徐磊，張濤，潘海滔，孫想妹，倪蘊(yùn)勤，單嘉偉，金欣

妊娠期糖尿?。℅DM）是一種常見妊娠并發(fā)癥，在妊娠期間發(fā)現(xiàn)糖耐量異常，并在分娩后恢復(fù)[1]。GDM 對孕婦有長期影響，有研究發(fā)現(xiàn)具有GDM 史的婦女患2 型糖尿病的風(fēng)險是正常妊娠婦女的10倍[2]。GDM 孕婦子代也受到長期的影響，有研究表明GDM孕婦子代出現(xiàn)糖代謝紊亂的風(fēng)險顯著上升[3]。健康和疾病的發(fā)育起源（DOHaD）學(xué)說認(rèn)為，在生命發(fā)育早期，胎兒暴露于不良的宮內(nèi)環(huán)境可能增加胎兒在成年后患糖代謝紊亂和心血管疾病等慢性疾病的風(fēng)險[4]。外泌體是一種細(xì)胞外囊泡（EVs），含有許多來源于細(xì)胞的成分，包括蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、DNA、mRNA 和piRNA 等，通過細(xì)胞分泌與攝入?yún)⑴c細(xì)胞間物質(zhì)和信息傳遞，調(diào)節(jié)細(xì)胞功能[5-6]。外泌體存在于多種體液中，如血液、尿液、羊水、唾液、肺表面活性物質(zhì)和母乳[6]。在妊娠期間，外泌體可以在母體和胎兒之間運(yùn)輸，來自母體的外泌體可以對胎兒組織產(chǎn)生作用[7]。PIWI 蛋白相互作用RNA（piRNA）是一類非編碼小RNA，其長度在25 ～31 nt，具有調(diào)節(jié)基因表達(dá)的作用[8]。piRNA 由piRNA 簇經(jīng)RNA 聚合酶II 轉(zhuǎn)錄為長鏈非編碼轉(zhuǎn)錄本，轉(zhuǎn)錄本從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)到細(xì)胞質(zhì)后，定位到靠近細(xì)胞核的RNP 顆粒并被加工為成熟piRNA[9]。目前研究認(rèn)為piRNA 的失調(diào)與多種人類疾病有關(guān)，包括糖尿病、不孕不育癥、心血管異常、癌癥和神經(jīng)退行性疾病等[10-11]。胎盤中的piRNA可能調(diào)控絨毛侵襲，并與胎盤特異基因的表達(dá)有關(guān)。此外，其還與miRNA 樣基因表達(dá)沉默有關(guān)[12]。本研究擬構(gòu)建正常妊娠和GDM 孕婦子代臍血外泌體piRNA 表達(dá)譜，探索piRNA 在GDM 孕婦子代糖代謝紊亂中的作用和臨床意義，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 GDM孕婦及正常妊娠孕婦的新生兒臍帶血標(biāo)本各5 例，取自2020 年1 月至2021 年1 月紹興市婦幼保健院婦產(chǎn)科手術(shù)標(biāo)本。GDM 診斷標(biāo)準(zhǔn)：在妊娠24 ～28 周進(jìn)行糖耐量試驗(yàn)（OGTT），OGTT前禁食8 ～12 h，其空腹血糖≥5.1 mmol/L、OGTT 1 h 血糖≥10.0 mmol/L 或OGTT 2 h 血糖≥8.5 mmol/L 即診斷為GDM。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）雙胎妊娠、早產(chǎn)和資料不完整；（2）孕前糖尿病合并妊娠（PGDM）；（3）慢性高血壓，甲狀腺功能異常，肝、腎功能疾病，系統(tǒng)性紅斑狼瘡，多囊卵巢綜合征（PCOS）等；（4）長期使用影響糖代謝的藥物（如類固醇激素）。本研究經(jīng)紹興市婦幼保健院醫(yī)學(xué)倫理委員會審批同意，研究對象均已簽署知情同意書。

1.2 外泌體piRNA 測序和序列分析 對從臍血血漿中分離的外泌體小RNA 使用Illumina TruSeq R NA Sample Preparation Kit 試劑盒構(gòu)建測序文庫，使用Illumina HiSeq X Ten 平臺進(jìn)行測序，獲得150 bp的雙端數(shù)據(jù)（測序深度為30X）。使用CASAVA 工具（v1.8 Illumina，San Diego，CA，USA）獲取“Fastq.File”。在數(shù)據(jù)分析的過程中，在沒有比對到miRBase，且沒有比對到GtRNAdb的序列中挑選長度范圍在24 ～33 bp 的序列，比對到piRNA 簇（來源于piRNA群集數(shù)據(jù)庫）中，得到潛在的piRNA。從NCBI中獲取已知的piRNA 數(shù)據(jù)，包括ID 號以及序列信息，對分析得到的潛在的piRNA 進(jìn)行注釋，得到已知piRNA 簇來源的piRNA。隨后進(jìn)行數(shù)據(jù)歸一化處理并篩選高置信度的piRNA，最終得到GDM 組和對照組差異表達(dá)的piRNA，并對差異表達(dá)的piRNA 進(jìn)行整體層次聚類分析。利用RNAhybrid 和miRanda 工具預(yù)測潛在的piRNA 靶標(biāo)。使用DAVID 6.8 工具（https://david.ncifcrf.gov） 進(jìn)行KEGG 通路和GO 分析。

2 結(jié)果

2.1 GDM組和對照組臍血外泌體中piRNA的差異表達(dá)分析 基于序列相似性，共鑒定到114 個已知piRNA。原始測序數(shù)據(jù)可在NCBI 的SRA 數(shù)據(jù)庫中獲得：PRJNA820443。以∣log2FC∣＞1 且P ＜0.05為篩選條件，在GDM 組和對照組之間存在顯著差異表達(dá)的piRNA 有7 個，見圖1；其中pir-30625 和pir-36249 表達(dá)顯著上調(diào)，pir-32512、pir-33437、pir-34789、pir-35549 和pir-61648 表達(dá)顯著下調(diào)。兩組樣本差異表達(dá)piRNA 整體層次聚類圖見圖2。

圖1 GDM 組和對照組間差異表達(dá)的piRNA 火山圖

圖2 GDM 組和對照組臍血外泌體差異表達(dá)的piRNA 熱圖

2.2 piRNA 的靶基因預(yù)測、GO 分析和KEGG 富集分析 預(yù)測的靶基因涉及到多個生物學(xué)過程，其中大部分富集在轉(zhuǎn)錄調(diào)控、神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育和子宮內(nèi)的胚胎發(fā)育，見圖3a；在分子功能領(lǐng)域，靶基因多數(shù)與特定序列DNA 結(jié)合有關(guān)，見圖3b；另外，靶基因與許多細(xì)胞成分有關(guān)，見圖3c ～d。

圖3 GDM 組差異表達(dá)piRNA 的靶基因進(jìn)行GO 分析

后續(xù)的通路富集分析提示幾個主要涉及的信號通路，如胰島素信號通路、Hippo信號通路、mTOR信號通路、FoxO 信號通路和Wnt 信號通路，見圖4。

圖4 GDM 組差異表達(dá)piRNA 的靶基因進(jìn)行KEGG 分析

3 討論

GDM 是一種常見的妊娠相關(guān)疾病，患GDM 的孕婦及其子代出現(xiàn)糖代謝相關(guān)疾病的風(fēng)險相對較高[13]。有研究表明GDM 孕婦子代在青少年時期和成年時

期患2 型糖尿病的風(fēng)險顯著升高[3]。GDM 孕婦高糖環(huán)境引發(fā)子代發(fā)生代謝紊亂的機(jī)制尚未完全闡明。

本研究發(fā)現(xiàn)臍血外泌體中存在114 個已知的piRNA。對外泌體piRNA 序列的分析表明，與對照組相比，有7 個piRNA 在GDM 婦女子代臍血外泌體中的表達(dá)存在差異，其中pir-30625 和pir-36249 表達(dá)顯著上調(diào)，pir-32512、pir-33437、pir-34789、pir-35549 和pir-61648 表達(dá)顯著下調(diào)。進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，這7 個差異表達(dá)的piRNA靶向4693 個DEG。通過GO分析和KEGG通路分析發(fā)現(xiàn)其在胰島素信號通路、Hippo 信號通路、TGF- 信號通路、mTOR 信號通路、FoxO 信號通路和Wnt 信號通路富集。這些信號通路的失調(diào)，可能對子代胰腺發(fā)育、細(xì)胞數(shù)量和功能產(chǎn)生不利影響，導(dǎo)致子代糖代謝紊亂。

Hippo 信號通路在產(chǎn)前早期發(fā)育階段調(diào)控人和小鼠胰腺發(fā)育和細(xì)胞類型特化[14]。Hippo 信號通路相關(guān)蛋白包括TAZ、MST 等。在高糖條件下TAZ 被激活，其通過與PDX1 的協(xié)同作用促進(jìn)胰島素的生成，從而調(diào)節(jié)葡萄糖穩(wěn)態(tài)。然而，當(dāng)TAZ缺乏時PDX1的DNA結(jié)合能力和轉(zhuǎn)錄活性降低，從而減少胰島素的生成，破壞了葡萄糖穩(wěn)態(tài)。此外，體外實(shí)驗(yàn)表明TAZ缺失損害了間充質(zhì)干細(xì)胞向胰島素分泌細(xì)胞的分化能力；TAZ 敲除小鼠其體質(zhì)量隨著年齡的增長而異常增加，并加劇其受高脂飲食誘導(dǎo)的葡萄糖不耐受和胰島素抵抗[15]。MST1 是胰腺細(xì)胞凋亡的調(diào)節(jié)因子，在糖尿病患者中MST1 被強(qiáng)激活，與細(xì)胞凋亡相關(guān)；MST1 在Thr1 處直接磷酸化PDX1，導(dǎo)致其泛素化、降解和胰島素分泌受損[16]。Smad3 是TGF-信號通路相關(guān)蛋白，在糖尿病小鼠模型和Min6 細(xì)胞系中，Smad3 的缺失保留了胰島中細(xì)胞發(fā)育介質(zhì)Pax6的表達(dá)，從而提高了細(xì)胞的增殖能力和功能[17]。mTORC1 是mTOR 信號通路相關(guān)蛋白，在空腹血糖受損患者中胰島mTORC1 活性顯著升高，在糖尿病前期小鼠模型中mTORC1 活性較非糖尿病小鼠顯著增加[18]。在動物實(shí)驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)細(xì)胞特異性mTORC1缺失引起了其增殖、自噬、凋亡和胰島素分泌缺陷，從而導(dǎo)致糖尿病和細(xì)胞衰竭。進(jìn)一步的研究表明mTORC1 通過2 個通路對細(xì)胞產(chǎn)生調(diào)控作用，其一，通過mTORC1/S6K 通路調(diào)控細(xì)胞凋亡和自噬；其二，通過mTORC1/4E-BP2-eIF4E 通路調(diào)控細(xì)胞增殖的機(jī)制[19]。MAPK 的不恰當(dāng)激活被認(rèn)為在后天的胰島素抵抗發(fā)生中發(fā)揮重要作用[20]，Map3k12 是MAPK 信號通路相關(guān)蛋白，其與Jnk3 結(jié)合并激活Jnk3，刺激控制出生后細(xì)胞復(fù)制的兩個重要細(xì)胞周期蛋白Ccnd1 和Ccnd2 的表達(dá)，Map3k12 激活Jnk3信號可能是出生后發(fā)育和體質(zhì)量增加過程中調(diào)節(jié)胰島細(xì)胞質(zhì)量的關(guān)鍵機(jī)制[21]。去分化是導(dǎo)致細(xì)胞衰竭和轉(zhuǎn)化為非內(nèi)分泌細(xì)胞的主要原因之一，F(xiàn)oxO是維持細(xì)胞分化的必要條件；FoxO1 在胰島素抵抗和發(fā)育中的胎兒胰腺分化過程中影響胰島細(xì)胞[22]。胎兒胰腺細(xì)胞的生長和分化，以及成年人胰腺細(xì)胞的增殖依賴于-catenin 的功能[23]。這些相關(guān)信號通路的變化可能對子代糖代謝產(chǎn)生影響。

綜上所述，本研究首次分析了正常妊娠和GDM孕婦子代臍血外泌體中的差異表達(dá)piRNA，并通過生物信息學(xué)對差異表達(dá)的piRNA 及其靶基因的潛在功能進(jìn)行預(yù)測分析。研究表明，piRNA 可能是潛在的子代糖代謝紊亂生物學(xué)標(biāo)志物，并將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量進(jìn)行驗(yàn)證。同時，臍血外泌體piRNA 的差異表達(dá)可能影響GDM 孕婦子代糖代謝，但差異表達(dá)piRNA在GDM孕婦子代糖代謝紊亂中的具體作用和機(jī)制仍需深入研究。

利益沖突所有作者聲明無利益沖突

作者貢獻(xiàn)聲明徐磊：論文撰寫、數(shù)據(jù)整理、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析；倪蘊(yùn)勤：實(shí)驗(yàn)操作；單嘉偉：實(shí)驗(yàn)操作；潘海滔、孫想妹：研究指導(dǎo)、論文修改；張濤：研究指導(dǎo)、論文修改、經(jīng)費(fèi)支持；金欣：研究指導(dǎo)、論文修改