA 感染的分子流行病學(xué)特征，以期為PA 感染患者提供合理的抗菌藥物使用依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 菌株來源 納入本院2022 年1—12 月臨床分離的38 株P(guān)A，排除同一患者重復(fù)菌株。質(zhì)控菌株為銅綠假單胞菌ATCC27853。

1.2 PA 的菌種鑒定 將上述臨床分離菌株接種于MHA 培養(yǎng)基，37 ℃過夜培養(yǎng)。挑取單菌落涂布于MSP 96 target polished steel BC 板的靶點上，涂布應(yīng)輕薄均勻。吸取1l 基質(zhì)溶液分別加至各個靶點，應(yīng)注意各個靶點溶液不要相連，室溫下自然晾干。將BC 板放入基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時間質(zhì)譜儀（MALDI-TOF MS）中，運行程序并記錄結(jié)果。

1.3 藥敏實驗 使用瓊脂稀釋法測定11 種抗菌藥物的最低抑菌濃度（MIC），包括哌拉西林/他唑巴坦、頭孢他啶、頭胞吡肟、氨曲南、亞胺培南、美羅培南、慶大霉素、阿米卡星、妥布霉素、環(huán)丙沙星和磷霉素。多黏菌素B 使用肉湯稀釋法測定MIC。折點解讀參考美國CLSI 標(biāo)準(zhǔn)[5]。當(dāng)頭孢他啶≥32 mg/L、氨曲南≥32 g/L、哌拉西林/他唑巴坦≥128/4 mg/L、碳青霉烯類（亞胺培南或美羅培南）≥8 mg/L 和環(huán)丙沙星≥2 mg/L 時定義為難治性PA[4]。

1.4 全基因組測序及生信分析 采用第二代測序技術(shù)的建庫測序，經(jīng)電泳檢測合格的DNA 樣品用Covaris 超聲波破碎儀隨機打斷成長度約為350 bp 的片段。處理完成后的DNA 片段，使用NEBNext?Ultra?DNA Library Prep Kit for Illumina（NEB，USA）試劑盒，經(jīng)末端修復(fù)、加A 尾、加測序接頭、純化、PCR 擴(kuò)增等步驟完成整個文庫制備。文庫構(gòu)建完成后，先使用Qubit 2.0 進(jìn)行初步定量，稀釋文庫至2 ng/l，隨后使用Agilent 2100 對文庫的插入片段進(jìn)行檢測，insert size 符合預(yù)期后，使用Q-PCR 方法對文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，最后進(jìn)行PE150的上機測序，數(shù)據(jù)量1G，實現(xiàn)平均測序深度100×以上。38 株菌使用Illumina Nova-seq 6000 平臺（諾禾致源生物信息科技有限公司，中國北京）進(jìn)行全基因組測序。耐藥基因和多位點序列分型（MLST）使用ResFinder v3.0 在線比對（http://www.genomicepidemiology.org）。

2 結(jié)果

2.1 納入患者基本信息 38 例中，男27 例，女11例；年齡為（69.0±14.0）歲。分別來源于ICU（13 株）、呼吸內(nèi)科（10 株）、神經(jīng)外科（10 株）、感染病科（2例）、肝膽胰外科（2 例）和胃腸外科（1 例）。

2.2 藥敏結(jié)果 38 株P(guān)A中對阿米卡星和妥布霉素敏感率為97.4%，所有菌株對多黏菌素B敏感，亞胺培南和美羅培南的耐藥率分別為84.2%和57.9%。38 株P(guān)A 中有17 株為難治性PA，見表1。

表1 12 種抗菌藥物的藥敏結(jié)果

2.3 MLST分型及耐藥基因分析 38 株P(guān)A中主要的ST 型為ST277（7/38，18.4%）、ST 1076（5/38，13.2%）和ST 3012（5/38、13.2%）（圖1）。所有ST1076、ST1623 和ST3012 菌株均為難治性PA。此外，所有分離菌株中均檢測到耐藥基因blaPAO、aph（3’）-IIb 和catB7。12 株（31.8%）攜帶aph（3’）-IIb基因的菌株仍對慶大霉素敏感。值得注意的是5 株ST 1076 均攜帶blaOXA-395和blaKPC-3，從而介導(dǎo)泛耐藥。

圖1 38 株銅綠假單胞菌的MLST 分型分析

3 討論

目前我國沒有支氣管擴(kuò)張患病率的流行病學(xué)詳細(xì)資料，但隨著胸部高分辨率CT等檢查手段大范圍開展，支氣管擴(kuò)張癥其實并非少見病。研究顯示，臨床診斷為慢性支氣管炎或慢性阻塞性肺病的患者中，15%～30%的患者可發(fā)現(xiàn)支氣管擴(kuò)張，重度慢性阻塞性肺病患者合并支氣管擴(kuò)張的甚至可達(dá)50%[5-6]。PA是支氣管擴(kuò)張癥中檢出率最高的致病菌檢出率為18.5%～73.5%,也是我國支氣管擴(kuò)張癥急性加重期檢出率最高的病原菌[7-8]?，F(xiàn)有研究認(rèn)為細(xì)菌定植、炎癥刺激和肺組織破壞是支氣管擴(kuò)張的重要發(fā)病機制[9-11]。多項研究顯示，慢性呼吸道感染可導(dǎo)致支氣管擴(kuò)張患者頻繁急性加重及生活質(zhì)量下降[12-14]，PA定植也是引起成人支氣管擴(kuò)張癥的重要危險因素。研究顯示，PA感染是支氣管擴(kuò)張患者急性加重的重要危險因素，根除PA 可以改善患者的預(yù)后[15-17]。

Shortridge 等[3]研究指出血流感染中難治性PA的感染率為2.3%。本研究中，有44.7%（17/38）的分離菌株為難治性PA，比文獻(xiàn)報道的高，可能和本研究所有分離菌株來自痰液有關(guān)。Shortridge 等[3]證實肺部感染患者（27.7%）中多重耐藥PA的分離率高于血流感染（23.7%），但慶幸的是97.4%的PA 對阿米卡星和妥布霉素敏感，且所有菌株對多黏菌素B 敏感，從而避免了無藥可選的困境。

支氣管擴(kuò)張患者的預(yù)后還跟其感染的PA 耐藥性和毒力機制有重要關(guān)聯(lián)。為了使初始抗菌藥物能覆蓋可能的病原菌，尤其是耐藥PA，臨床可能會增加應(yīng)用廣譜抗菌藥物或者聯(lián)合應(yīng)用抗菌藥物的頻率，導(dǎo)致多重耐藥菌（MDRO）的出現(xiàn)[18-19]。碳青霉烯類抗生素是治療PA感染的關(guān)鍵藥物，但由于此類藥物的不合理使用，導(dǎo)致近年臨床上出現(xiàn)越來越多的耐碳青霉烯銅綠假單胞菌（CRPA），對支氣管擴(kuò)張患者的治療提出重大挑戰(zhàn)。從全球來看，PA 對碳青霉烯類抗生素的耐藥情況差異較大。美國耐藥監(jiān)測表明，2005—2014 年P(guān)A 對碳青霉烯類抗生素的耐藥率平均為8.71%[20]；2004—2014 年拉丁美洲耐藥率也高達(dá)66%；歐洲地區(qū)的平均耐藥率則在14.5%以上；2010 年亞太地區(qū)PA 對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別是21.6%和27.7%[21]；我國耐藥監(jiān)測系統(tǒng)顯示，2015 年P(guān)A 對碳青霉烯類抗生素的平均耐藥率為22.4%，其中最低地區(qū)的耐藥率廣西壯族自治區(qū)為12.6%，而最高地區(qū)北京市的耐藥率32.7%。2013 年CHINET 細(xì)菌耐藥監(jiān)測表明PA 對美羅培南和亞胺培南的耐藥率分別為25.1%和27.1%。本文在相關(guān)支氣管擴(kuò)張患者中均檢測到了CRPA，突顯了本院支氣管擴(kuò)張患者已面臨CRPA 的威脅。

現(xiàn)有PA 的耐藥機制包括外排泵、生物膜形成、抗菌藥物滅活酶、靶突變和通過水平基因轉(zhuǎn)移獲得耐藥基因[8-9]。本研究中，所有分離株均攜帶blaPAO、aph（3’）-IIb 和catB7，這3 個耐藥基因也常見于碳青霉烯類耐藥銅綠假單胞菌[10]。aph（3’）-IIb 基因表達(dá)產(chǎn)物是一種與氨基糖苷類抗菌藥物有交叉反應(yīng)性的代謝酶[11]，然而12 株攜帶aph（3’）-IIb基因的菌株對慶大霉素敏感，提示可能存在其他調(diào)控機制介導(dǎo)氨基糖胺類耐藥的發(fā)生。前期有研究指出銅綠假單胞菌存在克隆傳播，特別是ST175、ST235 和ST111可介導(dǎo)多重耐藥流行，且患者預(yù)后更差[12]。本研究中有5 株ST1076 均攜帶blaOXA-395和blaKPC-3，且分布在ICU 和神經(jīng)外科。通常blaKPC-3基因常位于質(zhì)粒上，推測ST1076 型菌株可能更容易捕獲攜帶blaKPC-3基因的質(zhì)粒。

本研究仍有一定的局限性。首先樣本的數(shù)量有限，未進(jìn)一步針對難治性PA 進(jìn)行分層研究。其次未進(jìn)行菌株毒力相關(guān)研究。未來需要進(jìn)一步針對不同感染部位和耐藥機制的難治性PA 進(jìn)行深入研究。

綜上所述，本院支氣管擴(kuò)張癥患者合并PA感染呈散發(fā)流行，但難治性PA 的分離率較高，其中ST1076 需要引起臨床重視，加強監(jiān)測，并采取有效措施防止該類菌的感染及傳播。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突