吳 植，黃 佳，吳 雙，謝 軍，顧陳怡，徐 艷，張 聰，袁慧莎

（江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學(xué)院 江蘇省獸用生物制藥高技術(shù)研究重點實驗室江蘇現(xiàn)代畜牧與新獸藥工程技術(shù)中心，江蘇 泰州 225300）

禽腺病毒(Fowl adenovirus,FAdV)歸屬于腺病毒科禽腺病毒屬，因為群特異性抗原不同分為三群。我國流行的禽腺病毒以I 群禽腺病毒（Fowl aviadenovirusgroupⅠ,FAdV-Ⅰ）為主，發(fā)病率逐年增加。Ⅰ群禽腺病毒有12 個血清型(FAdV 1-12)，近幾年我國主要流行的禽腺病毒血清型為FAdV-4、FAdV-8a、FAdV-8b 和FAdV-11 型，其中由血清4型I 群禽腺病毒（FAdV-4）引起的雞心包積水- 肝炎綜合征(IBH-HPS)對家禽養(yǎng)殖危害最大。由于不同血清型的混合感染以及與其他病毒形成混合感染和繼發(fā)感染，其復(fù)雜性對疫苗的研制以及對防控FAdV-4 產(chǎn)生較大困難，給國內(nèi)養(yǎng)雞行業(yè)帶來嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。本研究對廣西送檢疑似感染4 型禽腺病毒病死雞組織通過病毒分離，PCR 擴(kuò)增與序列測定，確定分離出一株血清4 型禽腺病毒并進(jìn)行了動物回歸試驗，為臨床開展該病的綜合防控提供了一定的技術(shù)指導(dǎo)。

1 材料和方法

1.1 病料來源及試驗動物2021 年廣西送檢一份疑似血清4 型禽腺病毒感染的患病雞；SPF 種雞蛋購自山東昊泰實驗動物繁育有限公司，由本實驗室自行孵化至7 日齡或出雛，雛雞轉(zhuǎn)移隔離器中飼養(yǎng)。

1.2 主要試劑Viral RNA/DNA Kit DNA/RNA提取試劑盒購自CWBIO，2×Taq Master Mix、Fast-Pure Gel DNA Extraction Mini Kit 凝膠回收試劑盒、FastPure plasmid Mini Kit 質(zhì)粒提取試劑盒購自南京諾唯贊生物科技有限公司，DNA marker 購自Solarbio，VETEC 瓊脂粉購自上海百研生物科技有限公司，克隆載體T-easy 購自Promega 公司，E.coli DH5α 購自寶生物工程（大連）有限公司。

1.3 病毒分離無菌采取0.3 g 病死雞肝臟，放入裝有碾磨珠和900 μLPBS 緩沖液的滅菌碾磨管中，經(jīng)FastPrep-24TM5G 高速勻漿儀研磨1 min，反復(fù)凍融3 次，5000 rpm，離心10 min，取組織研磨上清液用0.22 μm 無菌濾器過濾除菌，采用卵黃囊接種方法接種7 日齡SPF 雞胚，0.2 mL/枚，37 ℃孵育，照蛋2 次/d，剔除24 h 內(nèi)死亡雞胚，繼續(xù)孵化至5 d，將未死亡雞胚在4 ℃條件下放置4 h 以上，收集雞胚的尿囊液用0.22 μm 無菌濾器過濾再次接種7 日齡SPF 雞胚，連續(xù)盲傳3 代，收集尿囊液離心取上清液通過PCR 方法進(jìn)行病毒鑒定。

1.4 血凝實驗取50 μL 尿囊液于96 孔血凝板中，依次用生理鹽水進(jìn)行倍比稀釋至11 孔，棄去液體，第12 孔加50 μL 生理鹽水做陰性對照，每孔加入50 μL 的1%新鮮制備的雞紅細(xì)胞，37℃反應(yīng)30 min 后觀察結(jié)果，觀察尿囊液是否具有凝集紅細(xì)胞的能力。

1.5 PCR 鑒定與序列測定根據(jù)GenBbank 發(fā)表的Hexon 保守序列設(shè)計引物，F(xiàn)AdV-F：CAACTACATCGGGTTCAGGGATAACTTC，F(xiàn)AdV-2：CCAGTT TCTGTGGTGGTTGAAGGGGTT，引物由上海生工生物工程股份有限公司合成。參照DNA/RNA 提取試劑盒說明書進(jìn)行尿囊液病毒基因組提取，取2 μL病毒DNA 為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。反應(yīng)體系為25 μL：2×Taq Master Mix12.5 μL，上游引物和下游引物各1 μL(20μmoL/L）、病毒基因組2 μL、滅菌水8.5 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min；4 ℃保存。PCR 產(chǎn)物于100 V電壓下經(jīng)1.5%瓊脂糖凝膠進(jìn)行核酸電泳，觀察目的片段大小。將純化的目的片段克隆至pGEM T-easy載體，將重組質(zhì)粒送南京擎科生物科技有限公司測序，對測序結(jié)果通過DNAStar 軟件進(jìn)行同源性分析。

1.6 動物回歸實驗以0.2 mL/只的劑量將接毒收集到的尿囊液以肌肉注射方式接種5 只3 周齡SPF 雛雞，另設(shè)對照組5 只以0.2 mL/只的劑量肌肉注射PBS 緩沖液，接毒組與對照組分籠隔離飼養(yǎng)，每日觀察記錄雞的臨床表現(xiàn)和發(fā)病情況，連續(xù)觀察10 d。取死亡雞肝臟組織進(jìn)行研磨了提取病毒核酸進(jìn)行PCR 鑒定。

2 結(jié) 果

2.1 病毒分離將研磨好的組織上清液接種卵黃囊盲傳三代，雞胚在24 h 后出現(xiàn)死亡，48～72 h 為死亡高峰期。死亡雞胚主要表現(xiàn)皮下、背部出血，胚體小于同日齡正常雞胚，生長發(fā)育緩慢（圖1）。

圖1 雞胚組織病變

2.2 血凝實驗通過尿囊液進(jìn)行血凝實驗，結(jié)果顯示收獲的尿囊液不能使1%雞紅細(xì)胞凝集，排除了禽流感、新城疫等血凝性病毒的感染。

2.3 PCR 鑒定瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示（圖2），病料接種雞胚收集的尿囊液經(jīng)PCR 擴(kuò)增得到的條帶長度約667 bp，與預(yù)期擴(kuò)增條帶大小相符，送檢發(fā)病雞感染了禽腺病毒。

圖2 尿囊液PCR 檢測結(jié)果

2.4 測序與同源性分析測序成功的基因序列與GenBank 上禽腺病毒參考株的序列進(jìn)行比較分析。結(jié)果顯示，分離株與GenBank 上4 型FAdV 參考株同源性達(dá)99.2%，證實分離得到的毒株為血清4 型FAdV，將此毒株命名為GX20210602。

2.5 動物回歸實驗SPF 雞接種病毒后2 d 內(nèi)無明顯臨床癥狀。第3 d 有雛雞出現(xiàn)精神沉郁，不喜動，并出現(xiàn)雛雞死亡，死雞剖檢可見淡黃色透明心包積液，腎臟微微腫大，肝臟出血腫大，邊緣呈土黃色（圖3）。采集病死雞和攻毒第5 d 的雞肝臟，提取病毒核酸后進(jìn)行PCR 鑒定，PCR 結(jié)果顯示病死雞檢測陽性，對照組為陰性。

圖3 剖檢組織病變

3 討 論

Ⅰ群禽腺病毒是國內(nèi)家禽與野禽常見的傳染性病原，血清4 型禽腺病毒在國內(nèi)流行的Ⅰ群腺病毒占主要地位，雞心包積水- 肝炎綜合征是血清4型的顯著特征，主要感染3～5 周齡的雛雞，常呈隱性感染，感染雞群免疫力下降，易于其他病毒形成混合感染，造成死亡率升高。研究證明腺病毒在肝臟，胰腺和腸管容易繁殖存活，Ⅰ群禽腺病毒可在雞胚中繁殖，矯海婷等發(fā)現(xiàn)卵黃囊中的存在病毒滴度最高。本研究對送檢有心包積液、肝炎臨床癥狀，疑似感染FAdV-4 病料對肝組織研磨上清液，采用卵黃囊接種雞胚方式進(jìn)行擴(kuò)增分離得到病毒，對分離毒株進(jìn)行病毒鑒定，測序分析等一系列實驗。

隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展，PCR 方法因敏感性、檢測效率高，在檢測腺病毒方面應(yīng)用廣泛。禽腺病毒為DNA 病毒，六鄰體蛋白(Hexon)是最主要的結(jié)構(gòu)蛋白，對致病性密切相關(guān)，由于不同血清型病毒的Hexon 基因高度保守，根據(jù)Hexon 基因設(shè)計合成的特異性引物進(jìn)行PCR 檢測技術(shù)可以對不同的血清型進(jìn)行診斷。本實驗根據(jù)送檢病雞的臨床癥狀判斷FAdV-4 感染，根據(jù)Hexon 基因序列設(shè)計合成一對特異性引物，對分離毒株進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，結(jié)果顯示擴(kuò)增條帶與預(yù)期大小一致，懷疑該分離株為4 型禽腺病毒，切下目的條帶進(jìn)行純化回收，與克隆載體進(jìn)行連接轉(zhuǎn)化，提取重組質(zhì)粒，送至南京擎科生物科技有限公司進(jìn)行測序，通過與GenBank 發(fā)布的Hexon 基因序列對比，發(fā)現(xiàn)分離株與4 型FAdV 參考株序列同源性達(dá)99.2%，證明分離得到的毒株為血清4 型Ⅰ群禽腺病毒，將此毒株命名為GX20210602。對GX20210602 毒株進(jìn)行動物回歸實驗，剖檢病死雞可見肝臟出血，邊緣呈現(xiàn)土黃色，心包有淡黃色積液產(chǎn)生，腎臟腫大較明顯，實驗結(jié)果符合FAdV-4 毒株的臨床病理變化。

禽腺病毒可以垂直和水平傳播，能長期潛伏于雞群體內(nèi)及排泄物中，傳播范圍廣，對禽腺病毒的防治造成困難，這一株血清4 型禽腺病毒毒株的分離鑒定，為進(jìn)一步研制血清型疫苗，以及對禽腺病毒的防控提供材料。