劉景峰，宋偉偉，李寶棟，王雅榮，白德龍，趙學(xué)棟，宋 佳，張玉曼，霍 青

（1.河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院，河北 滄州 061000；2.山東中醫(yī)藥大學(xué)附屬醫(yī)院，山東 濟(jì)南 250011）

卒中是導(dǎo)致人類(lèi)死亡的3大疾病之一，中國(guó)每年約有200萬(wàn)新發(fā)腦卒中患者[1]。卒中后引發(fā)的睡眠障礙是該病的常見(jiàn)并發(fā)癥，臨床上主要表現(xiàn)有失眠、嗜睡、睡眠呼吸障礙等[2]。研究發(fā)現(xiàn)大約有20%～40%的腦卒中患者會(huì)并發(fā)睡眠障礙；有數(shù)據(jù)顯示，95%的腦血管病患者存在睡眠障礙[3]。據(jù)悉，在卒中后睡眠障礙患者中失眠最為常見(jiàn)。國(guó)外報(bào)道腦卒中后患者發(fā)生失眠的概率為20%～56%，腦卒中急性期甚至高達(dá)56.7%～67.7%[4]。盡管在過(guò)去幾十年中卒中的治療效果取得了很大進(jìn)展，但有效的醫(yī)療或外科治療仍有待確定。因此，找到一種有效的治療方式，對(duì)于疾病的治療具有重要意義。預(yù)知子（Foreknowledge）為木通科植物，別名八月札，其果實(shí)具有疏肝理氣、散瘀消結(jié)等功效[5]。預(yù)知子為夜交藤預(yù)知子湯方中主藥之一，目前已有研究證實(shí)，預(yù)知子提取物（FAE）具有抗抑郁功效，可有效治療腦卒中后引發(fā)的認(rèn)知功能障礙，并且與單胺類(lèi)神經(jīng)遞質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白具有高親和力[6]，提示FAE可能作用于相關(guān)神經(jīng)遞質(zhì)，從而導(dǎo)致機(jī)體神經(jīng)功能的轉(zhuǎn)變。PI3K/Akt是控制細(xì)胞分裂、自噬、存活和分化等多種細(xì)胞過(guò)程的重要途徑之一。且參與了缺血性腦卒中的病理過(guò)程[7]。有研究發(fā)現(xiàn)，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活與機(jī)體炎癥反應(yīng)存在密切相關(guān)性，PI3K/Akt信號(hào)通路的激活可引起腫瘤壞死因子-α（TNF-α）、白細(xì)胞介素-6（IL-6）等炎癥因子表達(dá)異常，從而引起機(jī)體炎癥反應(yīng)[8]。但是目前關(guān)于FAE在卒中后失眠中的具體作用機(jī)制還不清楚，因此通過(guò)建立卒中后失眠大鼠模型，并采用FAE進(jìn)行干預(yù)，以探討FAE的相關(guān)作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 6周齡SPF級(jí)SD大鼠，雌雄各半，購(gòu)自重慶陸軍軍醫(yī)大學(xué)，體質(zhì)量（200～220）g。動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（渝）2019-0009；動(dòng)物使用許可證號(hào)：SYXK（渝）2019-0069；動(dòng)物合格證：20191254。本實(shí)驗(yàn)動(dòng)物于SPF級(jí)動(dòng)物房中進(jìn)行飼養(yǎng)，飼養(yǎng)條件為：20～25 ℃，環(huán)境濕度：40%～60%，模擬動(dòng)物光照環(huán)境（晝12 h/夜12 h），各組大鼠飲水飲食自由，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)河北省滄州中西醫(yī)結(jié)合醫(yī)院倫理委員會(huì)審批，符合動(dòng)物倫理標(biāo)準(zhǔn)。

1.2 藥物與試劑 預(yù)知子提取物（南京建成生物工程研究所，純度：99.99%，批號(hào)：20168491）；艾司西酞普蘭（大連美侖生物技術(shù)有限公司，純度：99.99%，批號(hào)：202036491）；TNF-α、IL-1β和IL-6酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定（ELISA）試劑盒（上海優(yōu)寧維生物有限公司，批號(hào)：SA-6548，F(xiàn)S-9848，CS-6845）；RT-qPCR試劑盒（南京建成生物有限公司，批號(hào)：961241）；蛋白定量試劑盒（南京建成生物有限公司，批號(hào)：323215）；PI3K、Akt、β-actin蛋白抗體（美國(guó)，abcam公司，批號(hào)：AB-6154，AB-3325，AB-0013）。

1.3 主要儀器 BX53顯微鏡（日本奧林巴斯公司）；ZS-Morris水迷宮視頻跟蹤系統(tǒng)（北京眾實(shí)科技有限公司）；伯樂(lè)1681130 imark全自動(dòng)酶標(biāo)儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；伯樂(lè)Mini-PRO TEAN電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司）；JD-CW96熒光定量PCR儀（山東競(jìng)道光電科技有限公司）；LAS 4000成像系統(tǒng)（美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司）。

1.4 造模與分組 選取健康SD大鼠60只，適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，根據(jù)隨機(jī)數(shù)字表法將大鼠隨機(jī)分成假手術(shù)組、模型組、陽(yáng)性對(duì)照組（艾司西酞普蘭，10 mg/kg），以及預(yù)知子提取物低（25 mg/kg）、中（50 mg/kg）、高（100 mg/kg）劑量組，其中預(yù)知子提取物各劑量組藥物均以預(yù)知子提取物質(zhì)量計(jì)算，每組10只[9]。大鼠禁食、禁水12 h后，腹腔注射1%戊巴比妥鈉（0.1 mL/kg）麻醉，消毒大鼠頸部皮膚，手術(shù)刀沿頸部正中線(xiàn)切開(kāi)皮膚，暴露大鼠頸總動(dòng)脈，假手術(shù)組直接縫合傷口，其余各組夾閉頸總動(dòng)脈近心端，實(shí)現(xiàn)大腦動(dòng)脈阻塞，造成卒中模型，然后縫合創(chuàng)口，并注射青霉素預(yù)防大鼠感染死亡，建模24 h后采用改良神經(jīng)功能缺損嚴(yán)重程度（mNSS）量表對(duì)大鼠進(jìn)行評(píng)分，mNSS評(píng)分≥2分即表示建模成功[10]。

1.5 實(shí)驗(yàn)給藥 建模成功后，預(yù)知子各劑量組和陽(yáng)性對(duì)照組大鼠分別灌胃相應(yīng)的藥物，模型組和假手術(shù)組灌胃相同體積的生理鹽水，持續(xù)21 d。

1.6 觀察指標(biāo)

1.6.1 Morris水迷宮實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)前準(zhǔn)備一個(gè)2 m×2 m的水池，將水池分成4個(gè)象限，并放置一個(gè)平臺(tái)，隨機(jī)將本實(shí)驗(yàn)的大鼠放在水池內(nèi)，記錄每只大鼠游到平臺(tái)上的用時(shí)，若用時(shí)大于60 s，則直接將這只大鼠放置在平臺(tái)上10 s。本實(shí)驗(yàn)連續(xù)進(jìn)行5 d，每天進(jìn)行兩次，取平均值為當(dāng)日大鼠的逃逸時(shí)間。

1.6.2 大鼠腦組織病理結(jié)構(gòu)觀察 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，采?%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，麻醉后取大鼠腦組織，將其中一半放入福爾馬林溶液中浸泡48 h，浸泡后制作組織蠟塊并切片，最后應(yīng)用HE染色法進(jìn)行染色，顯微鏡下觀察。

1.6.3 大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6水平檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)?zāi)┢?，采?%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉大鼠，采用非抗凝管取大鼠全血3 mL，4 ℃，2 500 r/min離心15 min（離心半徑10 cm），取上清液于一支新的離心管中，置于-80 ℃保存，備用。采用ELISA法檢測(cè)血清中TNF-α、IL-1β和IL-6的水平，根據(jù)ELISA試劑盒說(shuō)明書(shū)，對(duì)血清樣本進(jìn)行處理后，采用全自動(dòng)酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處檢測(cè)樣本吸光度，并根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)來(lái)計(jì)算樣品中TNF-α、IL-1β和IL-6的濃度。

1.6.4 總RNA提取及RT-qPCR 根據(jù)RNA提取試劑盒提取海馬組織總RNA，然后反轉(zhuǎn)錄生成cDNA并在-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆?。配置體系：引物2.25 μL，cDNA3.0 μL，SYBR Green qPCR SuperMix 17.25 μL，去酶水7.5 μL，每個(gè)樣品設(shè)置6各復(fù)孔。PCR條件：94 ℃，12 min；96 ℃，12 s；62 ℃，25 s；72 ℃，40 s；共35個(gè)循環(huán)。采用2-ΔΔct法進(jìn)行計(jì)算，并分析mRNA表達(dá)。引物序列，PI3K：5’-ATGCACCGCGACTGATAGTCGC-3’，5’-TTCGCGTAGTGC TGATGCA-3’；Akt：5’-GCGGCTAGTGCTGATGTGCTGTA-3’，5’-CGTGATGTAGCTATGCTAGG-3’；GAPDH：5’-ATGCGTTT GAGAGCTCAGG-3’，5’-TTCAGCTGCATCGACGAT-3’。計(jì)算各組大鼠海馬組織PI3K mRNA、Akt mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.6.5 大鼠PI3K、Akt蛋白水平檢測(cè) 處死大鼠步驟同上，取一側(cè)大鼠海馬組織放入玻璃研磨器中，配置蛋白酶K溶液（1 mL PBS加入100 μL蛋白酶K），加入1 mL蛋白酶K溶液充分研磨，3 000 r/min 4℃條件下離心20min（離心半徑10 cm），上清轉(zhuǎn)移至1.5mL EP管，采用蛋白檢測(cè)試劑盒進(jìn)行蛋白定量，并使每管蛋白濃度為3 μg/mL后進(jìn)行電泳，經(jīng)SDS-PAGE電泳分離、轉(zhuǎn)模和封閉后用特異性抗體PI3K、Akt和β-actin（抗體稀釋濃度1∶5000）在4 ℃條件下孵育12 h，孵育后的條帶清洗3次（1%吐溫），加入二抗（山羊抗兔，稀釋濃度1∶1 000）孵育2 h，LAS 4 000成像并觀察結(jié)果。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料符合正態(tài)分布以“均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差”（）表示，多組比較采用單因素方差分析，并采用LSD-t法進(jìn)行兩兩比較，P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 預(yù)知子提取物對(duì)大鼠Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠逃逸時(shí)間顯著增加（P＜0.05）；在給予預(yù)知子提取物和艾司西酞普蘭干預(yù)后，與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和預(yù)知子提取物各劑量組大鼠逃逸時(shí)間顯著降低（P＜0.05），且預(yù)知子提取物各劑量組具有劑量依賴(lài)性（P＜0.05）；預(yù)知子提取物高劑量組大鼠逃逸時(shí)間與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表1）

表1 各組大鼠逃逸時(shí)間比較 （，s）

表1 各組大鼠逃逸時(shí)間比較 （，s）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與預(yù)知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預(yù)知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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2.2 大鼠腦組織病理結(jié)果 假手術(shù)組大鼠腦組織未見(jiàn)明顯異常，模型組大鼠腦組織伴有大量炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，細(xì)胞變形，邊界不清，鏡下發(fā)現(xiàn)部分區(qū)域有出血點(diǎn)，在給予大鼠預(yù)知子提取物和艾司西酞普蘭干預(yù)后，以上病理狀態(tài)均有所緩解，其中陽(yáng)性對(duì)照組和預(yù)知子提取物高劑量組最為明顯。（見(jiàn)圖1）

圖1 各組大鼠腦組織病理切片圖 （HE，×200）

圖2 各組大鼠PI3K、Akt 蛋白表達(dá)Western blotting 圖

2.3 預(yù)知子提取物對(duì)大鼠血清炎癥因子的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和預(yù)知子提取物各劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著降低（P＜0.05），且預(yù)知子提取物各劑量組具有劑量依賴(lài)性；預(yù)知子提取物高劑量組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表2）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比較（，pg/mL）

表2 各組大鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-6比較（，pg/mL）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與預(yù)知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預(yù)知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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2.4 預(yù)知子提取物對(duì)大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和預(yù)知子提取物各劑量組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA均顯著降低（P＜0.05），且預(yù)知子提取物各劑量組具有劑量依賴(lài)性；預(yù)知子提取物高劑量組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表3）

表3 各組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)水平比較（，2-ΔΔCT）

表3 各組大鼠PI3K mRNA、Akt mRNA表達(dá)水平比較（，2-ΔΔCT）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05;與預(yù)知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預(yù)知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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2.4 預(yù)知子提取物對(duì)大鼠PI3K、Akt蛋白表達(dá)的影響 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠PI3K、Akt蛋白表達(dá)均顯著升高（P＜0.05）；與模型組比較，陽(yáng)性對(duì)照組和預(yù)知子提取物各劑量組大鼠PI3K、Akt蛋白表達(dá)均顯著降低（P＜0.05），且預(yù)知子提取物各劑量組具有劑量依賴(lài)性；預(yù)知子提取物高劑量組大鼠PI3K、Akt蛋白表達(dá)與陽(yáng)性對(duì)照組比較，差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。（見(jiàn)表4）

表4 各組大鼠PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平比較 （，2-ΔΔCT）

表4 各組大鼠PI3K、Akt 蛋白表達(dá)水平比較 （，2-ΔΔCT）

注：與假手術(shù)組比較，aP＜0.05；與模型組比較，bP＜0.05；與陽(yáng)性對(duì)照組比較，cP＜0.05；與預(yù)知子提取物低劑量組比較，dP＜0.05；與預(yù)知子提取物中劑量組比較，eP＜0.05。

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3 討論

卒中的部位、性質(zhì)、患者年齡、性別、機(jī)體健康狀況、家庭等均是卒中后失眠發(fā)生的重要影響因素[11]。目前對(duì)卒中后失眠的患者的研究調(diào)查普遍認(rèn)為神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂會(huì)導(dǎo)致卒中患者失眠的風(fēng)險(xiǎn)增加[12]。而炎癥反應(yīng)的發(fā)生可能是引起機(jī)體神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂的重要因素之一[13]。先前的研究[14]表明，中藥治療可以抑制機(jī)體炎癥反應(yīng)，降低炎癥因子表達(dá)水平，如TNF-α、IL-1β和IL-6，逆轉(zhuǎn)了海馬線(xiàn)粒體功能障礙并抑制了炎癥反應(yīng)發(fā)生。此外，中藥治療可減少卒中大鼠海馬區(qū)的凋亡細(xì)胞數(shù)量，從而緩解卒中引起的神經(jīng)功能損傷，有利于疾病的恢復(fù)[15]。本研究中筆者基于預(yù)知子提取物的神經(jīng)調(diào)節(jié)作用，采用其作為卒中后失眠大鼠的干預(yù)藥物，結(jié)果顯示，在構(gòu)建卒中后失眠大鼠模型后，通過(guò)mNSS評(píng)分發(fā)現(xiàn)大鼠出現(xiàn)了神經(jīng)功能損傷，同時(shí)通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)大鼠的學(xué)習(xí)和記憶功能均受到了一定程度的損傷。在給予大鼠預(yù)知子提取物治療后，可顯著改善大鼠神經(jīng)功能受損情況，同時(shí)大鼠學(xué)習(xí)和記憶能力也得到了大幅改善，提示預(yù)知子提取物對(duì)于卒中后失眠大鼠神經(jīng)功能具有較好的治療作用，同時(shí)可有效提高其學(xué)習(xí)記憶能力，這可能與預(yù)知子提取物能有效提高神經(jīng)遞質(zhì)蛋白親和力，改善神經(jīng)系統(tǒng)功能有關(guān)。

炎癥反應(yīng)是大多數(shù)疾病的主要影響因素，因此本研究檢測(cè)了各組大鼠血清的炎癥因子TNF-α、IL-1β和IL-6。TNF-α是體內(nèi)一種重要的促炎性細(xì)胞因子，在多種生理反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，如炎癥介質(zhì)的合成和釋放、中性粒細(xì)胞在肺部的積聚和補(bǔ)體激活[16]。IL-6是免疫調(diào)節(jié)重要的影響因子。研究表明，IL-6的表達(dá)水平可反映機(jī)體炎癥反應(yīng)程度，具有催化和放大炎癥反應(yīng)的作用，因此臨床常作為急慢性炎癥診斷指標(biāo)[17]。IL-1β是一種重要的炎癥因子，可誘導(dǎo)產(chǎn)生和釋放多種炎癥因子[18]。本研究結(jié)果顯示，當(dāng)大鼠發(fā)生卒中后，其血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著升高，提示此時(shí)大鼠炎癥反應(yīng)加劇，在給予預(yù)知子提取物治療后，血清TNF-α、IL-1β和IL-6均顯著降低，同時(shí)結(jié)合各組大鼠病理結(jié)果，發(fā)現(xiàn)預(yù)知子提取物各劑量組大鼠腦組織炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)明顯減少，表明預(yù)知子提取物可通過(guò)降低機(jī)體血清TNF-α、IL-1β和IL-6表達(dá)水平，減緩炎癥反應(yīng)，從而達(dá)到恢復(fù)大鼠神經(jīng)功能的功效。

眾所周知，PI3K/Akt通路在包括細(xì)胞增殖、遷移和凋亡等生物學(xué)過(guò)程中具有重要作用[19]。此外，它還與許多人類(lèi)炎癥疾病有關(guān)，PI3K/Akt通路的激活，可引起炎癥基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)，從而導(dǎo)致大量炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生，如TNF-α、IL-1β和IL-6，提示PI3K/Akt通路在機(jī)體炎癥發(fā)展中具有重要作用[20]。本研究構(gòu)建了卒中后失眠大鼠模型，根據(jù)PCR和蛋白免疫印跡結(jié)果發(fā)現(xiàn)PI3K/Akt信號(hào)通路被激活，而預(yù)知子提取物的治療抑制了PI3K/Akt信號(hào)通路，同時(shí)機(jī)體炎癥反應(yīng)減弱，提示預(yù)知子提取物可能通過(guò)抑制PI3K/Akt信號(hào)通路蛋白相關(guān)表達(dá)，降低機(jī)體炎癥反應(yīng)，達(dá)到治療效果。

綜上所述，預(yù)知子提取物可有效改善卒中后失眠模型大鼠的神經(jīng)功能損傷，其機(jī)制可能與抑制PI3K/Akt信號(hào)通路，下調(diào)炎癥因子表達(dá)，減弱機(jī)體炎癥反應(yīng)有關(guān)。