桑晶,李璐,姜潔,范偉

（1. 青島大學附屬青島市中心醫(yī)院/青島市腫瘤醫(yī)院急診科，山東 青島 266013；2. 青島大學附屬青島市中心醫(yī)院/青島市腫瘤醫(yī)院輸血科，山東 青島 266013；3. 青島大學附屬青島市中心醫(yī)院/青島市腫瘤醫(yī)院肝膽血管外科，山東 青島 266013）

由于某種原因導致心臟缺血后，再對其進行灌注治療恢復供血稱為心肌缺血再灌注，此過程會對心肌組織造成不可逆轉的損傷[1-2]。減輕心肌缺血再灌注損傷一直是臨床研究的重點[3]。茯苓酸是從茯苓中提取的四環(huán)三萜類化合物，具有抗氧化、抗炎、降血糖等生物活性[4]。江桂萍[5]的研究表明，茯苓酸對缺血再灌注腎損傷具有修復作用。Pang等[6]研究表明，茯苓酸可通過激活PI3K/Akt信號通路減輕腦缺血再灌注引起的腦損傷。研究表明，Shh/Gli1信號通路在組織缺血性損傷修復過程中有關鍵作用，在角膜缺血、腦缺血、骨及骨骼肌缺血的動物模型中，Shh信號通路對缺血損傷發(fā)揮重要的修復作用[7]。Lang等[8]研究表明，通過激活Shh/Gli1信號通路可以降低缺氧/復氧心肌細胞的凋亡率。彭莉等[9]研究表明，異氟醚可激活Shh/Gli1信號通路，從而減輕大鼠腦缺血-再灌注引起的損傷。由此推測，Shh/Gli1信號通路在缺血再灌注損傷中發(fā)揮重要的修復作用。目前茯苓酸在心肌缺血再灌注損傷中的治療效果尚未明確，因此，本研究就茯苓酸調節(jié)Shh/Gli1信號通路減輕心肌缺血再灌注損傷進行探討，以期為臨床用藥提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料與試劑

實驗動物：SPF級180～200 g雄性SD大鼠60只，購自廣東維通利華實驗動物技術有限公司，生產許可證號：SCXK（粵）2022-0063。大鼠適應性飼養(yǎng)7 d，自由飲食和飲水，環(huán)境溫度（22±2）℃，相對濕度（60±5）%，12 h光照/黑暗循環(huán)。

主要試劑與儀器：茯苓酸購自成都攀達生物科技有限公司；TRIzol試劑購自廣州威佳科技有限公司；Shh/Gli1信號通路抑制劑環(huán)巴胺購自上海信帆生物科技有限公司；蛋白提取試劑盒購自武漢艾美捷科技有限公司；谷草轉氨酶（aspartate aminotransferase,AST）、肌酸激酶（creatine kinase,CK）、心肌肌鈣蛋白T（cardiac troponin T,cTnT）ELISA試劑盒購自江蘇酶免實業(yè)有限公司；RT-PCR試劑盒購自上海西格生物科技有限公司；CX41顯微鏡購自上海信裕生物科技有限公司；RM2245病理切片機購自德國Lecia公司；總RNA提取試劑盒購自上海海方生物技術有限公司；Bax、Bcl-2、Shh、Gli1一抗及二抗均購自美國Abcam公司。

1.2 方法

1.2.1 分組與造模 將SD大鼠隨機分為假手術組、模型組、茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組和茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組，每組10只。茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組于造模前3 d分別腹腔注射5、10、20 mg·kg-1·d-1茯苓酸[5]；茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組于造模前3 d腹腔注射20 mg·kg-1·d-1茯苓酸，再于缺血前30 min腹腔注射10 mg/kg Shh/Gli1信號通路抑制劑環(huán)巴胺[9]；假手術組和模型組腹腔注射等體積生理鹽水。然后麻醉大鼠，進行造模，采用手術結扎大鼠冠狀動脈左前降支，缺血30 min后拉松接線，再灌注供血120 min，假手術組穿線但不進行結扎。心電圖ST段抬高后壓低、部分心肌由紫色變?yōu)榘导t色為造模成功[10]，本研究中57只造模成功。術后主動脈采血，各組選取3只大鼠的心臟組織進行TTC染色，測定梗死面積，取剩余7只大鼠心臟左心室組織進行其他檢測。

1.2.2 測定心肌梗死面積 清洗心臟組織后置于-80 ℃冰箱冷凍，然后橫切4～5片，用0.2 g/L的TTC染色，避光孵育后進行拍照，Image J軟件分析梗死面積，并計算其百分比。梗死面積百分比=（梗死面積/左心室橫面積）×100%。

1.2.3 ELISA法檢測大鼠血清AST、CK、cTnT水平抽取大鼠主動脈血，離心后收集上清液，按照ELISA試劑盒說明書檢測AST、CK、cTnT水平。

1.2.4 HE染色觀察大鼠心肌組織病理學變化取大鼠部分左心室組織固定，石蠟包埋后切片，HE染色，顯微鏡下觀察大鼠心肌組織形態(tài)變化。

1.2.5 TUNEL染色檢測心肌細胞凋亡情況 取1.2.4中固定組織，石蠟包埋后切片，經(jīng)脫蠟、乙醇梯度脫水后，按照TUNEL試劑盒說明書進行測定，熒光顯微鏡下觀察細胞凋亡情況。

1.2.6 RT-PCR法檢測心肌組織Shh、Gli1表達 取部分左心室組織剪碎，冰浴研磨勻漿，提取總RNA，將RNA逆轉錄為cDNA，熒光定量PCR擴增cDNA。以β-actin為內參，使用2-ΔΔCt法計算Shh和Gli1的相對表達量。Shh正向5'-GGAGTGAAACTGCGGGTGA-3'，反向5'-GCGGTACAGGAAAGTGAGG-3'；Gli1正向5'-TTCCT ACCAGAGTCCCAAGT-3'，反向5'-CCCTATGTGAAGC CCTATTT-3'；β-actin正向5'-CCTCTATGCCAACACAG TGC-3'，反向5'-GTCCTCCTGCTTGCTGATCC-3'。

1.2.7 Western blot檢測大鼠左心室組織中Shh/Gli1信號通路相關蛋白表達 取1.2.6中組織勻漿液，提取組織總蛋白，BCA法檢測組織蛋白含量，蛋白變性后進行SDS-PAGE電泳分離，然后轉膜，置于封閉液中封閉，加入Bax（1∶1 500稀釋）、Bcl-2（1∶1 500稀釋）、Shh（1∶1 500稀釋）、Gli1（1∶1 500稀釋）一抗4 ℃搖床過夜，洗膜后分別加入相應二抗（1∶5 000稀釋）常溫下孵育2 h，再加入ECL發(fā)光液進行顯影，最后用Image-Pro Plus軟件進行蛋白定量分析。

1.3 統(tǒng)計學分析

數(shù)據(jù)采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計學分析。實驗結果以均數(shù)±標準差（）表示，多組間比較用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q檢驗。P＜0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 心肌梗死面積比較

假手術組心肌組織呈紅色，無明顯白色梗死區(qū)；模型組大鼠心肌組織出現(xiàn)大面積白色梗死區(qū)。與模型組比較，茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組梗死面積顯著減小（P＜0.05），且隨著濃度的增加梗死面積逐漸減小（P＜0.05）；相較于茯苓酸高劑量組，茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組梗死面積明顯增大（P＜0.05），見圖1。

圖1 心肌細胞梗死情況

2.2 大鼠血清AST、CK、cTnT水平比較

與假手術組相比，模型組大鼠血清AST、CK、cTnT水平顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，茯苓酸低劑量組大鼠血清AST、CK、cTnT水平無顯著變化（P＞0.05），茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組大鼠血清AST、CK、cTnT水平顯著降低（P＜0.05）；與茯苓酸高劑量組相比，茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組大鼠血清AST、CK、cTnT水平顯著升高（P＜0.05），見圖2。

圖2 各組大鼠血清AST、CK、cTnT水平

2.3 大鼠心肌組織病理學變化情況

假手術組大鼠細胞排列整齊，形態(tài)結構完整，無明顯損傷。模型組大鼠心肌細胞固縮，形態(tài)結構不規(guī)則，肌纖維紊亂，有較多炎癥細胞浸潤。與模型組相比，茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組心肌纖維排列稍整齊，炎癥細胞浸潤明顯減少，且隨著劑量增加，心肌損傷逐漸減輕。與茯苓酸高劑量組相比，茯苓酸高劑量+ 環(huán)巴胺組心肌纖維排列紊亂，炎癥細胞浸潤明顯增加，見圖3。

圖3 各組織大鼠心肌組織病理學變化

2.4 各組大鼠心肌細胞凋亡比較

假手術組TUNEL染色陽性細胞少，凋亡率低。與假手術組相比，模型組TUNEL染色陽性細胞顯著增加，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05）；與模型組相比，茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組大鼠TUNEL染色陽性細胞顯著減少，細胞凋亡率降低（P＜0.05），且呈劑量依賴性（P＜0.05）。與茯苓酸高劑量組相比，茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組TUNEL染色陽性細胞顯著增加，細胞凋亡率顯著升高（P＜0.05），見圖4。

圖4 心肌細胞凋亡情況

2.5 各組大鼠心肌組織Shh、Gli1表達比較

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織Shh、Gli1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05）；與模型組相比，茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組大鼠心肌組織Shh、Gli1 mRNA表達顯著升高（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與茯苓酸高劑量組相比，茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組大鼠心肌組織Shh、Gli1 mRNA表達顯著降低（P＜0.05），見圖5。

圖5 各組大鼠心肌組織Shh、Gli1 mRNA表達情況

2.6 各組大鼠心肌組織Bax、Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表達水平比較

與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bax表達顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，茯苓酸低劑量組、茯苓酸中劑量組、茯苓酸高劑量組大鼠心肌組織Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表達顯著升高（P＜0.05），Bax蛋白表達顯著降低（P＜0.05），且呈濃度依賴性（P＜0.05）；與茯苓酸高劑量組相比，茯苓酸高劑量+環(huán)巴胺組大鼠心肌組織Bcl-2、Shh、Gli1蛋白表達顯著降低（P＜0.05），Bax蛋白表達顯著升高（P＜0.05），見圖6。

圖6 各組大鼠心肌組織相關蛋白表達

3 討論

急性心肌梗死是指冠狀動脈急性阻塞，心臟肌肉因缺血壞死，使得心臟功能受損的急性病癥[11]。隨著生活習慣的改變，心肌梗死的發(fā)病率逐漸升高，且有年輕化的趨勢[12]。缺血性心臟病和急性心肌梗死的治療主要是再灌注治療疏通血管，但再灌注會對心肌細胞造成二次損傷[13]。因此，如何減少再灌注損傷一直是臨床研究的方向，也是急需解決的難題。本研究通過結扎再灌注建立心肌缺血再灌注損傷模型，結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠心肌組織有大面積梗死區(qū)，心肌細胞固縮，形態(tài)結構不規(guī)則，肌纖維紊亂，有較多炎癥細胞浸潤；同時血清AST、CK、cTnT水平及TUNEL染色陽性細胞、細胞凋亡率、Bax表達顯著升高，提示心肌缺血再灌注可導致心肌細胞損傷和凋亡。

茯苓酸是一種從茯苓中提取的天然活性物質，具有多種藥理作用[14]。劉鳳等[15]研究表明，茯苓酸通過激活Nrf2/HO-1信號通路，減輕OX-LDL誘導的人臍靜脈內皮細胞氧化應激損傷。Jiang等[16]研究表明，茯苓酸可以通過激活Nrf2來發(fā)揮對缺血再灌注引起急性腎損傷的保護作用。本研究結果顯示，與模型組相比，茯苓酸可以提高Bcl-2蛋白表達，降低心肌細胞凋亡率、Bax表達、血清AST、CK、cTnT水平，減少心肌梗死面積，提示茯苓酸可減輕心肌缺血再灌注引起的心肌損傷；HE染色結果顯示，茯苓酸低、中、高劑量組心肌纖維排列稍整齊，炎癥細胞浸潤明顯減少，損傷顯著輕于模型組，提示茯苓酸可減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。

心肌缺血后的修復與多種信號通路有關。研究表明，Shh/Gli1信號通路是實現(xiàn)血管再生調控的通路之一[17]。伊忻等[18]研究表明，激活Shh信號通路可提高心肌血管生長因子的表達，促進心肌梗死大鼠的血管再生。余萍萍[19]的研究表明，白藜蘆醇通過激活Shh信號通路，促進大鼠腦缺血性損傷后神經(jīng)修復，改善神經(jīng)功能。本研究結果顯示，與假手術組相比，模型組大鼠Shh、Gli1表達顯著降低，提示心肌缺血再灌注過程中Shh/Gli1信號通路被抑制；茯苓酸干預后，Shh表達顯著升高，推測茯苓酸可能通過激活Shh/Gli1信號通路修復損傷的心肌細胞，降低細胞凋亡率；與茯苓酸單獨處理相比，茯苓酸和環(huán)巴胺共同處理可降低Shh、Gli1表達，促進心肌細胞凋亡，增大心肌梗死面積，提示環(huán)巴胺可減弱茯苓酸對心肌細胞的修復作用，增加心肌細胞損傷。

綜上，茯苓酸可通過激活Shh/Gli1信號通路減輕大鼠心肌缺血再灌注損傷。但中藥治療涉及的信號通路較多，本研究只對一種通路進行探究，后續(xù)還需進一步研究。