魯 猛，王 剛，賈洪艷，李 洋，張 磊，張秋學，李學峰，王 娜

（1．滄州市中心醫(yī)院，河北 滄州 061000；2．河北醫(yī)科大學，河北 石家莊 050011）

肝細胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是常見的惡性腫瘤，在世界范圍內(nèi)致死率排第二位。我國肝癌發(fā)病率與死亡率較高。目前HCC的治療主要以手術為主，輔以放化療的方式，但肝癌惡性程度高，術后復發(fā)與轉移率高，患者預后較差，亟需尋找新的治療藥物與治療靶點[1-2]。細胞自噬與肝癌發(fā)生、轉移、靶向治療和耐藥密切相關，調(diào)節(jié)自噬是治療HCC與減少耐藥的新策略[3]。姜黃素（curcumin，Cur）是植物姜黃的提取物，具有抑制肝癌細胞增殖、誘導細胞周期阻滯與細胞凋亡、抗腫瘤的作用[4]。Wnt/β-連環(huán)蛋白（β-Catenin）信號通路與腫瘤惡性進展和耐藥性有關，B細胞淋巴瘤因子9（B-cell lymphoma factor 9，BCL9）是β-Catenin的共激活因子。BCL9能促進β-Catenin通路激活，促進乳腺癌生長、侵襲和轉移[5]。研究顯示，姜黃素能通過激活自噬，下調(diào)磷脂酰肌醇蛋白聚糖3（glypican-3，GPC3）/Wnt/β-Catenin信號通路抑制HCC腫瘤生長[6]。故本研究以β-Catenin/BCL9通路為切入點，從細胞自噬角度，探討姜黃素治療肝癌的機制。

1 材料

1.1 細胞 肝癌細胞HepG2（批號：TCHu 72）購自上海中科院細胞庫。

1.2 主要試劑與儀器 姜黃素（批號：C1386）購自sigma公司；自噬抑制劑3-MA（批號：S276713，純度：99.97%）購自Selleck；Lipo6000TM轉染試劑（批號：C0526）、Annexin V-FITC細胞凋亡檢測試劑盒（批號：C1062S）購自碧云天生物科技有限公司；質(zhì)粒對照（VEC）（批號：2201051）、Bcl9過表達質(zhì)粒（OE-Bcl9）（批號：2201052）、shRNA慢病毒載體陰性對照（Sh-NC）（批號：2201061）及shRNA Bcl9慢病毒載體（Sh-Bcl9）（批號：2201062）均購自云舟生物科技股份有限公司；雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3（批號：HB5421）購自漢恒生物科技（上海）有限公司；微管相關蛋白1輕鏈3B抗體（LC3B）（批號：ab221794）、自噬關鍵分子酵母Atg6同系物抗體（Beclin1）（批號：ab207612）、波形蛋白抗體（Vimentin）（批號：ab137321）、E-鈣黏蛋白抗體（E-cadherin）（批號：ab40772）、β-Catenin抗體（批號：ab224803）、BCL9抗體（批號：ab113110）均購自Abcam公司。

流式細胞儀（型號：CytoFLEX）購自貝克曼庫爾特商貿(mào)（中國）有限公司；光學顯微鏡（型號：WYS-100C）購自天津微儀光學儀器有限公司；透射電子顯微鏡（型號：Titan KriosG2）購自蘇州佐藤精密儀器有限公司；組織包埋機（型號：HistoStar）購自江蘇維林科生物技術有限公司；超薄切片機（型號：UM10）購自江蘇雷博科學儀器有限公司；激光共聚焦顯微鏡（型號：LSM 980 with Airyscan）購自武漢世百瑞科技有限公司；自動凝膠成像分析儀（型號：Tanon 3500）購自蘇州阿爾法生物實驗器材有限公司。

2 方法

2.1 細胞處理及分組 HepG2細胞生長至對數(shù)期時，將HepG2細胞分為對照組（Control組）、Cur組、Cur+自噬抑制劑組（Cur+3-MA組）、Cur+質(zhì)粒對照組（Cur+VEC組）、Cur+Bcl9過表達組（Cur+OE-BCL9組）、Cur+shRNA慢病毒載體陰性對照組（Cur+Sh-NC組）、Cur+shRNA Bcl9慢病毒載體組（Cur+Sh-BCL9組），除Control組外，其余各組均使用20.0 μmol/L[7]的Cur 預處理24 h，Cur+3-MA 組使用20.0 μmol/L 的Cur 與5.0 mmol/L[8]的3-MA共同處理24 h，Cur+VEC組、Cur+OE-BCL9組、Cur+Sh-NC組、Cur+Sh-BCL9組使用20.0 μmol/L的Cur預處理24 h后再進行質(zhì)粒轉染。

2.2 細胞凋亡檢測 HepG2細胞（1×105個/mL）接種至6孔板中，按“2.1”的分組進行處理，培養(yǎng)24 h后，調(diào)整細胞濃度為4×105個/mL，流式管分別加入20 μL Annexin V-FITC，再加入100 μL細胞懸液，室溫避光孵育10 min，加入20 μL PI，室溫避光10 min，流式細胞儀檢測細胞凋亡。

2.3 細胞遷移與侵襲檢測 （1）遷移實驗：Transwell小室置于24孔板孔內(nèi)，下室加入500 μL完全細胞培養(yǎng)液，各組細胞使用無血清培養(yǎng)基制成2×106個/mL的細胞懸液，上室加入200μL細胞懸液，培養(yǎng)48 h，PBS洗滌，95%乙醇固定，結晶紫染色，晾干后樹脂封片，鏡檢，每孔隨機選取5個視野計算細胞數(shù)量。（2）侵襲實驗：Transwell小室上室使用Matrigel基質(zhì)膠包被，其余步驟同遷移實驗。

2.4 自噬體觀察 各組細胞使用胰酶消化后，1 200 r/min離心10 min（離心半徑：13.5 cm）收集細胞，依次用2.5%戊二醛和1%四氧化鋨固定1 h，乙醇脫水后用丙酮置換2次，然后包埋在Epon樹脂中，切成50 nm切片，3%醋酸鈾酰和檸檬酸鉛雙重染色15 min，透射電子顯微鏡觀察自噬體。

2.5 自噬體水平檢測 將各組HepG2細胞接種到35 mm激光共聚焦培養(yǎng)皿中，細胞生長至對數(shù)期時，采用1/2體積感染法將雙標腺病毒mRFP-GFP-LC3轉染細胞，感染復數(shù)（MOI）值為200，感染36 h后，觀察熒光表達狀況，并拍照記錄保存。

2.6 自噬（LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1）、上皮間質(zhì)轉化（Vimentin、Ecadherin）、β-Catenin/BCL9通路（BCL9、β-Catenin）相關蛋白相對表達量 采用蛋白提取試劑盒提取各組細胞總蛋白，BCA法蛋白定量后，10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉印至硝酸纖維素膜（80 V，90 min），在5%脫脂奶粉中室溫封閉1 h。將膜與LC3 Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Vimentin、E-cadherin、β-Catenin、BCL9、β-actin一抗（均按照1∶1 000稀釋）在4 ℃孵育過夜，用0.1%Tween 20-Tris-緩沖鹽水（TBST）洗滌3次，每次10 min；加入二抗（1∶2 000稀釋）室溫孵育1 h。再次用TBST洗滌3次，每次10 min，化學發(fā)光法進行顯影，然后用自動凝膠成像分析儀拍照并分析。目的蛋白表達水平以目的條帶灰度值與內(nèi)參（β-actin）條帶灰度值的比值表示。

2.7 統(tǒng)計學方法 采用SPSS 25.0統(tǒng)計分析，符合正態(tài)分布且方差齊的計量資料以（）表示，多組比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

3 結果

3.1 各組HepG2細胞凋亡率比較 Cur組細胞凋亡率明顯高于Control組（P＜0.05）；Cur+3-MA組細胞凋亡率明顯低于Cur組（P＜0.05），Cur+OE-BCL9組細胞凋亡率明顯低于Cur+VEC組（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9組細胞凋亡率明顯高于Cur+Sh-NC組（P＜0.05）。（見圖1～2）

圖1 Cur 對HepG2 細胞凋亡的影響

圖1 各組HepG2 細胞凋亡率比較 （，n=6）

3.2 各組HepG2遷移與侵襲細胞數(shù)比較 Cur組細胞遷移與侵襲細胞數(shù)明顯低于Control組（P＜0.05）；Cur+3-MA組細胞遷移與侵襲細胞數(shù)明顯高于Cur組（P＜0.05）；Cur+OE-BCL9組細胞遷移與侵襲細胞數(shù)明顯高于Cur+VEC組（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9組細胞遷移與侵襲細胞數(shù)明顯低于Cur+Sh-NC組（P＜0.05）。（見圖3～4）

圖3 Cur 對HepG2 遷移與侵襲的影響 （×200）

圖4 各組HepG2 遷移與侵襲細胞數(shù)比較 （，n=6）

3.3 各組細胞自噬體形成比較 透射電子顯微鏡觀察結果顯示，Control組線粒體結構正常，無自噬體與自噬溶酶體形成；Cur組、Cur+VEC組、Cur+Sh-NC組細胞線粒體腫脹，出現(xiàn)大量自噬體；Cur+3-MA組自噬體少于Cur組；Cur+OE-BCL9組自噬體少于Cur+VEC組；Cur+Sh-BCL9組自噬體多于Cur+Sh-NC組。（見圖5）

圖5 透射電子顯微鏡觀察各組HepG2細胞的自噬體（×20000）

3.4 各組細胞自噬水平比較 GFP-LC3雙熒光質(zhì)粒轉染細胞后，激光共聚焦顯微鏡觀察顯示，Control組有少量綠色斑點（自噬小體）與紅色斑點（自噬溶酶體）；Cur組、Cur+VEC組、Cur+Sh-NC組顯示大量綠色與紅色，表明有大量自噬小體與自噬溶酶體形成；Cur+3-MA組綠色斑點與紅色斑點少于Cur組，自噬小體減少；Cur+OE-BCL9組細胞綠色與紅色斑點減少，自噬小體少于Cur+VEC組；Cur+Sh-BCL9組細胞綠色與紅色斑點增多，自噬小體多于Cur+Sh-NC組。（見圖6）

圖6 激光共聚焦顯微鏡觀察各組細胞自噬水平（63×油浸物鏡）

3.5 各組細胞自噬及上皮間質(zhì)轉化（EMT）相關蛋白相對表達量比較 Cur組LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相對表達量明顯高于Control組（P＜0.05），Vimentin蛋白相對表達量低于Control組（P＜0.05）；Cur+3-MA組LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相對表達量明顯低于Cur組（P＜0.05），Vimentin蛋白相對表達量明顯高于Cur組（P＜0.05）；Cur+OE-BCL9組LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相對表達量明顯低于Cur+VEC組（P＜0.05），Vimentin蛋白相對表達量明顯高于Cur+VEC組（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9組LC3Ⅱ/Ⅰ及Beclin1、E-cadherin蛋白相對表達量明顯高于Cur+Sh-NC組（P＜0.05），Vimentin蛋白相對表達量明顯低于Cur+Sh-NC組（P＜0.05）。（見圖7～8）

圖7 LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、Vimentin、E-cadherin 蛋白表達Western blotting 圖

圖8 各組細胞自噬及EMT 相關蛋白相對表達量比較（，n=6）

3.6 各組細胞BCL9、β-Catenin蛋白相對表達量比較 Cur組BCL9、β-Catenin蛋白相對表達量明顯低于Control組（P＜0.05）；Cur+3-MA組BCL9、β-Catenin蛋白相對表達量高于Cur組（P＜0.05）；Cur+OE-BCL9組β-Catenin、BCL9蛋白相對表達量明顯高于Cur+VEC組（P＜0.05）；Cur+Sh-BCL9組BCL9、β-Catenin蛋白相對表達量明顯低于Cur+Sh-NC組（P＜0.05）。（見圖9～10）

圖9 各組HepG2 細胞BCL9、β-Catenin 蛋白表達Western blotting 圖

圖10 各組HepG2 細胞BCL9、β-Catenin 蛋白相對表達量比較 （，n=6）

4 討論

細胞自噬是維持細胞穩(wěn)態(tài)的重要機制，自噬與腫瘤發(fā)生發(fā)展和耐藥密切相關。自噬對肝癌的進展具有促進與抑制的雙重作用，臨床可根據(jù)自噬的作用制定靶向治療HCC的策略[9-10]。姜黃素是姜黃的主要成分，對鼻咽癌、結腸癌、乳腺癌、肺癌等多種腫瘤均有抑制作用。姜黃素的抗腫瘤機制與抑制血管生成、調(diào)節(jié)細胞自噬、調(diào)節(jié)基因表達（如p53、Cyclin D等）相關[11-12]。研究[13]顯示，姜黃素與5-氟尿嘧啶聯(lián)用可促進肝癌細胞自噬，抑制細胞增殖。本研究顯示，20 μmol/L的姜黃素處理HepG2細胞后，自噬小體形成與細胞凋亡率升高，且姜黃素與自噬抑制劑聯(lián)合使用，可明顯降低HepG2細胞自噬小體形成與細胞凋亡，提示姜黃素可誘導細胞自噬小體形成與凋亡。

LC3Ⅱ與Beclin1是自噬相關標志物，LC3主要介導自噬體的成熟，其水平的高低與自噬體的數(shù)量有關，LC3Ⅱ/Ⅰ比值越高表示自噬活性越強[14-15]。Beclin1蛋白可調(diào)控自噬前體的形成，引導自噬相關蛋白的定位。Beclin1與相關蛋白形成復合體后，可促進三磷酸磷脂酰肌醇的產(chǎn)生，促進自噬小體的形成[16]。自噬在腫瘤轉移過程中發(fā)揮重要作用，EMT是癌癥轉移與侵襲的重要中間階段，E-cadherin參與調(diào)節(jié)細胞間黏附作用，Vimentin可維持細胞的完整性和細胞骨架的穩(wěn)定性，E-cadherin水平降低、Vimentin水平升高是EMT的標志[17]。研究[18]顯示，核心蛋白聚糖通過c-Met/Akt/mTOR軸誘導自噬來抑制膠質(zhì)瘤的侵襲和EMT表型。本研究結果顯示，20 μmol/L的姜黃素處理HepG2細胞后，LC3Ⅱ/Ⅰ、Beclin1、E-cadherin表達水平明顯升高，細胞遷移與侵襲數(shù)及Vimentin蛋白表達水平明顯降低，而自噬抑制劑可逆轉這一行為，表明姜黃素能通過誘導細胞自噬與凋亡，抑制肝癌細胞轉移、侵襲與EMT。

β-Catenin是Wnt通路中Wnt靶基因表達最重要的效應因子。Wnt/β-Catenin信號通路參與調(diào)控腫瘤細胞的增殖、凋亡、轉移和侵襲，與腫瘤的發(fā)生、發(fā)展及化療耐藥性密切相關[19]。β-Catenin的激活可促進肝細胞癌的免疫逃逸及增強化療藥物耐藥性，從而導致治療失敗[20-21]。BCL9屬于Bcl家族成員，β-Catenin需要募集BCL9以介導轉錄，BCL9可通過β-Catenin途徑促進腫瘤細胞的EMT與侵襲[22]。研究[23]顯示，BCL9在HCC中表達水平升高，而敲除BCL9基因后，細胞凋亡率明顯升高。β-Catenin/BCL9通路在腫瘤的生長與轉移過程中發(fā)揮重要調(diào)控作用[5]。有研究[24]顯示，BCL9還與腫瘤細胞自噬有關，下調(diào)BCL-9的表達可誘導膠質(zhì)瘤細胞的凋亡和自噬。本研究顯示，姜黃素可明顯下調(diào)HepG2細胞β-Catenin、BCL9表達水平，提示姜黃素可抑制β-Catenin/BCL9通路激活。過表達BCL9后，HepG2細胞自噬體及遷移與侵襲能力增強，凋亡減少，可減弱姜黃素對HepG2惡性進展的抑制作用，且抑制BCL9表達可促進姜黃素對HepG2惡性進展的抑制作用，表明姜黃素可能通過抑制β-Catenin/BCL9通路，誘導細胞自噬，抑制肝癌細胞遷移、侵襲與EMT。

綜上所述，姜黃素能通過抑制β-Catenin/BCL9信號通路，誘導細胞自噬，抑制HepG2細胞惡性生物學行為。