南莎,柳隨義,冉永紅,趙雅貞,郝玉徽

（陸軍軍醫(yī)大學軍事預防醫(yī)學系復合傷研究所，重慶 400038）

放創(chuàng)復合傷（combined radiation-wound injury，CRWI）是核事故以及核戰(zhàn)爭時所發(fā)生的主要傷類之一，與單純放射損傷相比，其發(fā)生率和病死率大大增加［1］。傷口愈合是一個復雜、相互協(xié)調(diào)的過程，可分為3個相互區(qū)分而又聯(lián)系的階段：炎癥反應期、增殖修復期以及組織重塑期[2-4]。受電離輻射的影響，CRWI傷口部位的炎癥細胞和修復細胞數(shù)量減少、功能受損，傷口難以愈合，且機制復雜，需要我們不斷探索。

TSP-1是一種多功能胞外基質(zhì)蛋白，參與炎癥調(diào)控、血管生成等病理生理過程，在傷口修復過程中發(fā)揮重要作用［5］。相關(guān)研究表明，與野生型（WT）小鼠相比，缺乏TSP-1會導致小鼠皮膚熱損傷傷口的愈合速度減緩[6]。也有研究發(fā)現(xiàn)，用TSP-1預處理人角膜內(nèi)皮細胞后，其分泌的外泌體可以有效促進角膜傷口愈合[7]，即TSP-1能夠促進傷口愈合。然而，一項應用二甲雙胍治療二型糖尿病傷口的研究發(fā)現(xiàn)，二甲雙胍可以通過降低傷口部位TSP-1的表達水平，加速二型糖尿病傷口愈合[8]，說明TSP-1對傷口愈合也有不利影響。以上研究結(jié)果表明TSP-1在不同的傷口模型中發(fā)揮的作用不同。

目前，TSP-1在CRWI愈合中的作用尚不明確。因此，本研究以TSP-1基因全敲除小鼠為主要研究對象，探討TSP-1在CRWI傷口愈合過程中的作用，以期為CRWI的救治提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

RIPA裂解液、BCA蛋白濃度測定試劑盒、DAB顯色液、DAPI、抗熒光淬滅封片劑、山羊抗兔IgG、小鼠基因型快速鑒定試劑盒均購自上海碧云天生物技術(shù)有限公司；RNAiso試劑、PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser、SYBRII熒光定量PCR試劑均購自大連寶生物工程有限公司；檸檬酸修復液、封閉用山羊血清、SV超敏反應兩步試劑盒均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；兔抗多克隆F4/80、CD31、β-actin均購自武漢三鷹生物技術(shù)有限公司；NF-κB抗體購自美國Biolegend公司；α-SMA抗體購自美國Cell Signaling Technology公司；RT-qPCR引物由上海生工生物工程有限公司合成；熒光酶標儀Bio-Ple 200 System、Realtime PCR儀、Chemidoc×RS成像系統(tǒng)均購自美國Bio-Rad公司。

1.2 實驗動物

本研究共使用C57BL/6J雄性小鼠（6周齡）30只，TSP-1KO組及WT組各15只。TSP-1KO小鼠來源于美國賽業(yè)生物科技有限公司，WT小鼠來源于陸軍軍醫(yī)大學實驗動物中心，動物使用許可證號：SYXK(渝)20170002。所有小鼠飼養(yǎng)在12 h明暗循環(huán)的實驗環(huán)境中，濕度維持在50%～60%，溫度保持在（24±0.5）℃。

1.3 建立小鼠皮膚CRWI模型

建立小鼠皮膚CRWI模型［9-10］。首先對小鼠進行5 Gy60Coγ全身輻照，劑量率為0.5～0.6 Gy/min。輻照后1 h內(nèi)，在小鼠背部皮膚制造傷口：用1%戊巴比妥鈉（0.15 mL）腹腔注射麻醉、備皮、局部消毒后，在每只小鼠背部胸段脊柱附近用打孔器切出圓形傷口，傷口直徑1 cm，深達皮下組織全層。手術(shù)后將小鼠放回籠子恢復，在傷口形成后的第0、1、3、7、10、14天觀察2組小鼠傷口愈合情況并拍照記錄。使用Image J對傷口面積進行定量分析，傷口閉合率=（A0-At）/A0×100%，A0表示第0天傷口部位的面積，At代表傷口形成后不同時間點傷口部位的面積。在傷口形成后第7天取小鼠傷口部位的皮膚組織，其中一半用4%中性甲醛固定，用于后續(xù)傷口組織HE染色、免疫組化染色及免疫熒光染色；另一半用液氮凍存，用于進一步的Western blot蛋白檢測及組織RNA表達檢測。

1.4 HE染色

取新鮮的傷口組織制作3.5 μm的石蠟組織切片，對石蠟切片進行蘇木精-伊紅（HE）染色，用于觀察傷口的形態(tài)。

使用SV超敏反應兩步試劑盒進行免疫組化染色：將石蠟切片脫蠟后，用檸檬酸鈉進行抗原修復，然后使用過氧化氫浸泡20 min。使用山羊血清封閉1 h后，用一抗F4/80（1：200）、CD31（1：200）于4 ℃孵育過夜。二抗孵育20 min，使用DAB對組織中目標蛋白進行顯色，然后進行復染。目標蛋白的表達使用Image J進行定量分析。

1.5 免疫熒光染色

將石蠟切片脫蠟后，用檸檬酸鈉進行抗原修復。然后使用山羊血清封閉1 h，加入一抗α-SMA（1：100），于4 ℃孵育過夜。熒光二抗避光孵育1 h后，使用DAPI對細胞核進行染色。最后使用熒光顯微鏡進行拍照觀察，并用Image J進行定量分析。

1.6 RT-qPCR

使用TRIzol?試劑提取傷口組織中總RNA，對各樣本RNA濃度進行測定并配平，使用PrimeScript? RT預混液將RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。最后使用SYBR預混料Ex Taq?進行RT-qPCR。使用的引物序列見表1。

表1 用于RT-qPCR反應的引物序列

1.7 Western blot檢測蛋白表達

在冰上使用RIPA裂解液裂解傷口組織獲得總蛋白。使用BCA蛋白濃度測定試劑盒測定各樣本組織蛋白濃度。調(diào)整上樣體積使每組上樣質(zhì)量為20 μg，加載到8%SDS-PAGE預制膠上進行電泳，而后使用0.45 μm PVDF膜進行電轉(zhuǎn)。使用5%脫脂奶粉封閉2 h，孵育一抗NF-κB（1：1 000）和β-actin（1：10 000）于4 °C冰箱過夜。室溫孵育二抗（1：5 000）1 h。最后進行顯影，并使用Image J進行定量分析。

1.8 敲除小鼠基因型鑒定

用消毒的剪刀剪取小鼠鼠尾0.5 cm備用。按照DNA Extraction Solution：Enzyme Mix=96：4的比例配置消化液，將配好的消化液加入離心管，每管100 μL。金屬浴55 ℃，15 min；95 ℃，5 min。消化完成后，向上述各樣品中加入100 μL的終止液，終止消化。而后進行PCR反應，PCR反應體系見表2。最后進行瓊脂糖凝膠電泳（130 V，30 min），結(jié)果使用Chemidoc×RS成像系統(tǒng)檢測。

表2 用于PCR的反應體系

1.9 統(tǒng)計學分析

采用SPSS 26.0和GraphPad Prism 8進行統(tǒng)計學分析。連續(xù)性數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(x-±s)表示，兩個獨立樣本組之間的比較采用t檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 TSP-1基因敲除小鼠鑒定

本課題組成功引進并繁育了TSP-1基因全敲除小鼠。對繁育小鼠的基因型進行鑒定，TSP-1-/-小鼠基因組PCR產(chǎn)物電泳圖像只具有660 bp單一條帶，TSP-1+/-小鼠的電泳圖像具有660 bp和823 bp兩條條帶，TSP-1+/+小鼠的電泳圖像只具有823 bp單一條帶，見圖1。隨后，對敲除小鼠的出生、生長和繁殖情況進行觀察記錄，發(fā)現(xiàn)TSP-1KO小鼠能正常生長、繁育。

圖1 TSP-1KO小鼠基因型鑒定PCR電泳圖

2.2 敲除TSP-1小鼠皮膚CRWI的傷口愈合情況

根據(jù)傷口愈合的結(jié)果，從建模第3天開始TSP-1KO小鼠的皮膚CRWI傷口表現(xiàn)出顯著的愈合延遲（P＜0.05），見圖2a、b。在小鼠皮膚CRWI建模后的第7天，取2組傷口組織進行HE染色，結(jié)果表明，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠具有較短的再上皮化距離（P＜0.05）；同時，TSP-1KO小鼠皮膚CRWI的傷口寬度和傷口面積均明顯較大（P＜0.05），見圖2c、d。以上結(jié)果表明，敲除TSP-1后，小鼠皮膚CRWI再上皮化速率減慢，傷口愈合延遲。

圖2 WT及TSP-1KO小鼠皮膚CRWI的傷口愈合情況

2.3 敲除TSP-1小鼠皮膚CRWI傷口部位的炎癥反應情況

小鼠皮膚CRWI建模后的第7天，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠傷口部位的F4/80陽性巨噬細胞明顯減少（P＜0.05），NF-кB蛋白表達水平顯著降低（P＜0.05），見圖3a～d。RT-qPCR的結(jié)果表明，TSP-1KO小鼠的傷口部位IL-1β、IL-6 mRNA表達水平顯著降低（P＜0.01），敲除TSP-1對小鼠皮膚CRWI傷口部位TNF-α mRNA表達水平影響不明顯（P＞0.05），見圖3e。以上結(jié)果表明，敲除TSP-1會使小鼠皮膚CRWI炎癥降到更低水平。

圖3 小鼠皮膚CRWI建模后第7天WT及TSP-1KO小鼠傷口部位的炎癥反應情況

2.4 敲除TSP-1小鼠皮膚CRWI傷口部位的血管生成情況

免疫組化染色結(jié)果顯示，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠傷口部位CD31陽性細胞（新生成血管）表達顯著減少（P＜0.05），見圖4a、b。同時，與WT小鼠相比，TSP-1KO小鼠傷口部位α-SMA陽性細胞（成熟血管）表達也減少（P＜0.05），見圖4c、d。即敲除TSP-1會導致小鼠皮膚CRWI血管生成受到抑制。

3 討論

為了確定TSP-1在小鼠皮膚CRWI傷口愈合中的作用，我們培育了TSP-1基因全敲除小鼠，應用TSP-1KO小鼠進行傷口愈合實驗，結(jié)果顯示，TSP-1KO小鼠皮膚CRWI的傷口部位巨噬細胞浸潤較少，NF-κB蛋白表達降低，炎癥細胞因子表達減少，并且血管生成也相應減少。

TSP-1在免疫調(diào)節(jié)方面發(fā)揮重要作用，是單核細胞趨化性、巨噬細胞吞噬作用、調(diào)節(jié)T細胞功能、激活潛伏TGF-β1的重要介質(zhì)[11]。有研究發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)染siRNA抑制TSP-1表達可減少THP-1細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的分泌，并且過表達TSP-1可上調(diào)THP-1細胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的表達水平[12]。本研究中TSP-1KO小鼠皮膚CRWI傷口部位炎癥細胞因子表達降低，炎癥反應減弱，與以上研究結(jié)果相同，即TSP-1在小鼠皮膚CRWI傷口愈合過程中發(fā)揮促炎作用。CRWI傷口部位炎癥反應較輕[13]，將促炎因子TSP-1敲除，致使CRWI炎癥反應進一步減輕，更加不利于小鼠皮膚CRWI傷口愈合。

大多數(shù)研究認為，TSP-1是抑制血管生成最重要的蛋白之一[14-15]，而TSP-1KO小鼠皮膚CRWI傷口部位血管生成卻減少，可能是因為炎癥反應在傷口愈合過程中發(fā)揮主導作用[16]，傷口愈合前期的炎癥反應不足會影響愈合后期的細胞因子以及其他營養(yǎng)物質(zhì)的積累，使得TSP-1抑制血管生成的作用未能顯現(xiàn)。新生血管可以為傷口部位提供氧、營養(yǎng)和生物活性物質(zhì)，在傷口愈合過程中發(fā)揮不可替代的作用[17]。TSP-1KO小鼠的傷口部位血管生成減少，進一步導致小鼠皮膚CRWI傷口愈合延遲。

綜上所述，本研究探討了TSP-1在小鼠皮膚CRWI愈合中的作用，發(fā)現(xiàn)TSP-1是小鼠皮膚CRWI愈合過程中促進炎癥反應的關(guān)鍵因子，并且在一定程度上有利于傷口部位的血管生成。上述結(jié)果為后續(xù)深入研究TSP-1在CRWI以及其他傷口模型中的作用機制奠定了基礎(chǔ)。