江磊，倪寧，陳劍明

隨著全球老齡化的進(jìn)程，老年人骨質(zhì)疏松癥發(fā)病率及引發(fā)的骨折也逐漸增加[1]，因骨質(zhì)疏松而導(dǎo)致的骨折（如股骨骨折）臨床治療效果差，大多是采用人工關(guān)節(jié)置換[2]，并且醫(yī)療費(fèi)用較高[3]。骨質(zhì)疏松癥的患者還可以通過(guò)藥物治療（如合成代謝或者抗吸收），但是藥物全身效應(yīng)及不良反應(yīng)嚴(yán)重影響了治療效果[4]。骨折的愈合通過(guò)炎癥、修復(fù)及重塑的階段進(jìn)行[5]。調(diào)節(jié)炎癥可以對(duì)損傷后的愈合有較大的幫助，而骨質(zhì)疏松癥患者多出現(xiàn)隱匿性骨折，往往沒(méi)有明顯的感染而呈現(xiàn)低度慢性炎癥過(guò)程[6]。因此骨質(zhì)疏松癥患者引起的骨折通過(guò)適當(dāng)調(diào)節(jié)炎性反應(yīng)，具有較好的治療效果[7]。

骨老齡化是骨再生不平衡的另一種特征，表現(xiàn)為骨形成減少并出現(xiàn)骨吸收增加，從而使骨折后骨愈合受損。大量數(shù)據(jù)表明，骨折的愈合驅(qū)動(dòng)在于骨骼干細(xì)胞（SSC），SSC具有自我更新、促進(jìn)骨關(guān)節(jié)炎及骨折愈合等能力。近期研究報(bào)道結(jié)果發(fā)現(xiàn)衰老能影響干細(xì)胞功能[8]。然而，長(zhǎng)期以來(lái)，人們只能夠在培養(yǎng)基中培養(yǎng)和分離出一種被認(rèn)為是SSC 的細(xì)胞群，這些細(xì)胞由多種類(lèi)型的干細(xì)胞組成，并非最原始的SSC。后來(lái)，通過(guò)譜系追蹤和克隆等研究方法，科學(xué)家發(fā)現(xiàn)了支持小鼠SSC 存在的證據(jù)[9]。這為研究開(kāi)辟了新的途徑，包括老齡化骨折后骨骼干細(xì)胞（SSC）激活的影響。

1 炎癥/老齡化

炎癥反應(yīng)是骨骼損傷后啟動(dòng)骨折愈合的首要過(guò)程。損傷后急性炎癥細(xì)胞如（中性粒細(xì)胞）會(huì)對(duì)骨折處血腫初步形成做出反應(yīng)。急性炎癥反應(yīng)中的巨噬細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子和炎癥介質(zhì)會(huì)繼發(fā)引起SSC及祖細(xì)胞對(duì)骨折部位進(jìn)行修復(fù)[10-11]。除損傷部位產(chǎn)生急性炎癥外，炎癥的消退對(duì)骨折的愈合也至關(guān)重要。由于衰老組織的特征是持續(xù)性低度慢性炎癥狀態(tài)[12]，因此衰老引起的慢性炎癥可能對(duì)老年人骨折愈合的適當(dāng)炎癥介質(zhì)啟動(dòng)有一定影響。最新研究表明，急性炎癥反應(yīng)的適當(dāng)啟動(dòng)及短暫炎癥消退對(duì)于刺激骨折愈合是至關(guān)重要的[13]。急性炎癥期，典型的炎癥介質(zhì)M1 型巨噬細(xì)胞被激活，炎癥消退包括巨噬細(xì)胞復(fù)極是激活炎癥介質(zhì)M2 型巨噬細(xì)胞的表現(xiàn)，并與組織再生密切相關(guān)[14]。在老齡化中骨折引起的慢性炎癥會(huì)導(dǎo)致巨噬細(xì)胞從M1 型到M2 型復(fù)極失敗，使骨細(xì)胞活性增加，而成骨細(xì)胞形成減少[15]，導(dǎo)致故愈合障礙。此外在老齡化中，通過(guò)腫瘤壞死因子（TNF）- 等介質(zhì)持續(xù)存在的無(wú)對(duì)抗性炎癥刺激，能促進(jìn)破骨細(xì)胞生成和骨吸收[16]。

近期有研究顯示，小鼠模型支持衰老相關(guān)引起慢性炎癥損害骨骼再生的論證（封三彩圖3），利用熒光激活細(xì)胞分類(lèi)（FACS）分析在年輕小鼠和老年小鼠股骨頸部外周血炎癥反應(yīng)對(duì)比，發(fā)現(xiàn)老年小鼠組中損傷前基線水平在促進(jìn)炎癥、經(jīng)典的激活單核細(xì)胞百分比支持慢性炎癥狀態(tài)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[17]。針對(duì)損傷的反應(yīng)，老年小鼠比年輕小鼠表現(xiàn)出更高比例的循環(huán)的、典型激活的單核細(xì)胞。相比之下，老年小鼠沒(méi)有表現(xiàn)出隨后非經(jīng)典單核細(xì)胞的激活的增加。使用聚合酶鏈反應(yīng)（PCR）對(duì)老年小鼠和年輕小鼠損傷后2 周的骨折骨痂組織進(jìn)行基因表達(dá)分析，以評(píng)估衰老過(guò)程中骨折的不同轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。在年輕的骨折骨痂標(biāo)本中，炎癥基因表達(dá)下調(diào)，而在老年小鼠的標(biāo)本中，則保持上調(diào)，且老年小鼠幾種Toll樣受體（TLR）上調(diào)[18]。MyD88 是一種銜接蛋白，它介導(dǎo)TLR 信號(hào)分泌炎性細(xì)胞因子和招募免疫細(xì)胞。而MyD88 活性在老齡小鼠和老年人骨折患者中均增強(qiáng)。通過(guò)小分子抑制劑在小鼠骨折部位的膠原海綿上抑制MyD88 二聚和活化，通過(guò)增加新骨形成和骨痂形成促進(jìn)骨折愈合。這些數(shù)據(jù)表明，分子療法對(duì)骨折部位炎癥反應(yīng)的調(diào)節(jié)可能具有促進(jìn)老年人骨折愈合的轉(zhuǎn)化潛力[19]。

免疫細(xì)胞和活化的干細(xì)胞之間的作用可對(duì)骨折部位的愈合具有極其重要的作用，而在衰老時(shí)這種相互之間的關(guān)系可能被中斷。在組織中，細(xì)胞因子環(huán)境促進(jìn)細(xì)胞衰老是慢性炎癥的特征，稱(chēng)之為衰老相關(guān)分泌表型（SASP）[20]。最新研究發(fā)現(xiàn)小鼠的骨骼中存在SASP，這是導(dǎo)致常駐干細(xì)胞衰老和功能受損的因素之一[21]。TNF- 、白介素（IL）-1 和活化B 細(xì)胞p65（Rela）的核因子- 輕鏈增強(qiáng)子是目前所知道的導(dǎo)致這種效應(yīng)的細(xì)胞因子。NF-KappaB 是一種炎癥介質(zhì)，它通過(guò)信號(hào)傳導(dǎo)促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的分泌。該介質(zhì)在衰老小鼠的細(xì)胞中顯示激活狀態(tài)，隨后實(shí)驗(yàn)繼續(xù)表明小鼠骨骼干和祖細(xì)胞中NF-KappaB活性的病理激活導(dǎo)致細(xì)胞衰老和成骨干細(xì)胞分化受損[22]。相反，通過(guò)全身抗炎或使用選擇性小分子拮抗劑，通過(guò)藥物抑制NF-KappaB，可部分逆轉(zhuǎn)受損的成骨表型[23]。在骨折愈合過(guò)程中，干細(xì)胞也與巨噬細(xì)胞招募增加有關(guān)。

為了更好的利用干細(xì)胞調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的能力，已經(jīng)開(kāi)發(fā)了幾種基于細(xì)胞和小分子的策略。在存在炎癥刺激的情況下首先對(duì)干細(xì)胞進(jìn)行預(yù)處理（“啟動(dòng)/激活”）[24]。隨后，激活的干細(xì)胞促進(jìn)急性炎癥反應(yīng)的消退并開(kāi)始愈合[25]。同樣，小分子策略也可以促進(jìn)從急性炎癥反應(yīng)到促進(jìn)愈合的轉(zhuǎn)變。

2 SSC

SSC 被認(rèn)定為：能夠自我更新；經(jīng)歷向骨、軟骨和基質(zhì)細(xì)胞群的多普系分化[10]；根據(jù)細(xì)胞表面標(biāo)志物可前瞻性分離；排除脂肪等非骨骼化[25]。干細(xì)胞作為一種細(xì)胞治療手段，在再生受損骨骼組織中具有很好的前景，但是由于干細(xì)胞分離困難的局限性，導(dǎo)致利用干細(xì)胞對(duì)骨組織再生的想法尚未實(shí)現(xiàn)。圖1 顯示骨折的SSC在老齡化慢性炎癥對(duì)骨折的愈合的影響。在衰老的情況下M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)SSC 的初始炎癥反應(yīng)和信號(hào)傳導(dǎo)異常，包括NF-kappaB 信號(hào)傳導(dǎo)增加。促炎環(huán)境還表現(xiàn)為促進(jìn)炎癥消解的細(xì)胞因子的生成減少，同時(shí)M1 型巨噬細(xì)胞對(duì)M2 型巨噬細(xì)胞的復(fù)極性受損。延長(zhǎng)炎癥信號(hào)導(dǎo)致SSC 的成骨分化受損，SSC 衰老加劇（抗衰老信號(hào)減少，如SIRT1）。同時(shí)，延長(zhǎng)炎癥信號(hào)傳導(dǎo)（如TNF- ）會(huì)導(dǎo)致破骨細(xì)胞活化和骨吸收增加。

通過(guò)使用細(xì)胞表面標(biāo)志物差異的干細(xì)胞群體經(jīng)過(guò)FACS 純化的方法，成功實(shí)現(xiàn)了小鼠骨骼干細(xì)胞（MSSC）和人類(lèi)骨骼干細(xì)胞（HSSC）的區(qū)分，骨骼的骨、軟骨和基質(zhì)細(xì)胞譜系是由自我更新的多能干細(xì)胞（SSCs）生成的。盡管不依賴于精確的干細(xì)胞分離方法會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞群的可變性和異質(zhì)性，但通過(guò)FACS純化，能夠前瞻性地分離SSC，并從干細(xì)胞的角度研究老齡化對(duì)骨折愈合的影響。

在小鼠發(fā)生骨折過(guò)程中，衰老會(huì)導(dǎo)致mSSC 功能受損。對(duì)老年小鼠與年輕小鼠骨折部位SSCs 的分析表明，它們的自我更新能力和骨軟骨生成分化能力均降低。此外，來(lái)自衰老小鼠SSC 的骨髓基質(zhì)細(xì)胞對(duì)造血功能有負(fù)面影響。在老年小鼠中，觀察到與年輕小鼠相似的循環(huán)炎癥細(xì)胞現(xiàn)象，老齡化SSC 出現(xiàn)年輕小鼠類(lèi)似功能缺陷，而衰老炎癥細(xì)胞同樣使年輕小鼠SSCs 產(chǎn)生功能性衰老[26]。這些數(shù)據(jù)表明，循環(huán)炎癥反應(yīng)中與年齡相關(guān)的變化可以影響SSC 功能。

通過(guò)全轉(zhuǎn)錄組測(cè)序顯示，SSC存在不同的亞群，這些亞群基于富集的表達(dá)基因，這可能是對(duì)其他相關(guān)的啟動(dòng)。在調(diào)查老齡化動(dòng)物SSC 轉(zhuǎn)錄多樣性中發(fā)現(xiàn)多樣性明顯減少，且顯著偏離成骨潛能，而前基質(zhì)轉(zhuǎn)錄活性增加[27]。此外，老齡化的mSSC 在造血譜系中明顯趨于破骨細(xì)胞發(fā)生，從而進(jìn)一步提供衰老導(dǎo)致骨吸收的機(jī)制。在人類(lèi)研究中，對(duì)年輕人和老年人的骨折中獲取hSSCs 進(jìn)行比較[28]，發(fā)現(xiàn)年輕人與老年人SSC 有較大差異，而老年人和年輕人骨折來(lái)源的SSC 的克隆原性/干細(xì)胞自我更新特性無(wú)明顯差異，這與最近在小鼠身上進(jìn)行的研究相反，該研究顯示SCC 隨著年齡增長(zhǎng)減少[29]。一種假設(shè)是，老齡化SCC 的終末分化受損從而導(dǎo)致退出干細(xì)胞池，從而使得老年人干細(xì)胞減少。但是，相比年輕SSC，老年SSC 在成骨和成軟骨分化能力方面表現(xiàn)出明顯缺陷（封三彩圖4）。此外，使用微陣列進(jìn)行的整體基因表達(dá)分析表明，老年人骨折導(dǎo)致SSC 中的成骨基因下調(diào)。轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析還顯示，在老年SSC中，細(xì)胞衰老途徑上調(diào)，抗衰老因子下調(diào)，如組蛋白脫乙酰酶Sirtui1。有趣的是，激活Sirtuin 信號(hào)的小分子可以部分恢復(fù)老年性hSSC 的成骨分化表型。因此，在骨折修復(fù)過(guò)程中，老齡化不僅與干細(xì)胞性成骨缺陷有關(guān)，而且還表明細(xì)胞抗衰老信號(hào)減弱。這些研究表明，分子療法是失調(diào)的衰老細(xì)胞途徑中治療骨折疏松引起骨折愈合障礙的潛在靶點(diǎn)。

3 總結(jié)與展望

老齡化是引起骨折患者發(fā)病率增長(zhǎng)的主要來(lái)源之一，其骨折愈合障礙風(fēng)險(xiǎn)也成比例增高，而炎癥反應(yīng)和SSC 在細(xì)胞及分子水平上對(duì)骨折愈合產(chǎn)生了巨大影響。這些大量的研究結(jié)果表明在老齡化及骨質(zhì)疏松背景下通過(guò)干預(yù)骨折愈合的治療策略上具有潛在的發(fā)展前景。

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