施麗君，楊韌強(qiáng)，嚴(yán)秋蘭，閻光宇，蔡樹蕓，楊 婷，陳偉珠,，張怡評,

（1.自然資源部第三海洋研究所海洋生物資源開發(fā)利用工程技術(shù)創(chuàng)新中心，福建 廈門 361005；2.福建中煙工業(yè)有限責(zé)任公司技術(shù)中心，福建 廈門 361021；3.廈門海洋職業(yè)技術(shù)學(xué)院海洋生物學(xué)院，福建 廈門 361100）

干姜（Zingiber officinaleRosc.）為姜科植物姜的干燥根莖[1]，其傳統(tǒng)優(yōu)質(zhì)資源分布廣泛。干姜始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，被列為中品[2]，具有溫中散寒、回陽通脈、溫肺化飲的功效[3]。其主要含姜酚和揮發(fā)油等成分，可改善血液循環(huán)，對惡心嘔吐、炎癥、心腦血管系統(tǒng)疾病有較好的治療作用[4]。姜酚是干姜的主要生物活性物質(zhì)，其中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚含量較高[5-6]。6-姜酚具有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗菌、保肝利膽、抗氧化、改善心腦血管系統(tǒng)功能等多種藥理作用。研究發(fā)現(xiàn)，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚可加強(qiáng)心肌收縮力，并對腫瘤細(xì)胞活性有明顯的抑制作用[7-10]，并且其均具有β-羥基酮，結(jié)構(gòu)不穩(wěn)定[11-12]。這可對姜酚的提取、分離等研究造成影響，因此對姜酚的提取工藝考察具有一定的研究意義。目前尚未見干姜中以此3種姜酚成分為指標(biāo)的提取工藝研究。故本研究以干姜中3種酚類成分為指標(biāo)，采用超聲輔助提取法，考察乙醇濃度、提取時間及料液比等因素對干姜中姜酚類成分提取工藝的影響，建立干姜中姜酚類成分最佳的提取工藝，旨在為干姜的進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 e2695型高效液相色譜儀（美國Waters公司）；KQ-500E型超聲波清洗儀（昆山市超聲儀器有限公司）；ME104E型萬分之一電子分析天平（梅特勒-托利多儀器有限公司）；DFT-200A型手提式高速粉碎機(jī)（溫嶺市林大機(jī)械有限公司）。

1.2 試劑與試藥 干姜（批號：21090103）購自安國市一方藥業(yè)有限公司，經(jīng)福建中醫(yī)藥大學(xué)黃鳴清教授鑒定為姜科植物姜（Zingiber officinale Rosc.）的干燥根莖；6-姜酚對照品（批號：Y03D11Y132894）、8-姜酚對照品（批號：G24A10L96114）、10-姜酚對照品（批號：Z10701BC13）均購自上海源葉生物科技有限公司；乙醇（分析純）購自西隴科學(xué)股份有限公司；無水乙醚（批號：20191017）購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；乙腈（色譜純）購自西格瑪奧德里奇（上海）貿(mào)易有限公司。

2 方法

2.1 色譜條件 Thermo BDS Hypersil C18色譜柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相為乙腈-水（72∶28）；流速為1 mL/min；檢測波長為280 nm；柱溫為25 ℃；進(jìn)樣量為10 μL。對照品與供試品色譜圖見圖1。

圖1 HPLC 圖

2.2 混合對照品溶液的制備 精密稱定6-姜酚對照品10.41mg、8-姜酚對照品10.36 mg、10-姜酚對照品10.32 mg，分別置于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度線，混勻，即得質(zhì)量濃度為1.04 mg/mL的6-姜酚對照品溶液、1.04 mg/mL的8-姜酚對照品溶液、1.03 mg/mL的10-姜酚對照品溶液。分別精密吸取6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚對照品溶液各0.25 mL，再加入0.25 mL色譜甲醇補(bǔ)齊至1 mL，即得混合對照品溶液，放置4 ℃冰箱儲藏，備用。

2.3 供試品溶液的制備 精密稱定干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置100 mL無塞錐形瓶中，加入一定量、一定體積分?jǐn)?shù)的乙醇溶劑，稱定質(zhì)量，超聲（功率：500 W）提取一定時間后取出再次稱定質(zhì)量，用乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，放置片刻后，取上清液，溶液用0.45 μm微孔濾膜過濾，即得供試品溶液。

2.4 單因素試驗 采用超聲輔助提取法提取干姜中的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚，分別考察不同乙醇濃度、提取時間、料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響。

2.5 響應(yīng)面法優(yōu)化提取試驗 在單因素試驗結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)響應(yīng)面法Box-Behnken設(shè)計原理，以乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）3個因素為響應(yīng)因子，對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚的提取工藝進(jìn)行優(yōu)化，采用3因素3水平的響應(yīng)面分析法進(jìn)行試驗，試驗因素與水平見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平表

3 結(jié)果

3.1 單因素試驗結(jié)果

3.1.1 乙醇濃度對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響精密稱取干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，分別加入40、50、60、70、80%的乙醇溶液，固定超聲提取時間為40 min、料液比為1∶40（g/mL），提取結(jié)果見圖2。結(jié)果顯示，當(dāng)提取時間與料液比固定時，隨著乙醇濃度的升高，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率也隨之升高。當(dāng)乙醇濃度為40%～60%時對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響較為顯著；當(dāng)乙醇濃度為60%時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，為1.54%；當(dāng)乙醇濃度超過60%時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率反而降低，之后趨于平穩(wěn)。這可能是由于較低濃度的乙醇進(jìn)入組織細(xì)胞內(nèi)較容易，可大量溶解液泡中的水溶性酚類物質(zhì)；而高濃度的乙醇則容易破壞蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，使酚類物質(zhì)的提取受到阻礙[13]。隨著乙醇濃度的繼續(xù)增大，提取出的其他雜質(zhì)成分與乙醇-水分子結(jié)合，形成了競爭性抑制劑，從而導(dǎo)致6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率降低[14]。因此優(yōu)選乙醇濃度為60%。

圖2 乙醇濃度對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響

3.1.2 提取時間對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響精密稱取干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，加入80 mL的60%乙醇溶液，分別超聲提取20、30、40、50、60 min，提取結(jié)果見圖3。結(jié)果顯示，當(dāng)乙醇濃度與料液比固定時，隨著提取時間的延長，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率也隨之增加；當(dāng)超聲提取時間為40 min時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，為1.48%；當(dāng)超聲提取時間為30～40 min時對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響最大，可能是因為超聲提取時間過短，空化作用尚未發(fā)生完全，酚類物質(zhì)尚為完全溶解，所以6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率不高[15]。當(dāng)超聲提取時間超過最佳提取時間時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率下降并且趨于平穩(wěn)，可能是因為超聲提取時間太長，大分子酚類化合物在超聲波的持久強(qiáng)烈作用下，化學(xué)結(jié)構(gòu)遭受破壞，緊接著其他雜質(zhì)成分也慢慢溶解，從而阻擋了姜酚的溶解使6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率不高[16]。因此優(yōu)選超聲提取時間為40min。

圖3 提取時間對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響

3.1.3 料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響精密稱取干姜粉末（過三號篩）2.0 g，置于100 mL錐形瓶中，分別選取料液比1∶5、1∶10、1∶20、1∶30、1∶40，加入60%的乙醇溶液，固定超聲提取時間為40 min，提取結(jié)果見圖4。結(jié)果顯示，超聲提取時間和乙醇濃度固定時，隨著料液比的增加，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率也隨之增加。當(dāng)料液比為1∶30（g/mL）時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，為1.55%。料液比繼續(xù)增加，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率則不再提高，趨于平穩(wěn)略呈下降趨勢。一般而言，料液比越大提取率越高，但達(dá)到一定值后，有效成分已提取完全，提取率則不再增加。而且料液比越大資源耗費(fèi)越大，成本越高，操作也更不便[17]。綜合考慮最終優(yōu)選料液比為1∶30（g/mL）。

圖4 料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響

3.2 響應(yīng)面試驗結(jié)果

3.2.1 響應(yīng)模型的建立與分析 采用Design-Expert 8.0.6軟件，設(shè)計響應(yīng)面優(yōu)化試驗方案得試驗結(jié)果見表2。

表2 響應(yīng)面優(yōu)化提取干姜中姜酚的設(shè)計方案及結(jié)果

采用Design-Experts 8.0.6軟件對表2所得數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸分析，得到干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率對乙醇濃度（A）、提取時間（B）、料液比（C）的回歸模型方程為：6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率（%）=1.73+0.049A+0.024B+0.015C-0.040AB-0.023AC-0.0025-003BC-0.12A2-0.069B2-0.016C2。通過響應(yīng)面試驗得到的結(jié)果對干姜中姜酚提取工藝的回歸方程進(jìn)行方差分析。結(jié)果見表3。

表3 干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚提取工藝回歸方程方差分析結(jié)果

根據(jù)方差分析表3可知，該方差模型F值為15.51，P值為0.0008，極顯著，失擬項F值為3.1，P值為0.151 3，不顯著。在此回歸方程模型中，只有乙醇濃度的P＜0.05，說明存在顯著性，其余兩個因素P＞0.05，不存在顯著性。二次項中，A2影響極顯著（P＜0.001），B2影響顯著（P＜0.05），C2影響不顯著（P＞0.05）。校正模型的相關(guān)系數(shù)R2=0.9523，可知試驗考察值和模擬預(yù)測值之間的相關(guān)性很高，表明該方程的模擬性較好。根據(jù)3種因素F值大小，可推斷出影響6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率大小因素的排序為A＞B＞C。

3.2.2 響應(yīng)面優(yōu)化結(jié)果與分析 根據(jù)擬合模型繪制干姜中6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率各因素交互作用圖見圖5～7。圖5～6顯示明顯橢圓形的等高線圖，表明乙醇濃度與料液比、料液比與提取時間之間交互作用顯著。圖7只顯示近似橢圓形的等高線圖，表明乙醇濃度與提取時間之間僅呈交互作用，但是不顯著。

圖5 乙醇濃度與料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的交互作用圖

通過圖5～7中響應(yīng)面各因素交互作用圖可知，在所選范圍內(nèi)存在響應(yīng)面最高點(diǎn)。當(dāng)乙醇濃度為61%，料液比為1∶34（g/mL）時，因提取時間充足使得6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高。（見圖5）當(dāng)提取時間為41 min，料液比為1∶34（g/mL）時，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高，時間過短或料液比過高都不利于酚類物質(zhì)的提取。（見圖6）當(dāng)乙醇濃度為61%，提取時間為41 min時，中等濃度的乙醇最適合姜酚的提取，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率最高。（見圖7）

圖6 提取時間與料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的交互作用圖

圖7 乙醇濃度與提取時間對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的交互作用圖

3.3 最佳工藝條件的確定與驗證試驗 通過響應(yīng)面軟件解出方程，得出最優(yōu)化提取工藝：乙醇濃度為61.4%，提取時間為41.2 min，料液比為1∶33.6（g/mL），結(jié)合實(shí)際試驗條件，將最優(yōu)化提取工藝參數(shù)取整數(shù)得：乙醇濃度為61%，提取時間為41 min，料液比為1∶34（g/mL）。

采用確定的最優(yōu)條件分別進(jìn)行3組平行驗證試驗，通過驗證得出3組平行試驗的6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均總提取率為1.73%，該值與模型預(yù)測值1.74%基本一致，誤差為0.57%，說明建立的模擬回歸方程具有良好的預(yù)測性[18]，其優(yōu)選出的最佳提取工藝重復(fù)性良好。

4 討論

干姜資源豐富，但其主要成分的研究較單一，研究大多集中于占比較大的揮發(fā)油上[19-20]。姜酚研究主要集中于6-姜酚的研究，而8-姜酚、10-姜酚及其他姜酚的研究很少。這可能是由于6-姜酚占總姜酚的比例更大[21]，藥理作用也十分廣泛。本試驗采用超聲輔助提取法進(jìn)行單因素試驗，分別考察了乙醇濃度、提取時間、料液比對6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚總提取率的影響，經(jīng)響應(yīng)面法優(yōu)化得到最佳提取工藝條件：乙醇濃度為61%，提取時間為41 min，料液比為1∶34（g/mL）。用HPLC測定3種姜酚的含量，結(jié)合響應(yīng)面法優(yōu)化最佳提取工藝，以最佳提取工藝條件進(jìn)行3次平行試驗，得到6-姜酚提取率為0.90%、8-姜酚提取率為0.30%、10-姜酚提取率為0.53%，6-姜酚、8-姜酚、10-姜酚平均總提取率為1.73%。