張娜娜，孫 艷，莊華青，王竣楠，郇旭升，張 麗，莊建林，關(guān)永霞

（1.魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室，山東 臨沂 276006；2.魯南厚普制藥有限公司，山東 臨沂 276006）

連翹為木犀科植物連翹[Forsythia suspensa（Thunb.）Vahls]的干燥果實[1-2]，主要分布于我國山西、陜西、河南、湖北、山東等地。其素有“瘡家圣藥”之稱，有清熱解毒、疏肝行氣等功效[3-5]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，連翹具有抗菌、抗病毒、抗氧化及抗衰老等多種作用[6-8]。連翹中含有揮發(fā)油類、苯乙醇苷類、木脂素類、有機酸類和萜類等化合物。2020年版《中華人民共和國藥典》一部[1]規(guī)定連翹的含量測定成分為揮發(fā)油、連翹苷和連翹酯苷A，因此這3種成分對于連翹發(fā)揮藥理作用具有至關(guān)重要的意義。連翹揮發(fā)油含有烯類、烷類、醇類、醛類、酯類等化合物，具有廣譜的抑菌、抗氧化、解熱抗炎等藥理活性，是連翹發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)之一[9-11]。

桑菊感冒片是由桑葉、菊花、連翹等8味中藥組成的中藥復(fù)方制劑，具有疏散風(fēng)熱、宣肺止咳的功效，常用于治療風(fēng)熱感冒。桑菊感冒片的原生產(chǎn)工藝中會將提取的連翹揮發(fā)油直接噴灑在物料上，然而揮發(fā)油的穩(wěn)定性較差，易揮發(fā)；且成品制劑具有刺激性氣味，導(dǎo)致患者口服依從性差；并且片劑制備過程中，易造成物料流動性差，很難壓片。因此，根據(jù)生產(chǎn)過程中出現(xiàn)的問題，本研究用β-環(huán)糊精包合來提高連翹揮發(fā)油的穩(wěn)定性，并改善制劑口感等[12-13]。目前揮發(fā)油包合方法有飽和水溶液法、超聲法、膠體磨研磨法等。本研究通過包合方法的對比實驗篩選出膠體磨研磨法包合連翹揮發(fā)油，此法具有包合效率高、操作簡單、適合大生產(chǎn)的優(yōu)勢[14-15]。本研究以連翹揮發(fā)油包合率、包合物得率及綜合評分為指標，采用Box-Behnken響應(yīng)面法[16-22]，優(yōu)選了連翹揮發(fā)油膠體磨研磨法包合的最佳工藝參數(shù)，為含連翹揮發(fā)油制劑的工藝改進提供了依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 主要儀器 Ml6002T型電子天平（瑞士梅特勒－托利多公司）；XL-250型兩級膠體磨（溫州制藥機械設(shè)備廠）；GZX-9140MBE型電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠）；ALPHA型紅外掃描儀（布魯克公司）。

1.2 試藥與試劑 連翹藥材（批號：20220829）購于哈爾濱福順堂藥材有限公司，由魯南制藥集團股份有限公司中藥制藥共性技術(shù)國家重點實驗室范建偉高級工程師鑒定，符合2020年版《中華人民共和國藥典》規(guī)定；β-環(huán)糊精（β-CD）（批號：20190201）購于孟川市華興生物化工有限公司；蒸餾水、乙醇、乙酸乙酯、正己烷等試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 連翹揮發(fā)油的提取 稱取連翹藥材28.0 kg，投入芳香油提取罐中，加入6倍量水，采用水蒸氣蒸餾法提取連翹揮發(fā)油，開啟加熱，待提取罐內(nèi)沸騰后，調(diào)節(jié)蒸汽閥，提取3 h，至揮發(fā)油的油量不再增加，停止加熱，讀取揮發(fā)油量（323 mL），開啟揮發(fā)油收集器活塞，收集揮發(fā)油。于揮發(fā)油中加入等體積的無水乙醇制成揮發(fā)油乙醇溶液（揮發(fā)油與無水乙醇體積比為1∶1），放入冷庫保存，備用。

2.2 空白回收率的測定 參照2020年版《中華人民共和國藥典》四部項下?lián)]發(fā)油含量測定法（通則2204）甲法，精密吸取“2.1”項下?lián)]發(fā)油乙醇溶液4 mL，共3份，分別置于圓底燒瓶中，加水600 mL，沸石數(shù)粒，保持沸騰5 h，待揮發(fā)油測定器中油量不再增加時，停止加熱，讀取揮發(fā)油量，計算得到平均空白回收率為91.32%。

2.3 評價指標 精密稱取揮發(fā)油包合物（總質(zhì)量的1/5），分別置于圓底燒瓶中，加水600 mL，沸石數(shù)粒，保持沸騰5 h，待揮發(fā)油測定器中油量不再增加時，停止加熱，讀取揮發(fā)油量，分別計算包合率和包合物得率。以β-CD揮發(fā)油包合率和包合物得率的綜合得分Y作為評價指標。根據(jù)實際生產(chǎn)經(jīng)驗，賦予包合率權(quán)重為80%，包合物得率權(quán)重為20%。包合率（%）=包合物中揮發(fā)油的含量/（揮發(fā)油加入量×空白回收率）×100%；包合物得率（%）=包合物量/（β-CD加入量＋揮發(fā)油加入量）×100%；Y（綜合得分）=（包合率/包合率max×80%+包合物得率/包合物得率max×20%）×100。

2.4 包合方法比較

2.4.1 飽和水溶液法 稱取β-CD 90 g，加入純化水1 440 mL，水浴加熱，攪拌，升溫至50 ℃，待β-CD完全溶解后，溫度降至40 ℃，用分液漏斗緩慢滴加揮發(fā)油乙醇溶液20 mL，不斷攪拌（200 r/min），滴加完畢，恒溫包合2 h，入庫冷藏（0～8 ℃）過夜，減壓抽濾，抽濾結(jié)束后，取上層揮發(fā)油包合物，用95%乙醇沖洗吸附的揮發(fā)油，40 ℃烘干，得干包合物。

2.4.2 超聲法 稱取β-CD 90 g，加入純化水1 440 mL，超聲，水浴加熱，攪拌，升溫至50 ℃，待β-CD完全溶解后，溫度降至40 ℃，用分液漏斗緩慢滴加揮發(fā)油乙醇溶液20 mL，不斷超聲攪拌，滴加完畢，恒溫包合2 h，入庫冷藏（0～8 ℃）過夜，減壓抽濾，抽濾結(jié)束后，取上層揮發(fā)油包合物，用95%乙醇沖洗吸附的揮發(fā)油，40 ℃烘干，得干包合物。

2.4.3 膠體磨研磨法 稱取β-CD 90 g，加入純化水360 mL，玻璃棒攪勻，置膠體磨中研磨，設(shè)置轉(zhuǎn)速為2 880 r/min，乳化細度為20 μm，用分液漏斗緩慢滴加揮發(fā)油乙醇溶液20 mL，滴加完畢，研磨包合20 min，入庫冷藏（0～8 ℃）過夜，減壓抽濾，抽濾結(jié)束后，取上層揮發(fā)油包合物，用95%乙醇沖洗吸附的揮發(fā)油，40 ℃烘干，得干包合物。

由表1可知，膠體磨研磨法的包合率、包合物得率、綜合評分（Y）均高于飽和水溶液法和超聲法。

表1 包合方法的比較

2.5 連翹揮發(fā)油研磨法包合單因素考察

2.5.1 連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比對包合工藝的影響 按“2.4.3”項下方法，固定β-CD與水的投料比為1∶5，研磨時間為20 min，考察連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比對包合工藝的影響。選擇連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶6、1∶9、1∶12、1∶15。按“2.3”項下方法進行揮發(fā)油包合率與包合物收率的測定，并計算綜合得分（Y）。由表2可知，連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比超過1∶12時Y基本不變，故后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化中選擇連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶6、1∶9、1∶12。

表2 連翹揮發(fā)油與β-CD 的投料比對包合工藝的影響

2.5.2 β-CD與水的投料比對包合工藝的影響 按“2.4.3”項下方法，固定連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶9，研磨時間為20 min，考察β-CD與水的投料比對包合工藝的影響。選擇β-CD與水的投料比為1∶3、1∶5、1∶7、1∶9。按“2.3”項下方法進行揮發(fā)油包合率與包合物收率的測定，并計算綜合得分（Y）。由表3可知，β-CD與水的投料比超過1∶7時Y基本不變，故后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化中選擇β-CD與水的投料比為1∶3、1∶5、1∶7。

表3 β-CD 與水的配比對包合工藝的影響

2.5.3 研磨時間對包合工藝的影響 按“2.4.3”項下方法，固定連翹揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶9，β-CD與水的投料比為1∶5，考察研磨時間對包合工藝的影響。選擇研磨時間為10、20、30、40 min。按“2.3”項下方法進行揮發(fā)油包合率與包合物收率的測定，并計算綜合得分（Y）。由表4可知，研磨時間30～40 min包合效果相差不大，因此后續(xù)Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化中選擇研磨時間為10、20、30 min。

表4 研磨時間對包合工藝的影響

2.6 Box-Behnken響應(yīng)面法優(yōu)化連翹揮發(fā)油研磨法包合工藝 根據(jù)上述連翹揮發(fā)油研磨法包合單因素考察試驗結(jié)果，選取用揮發(fā)油與β-CD的投料比（A）、β-CD與水的投料比（B）和研磨時間3個因素，用Box-Behnken響應(yīng)面法進行因素水平設(shè)計與試驗，試驗因素水平見表5，試驗設(shè)計及結(jié)果見表6～7。

表5 連翹揮發(fā)油包合工藝試驗因素水平

表6 連翹揮發(fā)油包合工藝Box-Behnken響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果

表7 連翹揮發(fā)油包合工藝響應(yīng)面二次回歸方程方差分析結(jié)果

采用Design-expert8.0.6軟件對試驗結(jié)果進行分析，得到回歸方程：Y=95.48+5.68A+3.65B+2.34C+0.069AB-2.66AC-2.17BC-5.76A2-0.27B2-3.73C2，r=0.975 7；建立的回歸整體模型P＜0.01。失擬項P=0.146 1＞0.01，模型成立。其中A、B、C、A2、C25個因素差異極顯著（P＜0.01），AC、BC差異顯著（P＜0.05），各因素對揮發(fā)油包合工藝綜合得分（Y）的影響大小順序為A＞B＞C。3個因素對Y的交互影響見圖1～3，由圖可知，響應(yīng)曲面表現(xiàn)均較為平滑。連翹揮發(fā)油包合工藝綜合得分（Y）隨揮發(fā)油與β-CD的投料比、β-CD與水的投料比和研磨時間的增加呈現(xiàn)出先升高再緩慢降低的趨勢，在一定的范圍達到最大值。

圖1 因素A 和B 對連翹揮發(fā)油包合工藝的影響

圖2 因素A 和C 對連翹揮發(fā)油包合工藝的影響

圖3 因素B 和C 對連翹揮發(fā)油包合工藝的影響

2.7 連翹揮發(fā)油包合工藝驗證 根據(jù)模型分析結(jié)果可以確定連翹揮發(fā)油包合最佳工藝：揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶10.59，β-CD與水的投料比為1∶6.84，研磨時間為18.7 min。結(jié)合生產(chǎn)實際及節(jié)能減排的原則，確定最佳提取工藝：揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶10，β-CD與水的投料比為1∶6，研磨時間為20min。根據(jù)此工藝重復(fù)3次試驗，包合率平均值為89.52%，包合物得率平均值為93.98%，綜合得分（Y）為90.41，RSD為1.21%，說明此工藝穩(wěn)定可靠。

2.8 連翹揮發(fā)油包合物的鑒定

2.8.1 薄層色譜（TCL）鑒別 量取連翹揮發(fā)油1 mL，加無水乙醇20 mL，混勻得樣品1；量取包合物中回收的揮發(fā)油1 mL，加無水乙醇稀釋至20 mL，混勻得樣品2；稱取連翹揮發(fā)油β-CD包合物10 g，加入無水乙醇20 mL，超聲后過濾，取續(xù)濾液，得樣品3；稱取連翹揮發(fā)油β-CD包合物10 g，加無水乙醇20 mL，振搖使溶解，濾過，取續(xù)濾液，得樣品4；取β-CD 10 g，加無水乙醇20 mL，振搖使溶解，濾過，取續(xù)濾液，得樣品5。從左到右依次點于同一硅膠G板上，以正己烷-乙酸乙酯（8∶2）為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈（254 nm）下檢視。結(jié)果樣品1、2、3在相同位置呈現(xiàn)明亮斑點，說明包合過程未改變連翹揮發(fā)油的化學(xué)成分，樣品4、5沒有斑點顯示，說明包合物制備完成。（見圖4）

圖4 薄層色譜鑒別圖

2.8.2 紅外光譜法鑒別 將β-CD、連翹揮發(fā)油、連翹揮發(fā)油β-CD包合物3個樣品分別采用衰減全反射法（ATR）在4 000～400 cm-1范圍內(nèi)進行IR掃描，測定結(jié)果見圖5～7。由圖可知，連翹揮發(fā)油在2 921 cm-1和1 642 cm-1有吸收尖峰，而連翹揮發(fā)油β-CD包合物在2 920 cm-1僅有較弱吸收，在1 642 cm-1無吸收。這是由于連翹揮發(fā)油和β-CD形成相互作用，連翹揮發(fā)油β-CD包合物制備完成。

圖5 β-CD 紅外圖譜

圖6 連翹揮發(fā)油紅外圖譜

圖7 連翹揮發(fā)油β-CD包合物紅外圖譜

3 討論

本研究選擇了飽和水溶液法、超聲法、膠體磨研磨法對連翹揮發(fā)油包合效果進行比較，結(jié)果顯示膠體磨研磨法較其他兩種包合方法具有包合率高、包合物得率高、操作簡單等優(yōu)勢，且可以用作大規(guī)模工業(yè)化生產(chǎn)。本研究由此在單因素試驗基礎(chǔ)上結(jié)合Box-Behnken響應(yīng)面法確定了連翹揮發(fā)油膠體磨研磨法包合工藝的最優(yōu)條件為：揮發(fā)油與β-CD的投料比為1∶10，β-CD與水的投料比為1∶6，研磨時間為20 min。驗證試驗結(jié)果表明，該包合工藝穩(wěn)定可行，且通過薄層鑒別和紅外光譜鑒別試驗結(jié)果顯示包合物已成功形成。該法可充分掩蓋揮發(fā)油的刺激氣味，減少揮發(fā)油的揮發(fā)，有利于連翹揮發(fā)油藥效成分的控制和相關(guān)制劑工藝的改進。