洪天暢 朱恒杏 邵孟茹 潘家榮

（中國(guó)計(jì)量大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，浙江省特色農(nóng)產(chǎn)品品質(zhì)與危害物控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 310018）

鱸魚（Bass）肉味鮮美，肉質(zhì)細(xì)嫩，綜合營(yíng)養(yǎng)價(jià)值高，是“中國(guó)四大淡水名魚”之一，是人們品嘗美味、獲取優(yōu)質(zhì)蛋白的不二選擇，但其含有過敏原，可使人體產(chǎn)生過敏反應(yīng)。食物過敏是過敏人群食用某種食物引發(fā)的異常免疫反應(yīng)，醫(yī)學(xué)上過敏屬于免疫變態(tài)反應(yīng)［1］。近年來水產(chǎn)品過敏人口數(shù)量持續(xù)上升，已成為重大公共健康問題之一［2-3］。盧睿祺等［4］研究發(fā)現(xiàn)鱸魚主要過敏原是小清蛋白（parvalbumin，PV），是一種存在于魚類肌肉組織中的小型鈣結(jié)合蛋白［5］。有報(bào)道證實(shí)，導(dǎo)致70%～100%的魚類和魚制品過敏反應(yīng)的主要誘因是小清蛋白［6］，其分子量通常為10～13 kDa，等電點(diǎn)介于4.1～5.2 之間［7］。小清蛋白分子由于構(gòu)象、折疊能力和抗原表位的不同及特殊性，其經(jīng)過高溫、酸堿和各種變性劑處理后仍具有過敏性［8-10］，不同加工方式能降低魚過敏原IgE 的結(jié)合能力，但會(huì)產(chǎn)生新的具有IgE 結(jié)合能力的被修飾蛋白［11］，因此常規(guī)方法難以達(dá)到對(duì)魚肉脫敏的作用。

輻照具有促進(jìn)蛋白質(zhì)降解、交聯(lián)和分子構(gòu)象變化的作用，是有效降低食物過敏的技術(shù)，頗具應(yīng)用前景［12］。目前已有輻照水產(chǎn)品過敏原的報(bào)道［13-16］，并證實(shí)輻照可破壞水產(chǎn)品中的過敏原，其中顧可飛等［17］研究發(fā)現(xiàn)液態(tài)蝦過敏原較固態(tài)過敏原對(duì)輻照更敏感，水分子的存在會(huì)影響輻照效果。但關(guān)于輻照消減魚類過敏原的研究較少，且未見鱸魚小清蛋白輻照脫敏的相關(guān)報(bào)道。因此，本研究以實(shí)驗(yàn)室提取純化的鱸魚小清蛋白溶液及凍干粉為對(duì)象，分析不同電子束輻照劑量對(duì)不同狀態(tài)鱸魚小清蛋白生化性質(zhì)和抗原性的影響，旨在為鱸魚及其制品的消敏研究提供理論依據(jù)和技術(shù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鱸魚：市售

甘氨酸（glycine，Gly）、丙烯酰胺（acrylamide，Acr）、十二烷基磺酸鈉（sodium dodecyl sulphate，SDS）、甲叉雙丙烯酰胺（bis-acrylamide，Bis）、巰基乙醇、N，N，N，N-四甲基乙二胺（N，N，N，N-tetramethylethylenediamine，TEMED）、8- 苯氨基-1- 萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）、三羥甲基氨基甲烷［tris（hydroxymethyl）aminomethane，Tris］、弗氏完全佐劑和弗氏不完全佐劑均購(gòu)自上海麥克林生化科技股份有限公司，硝酸纖維素膜（nitrocellulose membrane，NC）、辣根過氧化物酶標(biāo)記的兔抗鼠IgG、改良型Bradford 法蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自生工生物工程（上海）股份有限公司，預(yù)染Marker 購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司，小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體PARV-19 購(gòu)自美國(guó)Sigma公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純?cè)噭?/p>

1.2 儀器與設(shè)備

DR-3000 酶標(biāo)儀，無錫華衛(wèi)德朗儀器有限公司；SpectraMax M3 熒光酶標(biāo)儀，美谷分子儀器（上海）有限公司；DZ-10/20 高能電子直線加速器，中國(guó)原子能科學(xué)研究院；MOS-500 圓二色光譜儀，英國(guó)應(yīng)用光物理公司；Watersl-class plus 高效液相色譜，沃特世科技（上海）有限公司；Thermo-QE 質(zhì)譜儀，賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；UV-5200紫外可見分光光度計(jì)，上海元析儀器有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 鱸魚小清蛋白的提取、純化與鑒定 鱸魚小清蛋白的提取參考陸宗超［18］的方法：新鮮海鱸魚去骨去鱗，制備魚糜，取10 g 魚糜用10 mmol·L-1Tris-HCl-0.5 mmol·L-1Gly-1 mmol·L-1DTT 溶液浸提，10 000 r·min-1離心20 min，取上清。鱸魚小清蛋白的純化參照馬濤等［19］的方法：上清液經(jīng)硫酸銨（60%和100%）沉淀，離心取沉淀，透析36 h，然后用DEAESepharose Fast Flow 純化得小清蛋白溶液，所得溶液等體積均分至10 份4 mL EP 管中，取其中5 份進(jìn)行凍干得凍干粉，其余直接-80 ℃凍存。輻照后的凍干粉加入10 mmol·L-1Tris-HCl 溶解至4 mL。利用免疫印跡法、紫外分光光度法及質(zhì)譜法對(duì)純化后的小清蛋白進(jìn)行鑒定。

1.3.2 多克隆抗體的制備與效價(jià)測(cè)定 參照孫登瑤［20］的方法進(jìn)行小清蛋白多克隆抗體制備：小鼠皮下多點(diǎn)注射，每只100 μg，每2周免疫1次，免疫后1周采血測(cè)效價(jià)，共免疫7 次，免疫后小鼠進(jìn)行眼球取血，間接酶聯(lián)免疫法吸附測(cè)定（enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA）法檢測(cè)抗血清的效價(jià)，血液于3 000 r·min-1離心5 min，上清于-40 ℃保存。

1.3.3 輻照處理 取小清蛋白溶液和小清蛋白凍干粉于EP 管中，室溫下以0、3、5、7、9 kGy 輻照處理，劑量率為250 Gy·min-1。輻照后立即存于-20 ℃中，凍干粉溶于10 mmol·L-1Tris-HCl 中，進(jìn)行免疫印跡、蛋白濃度、濁度、疏水性、分子量和抗原性測(cè)定。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目與方法

1.4.1 免疫印跡 聚丙烯酰胺凝膠電泳（sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDSPAGE）分離的小清蛋白，參照陳獻(xiàn)雄等［21］的方法，用Tris-HCl 緩沖鹽溶液加吐溫-20（TBS 加Tween-20，TBST）浸泡分離膠及硝酸纖維素膜5 min，制作“三明治”后進(jìn)行電轉(zhuǎn)，轉(zhuǎn)移電流100 mA，時(shí)間為1 h。轉(zhuǎn)印完的硝酸纖維素膜用蒸餾水清洗后，再用5%奶粉封閉液浸泡，搖床上升溫緩慢搖1 h，TBST 漂洗3 次。將膜放入稀釋5 000倍的一抗（小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體PARV-19或小鼠抗鱸魚小清蛋白多克隆抗體）浸沒，37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次。用稀釋20 000 倍的兔抗小鼠辣根過氧化物酶（horseradish peroxidase，HRP）標(biāo)記的二抗，37 ℃孵育1 h，TBST 洗滌3 次。二氨基聯(lián)苯胺（diaminobenzidine，DAB）避光顯色15 min，加入蒸餾水終止反應(yīng)。

1.4.2 鱸魚小清蛋白濃度、濁度、疏水性及分子量的測(cè)定 鱸魚小清蛋白濃度測(cè)定：采用Bradford 法，標(biāo)準(zhǔn)組離心管中加入100 μL 相應(yīng)濃度的牛血清白蛋白（bovine serum albumin，BSA），樣品組中分別加入100 μL 小清蛋白稀釋液，每管加入1 mL Bradford 工作液，室溫反應(yīng)10 min，利用紫外分光光度計(jì)測(cè)定各管在595 nm 下的吸光值，每個(gè)樣品測(cè)定3次。濁度測(cè)定：以280 nm 下的吸光度值表示，每個(gè)樣品測(cè)定3 次。疏水性測(cè)定：參照余晶梅［22］的方法，向100 μL 輻照后的小清蛋白溶液中加入2 μL 8 mmol·L-1的8-苯氨基-1-萘磺酸（8-anilino-1-naphthalenesulfonic acid，ANS）液混勻，室溫放置2 h，在激發(fā)波長(zhǎng)385 nm、發(fā)射波長(zhǎng)420～550 nm 的熒光酶標(biāo)儀下進(jìn)行熒光強(qiáng)度掃描，每個(gè)樣品測(cè)定3 次。分子量測(cè)定：小清蛋白溶液80 μL 與20 μL上樣緩沖液混合，沸水浴5 min，快速離心上樣，濃縮膠濃度為5%，電泳電壓為80 V，時(shí)間為30 min，分離膠濃度為15%，電泳電壓為100 V，時(shí)間為1.5 h，待溴酚藍(lán)指示劑接近膠底5 mm 處停止電泳，取下分離膠，考馬斯亮藍(lán)R-250中染色15 min，倒掉染色液，加入脫色液脫色至背景無色，條帶清晰。

1.4.3 間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA（Ci-ELISA）方法 參照于瀅［23］的方法并稍作修改。（1）抗原包被：未輻照鱸魚小清蛋白用包被液稀釋為1 μg·mL-1，加100 μL 到96 板中，37 ℃孵育2 h或置于4 ℃過夜。（2）洗滌：次日取出恢復(fù)至室溫，甩干包被液，用PBST 洗滌3 次，每次5 min，甩干。（3）封閉：每孔加入5%脫脂奶粉封閉，37 ℃孵育1 h。洗滌甩干。（4）競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)：將每個(gè)輻照劑量的小清蛋白稀釋成0.000 1、0.001、0.01、0.1、1、10、100 μg·mL-17個(gè)梯度，50 μL 輻照后的鱸魚小清蛋白和50 μL PBST稀釋的小鼠多克隆抗體在酶標(biāo)板外反應(yīng)1 h后，加入有包被抗原的酶標(biāo)孔，每孔內(nèi)加入50 μL PBS和50 μL抗原，不加樣品或抗原的為無競(jìng)爭(zhēng)反應(yīng)體系，37 ℃孵育1 h。同（2）洗滌。（5）加酶標(biāo)二抗：每孔加入100 μL 1∶200 00 稀釋的酶標(biāo)二抗（兔抗小鼠IgG-HRP），37 ℃孵育1 h。同（2）洗滌。（6）顯色：將100 μL反應(yīng)底物加入到酶標(biāo)板的孔內(nèi)，并置于37 ℃避光反應(yīng)15 min。（7）終止反應(yīng)：每孔加入50 μL 2 mol·L-1H2SO4終止反應(yīng)。（8）比色：在450 nm 處測(cè)定吸光值，每組重復(fù)3 次。（9）IC50值計(jì)算：以小清蛋白濃度對(duì)數(shù)為橫坐標(biāo)，抑制率為縱坐標(biāo)，繪制競(jìng)爭(zhēng)抑制曲線，擬合出標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算每個(gè)輻照劑量競(jìng)爭(zhēng)抑制率50%時(shí)的抗原濃度，該濃度即為IC50值。每個(gè)處理重復(fù)3次。抑制率的計(jì)算公式為：

式中，OD無為不加樣品反應(yīng)孔的吸光度值，OD樣品為輻照后小清蛋白的吸光度值，OD空白為空白孔的吸光度值。

1.4.4 二級(jí)結(jié)構(gòu)測(cè)定 利用圓二色譜（circular dichroism，CD）檢測(cè)輻照前后小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.5 數(shù)據(jù)處理

液質(zhì)聯(lián)用質(zhì)譜結(jié)果利用搜庫(kù)軟件Maxquant 及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)檢索匹配得到相關(guān)數(shù)據(jù)，輻照后濃度、濁度及疏水性測(cè)定所得數(shù)據(jù)用SPSS 26.0進(jìn)行單因素方差分析及獨(dú)立樣本T檢驗(yàn)，圓二色譜數(shù)據(jù)用Dichroweb處理得輻照后蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)各構(gòu)象成分相對(duì)百分含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 鱸魚小清蛋白的提取與鑒定

由圖1 可知，鱸魚蛋白粗提后含有多條蛋白帶，但煮沸后僅有3 條明顯的蛋白帶，說明煮沸能除去多條蛋白。經(jīng)硫酸銨沉淀后僅有1 條清晰蛋白帶。同時(shí)由表1 可知，煮沸之后的濾液去除了大部分雜蛋白，100%硫酸銨鹽析所得沉淀可能主要為所需的小清蛋白。圖2 為DEAE-Sepharose Fast Flow 洗脫圖，蛋白主要存在于7 管和8 管。圖3 為兩管的SDS-PAGE 圖，可以明顯看出8號(hào)管純度更高。

表1 鱸魚蛋白提取過程中蛋白含量變化Table 1 Changes of protein content during the extraction of bass protein

圖1 鱸魚蛋白提取過程中SDS-PAGEFig.1 SDS-PAGE during the extraction of bass protein

圖2 鱸魚粗提蛋白洗脫圖Fig.2 Elution diagram of crude protein extract of bass

圖3 鱸魚粗提蛋白洗脫樣品SDS-PAGEFig.3 SDS-PAGE of crude protein elution sample from bass

圖4 為8 號(hào)管的紫外掃描分析圖，259.2 nm 處存在吸收峰。由于小清蛋白的氨基酸組成中有較高的酪氨酸和苯丙氨酸比率，且缺乏色氨酸，260 nm 會(huì)出現(xiàn)特征吸收峰，符合小清蛋白特征。

圖4 鱸魚粗提蛋白洗脫樣品8號(hào)管紫外掃描圖Fig.4 UV scan of tube 8 of bass crude protein elution sample

圖5為利用小鼠抗蛙小清蛋白單克隆抗體PARV-19［24］進(jìn)行的免疫印跡圖，純化后的鱸魚小清蛋白在10～12 kDa處有雜交帶。

圖5 鱸魚小清蛋白純化后免疫印跡Fig.5 Immunoblotting after purification of bass parvalbumin

為了進(jìn)一步驗(yàn)證提取蛋白的種類，利用液質(zhì)聯(lián)用儀（liquid chromatography mass spectrometry，LC/MS）對(duì)蛋白進(jìn)行質(zhì)譜鑒定。圖6 為鱸魚純化蛋白的質(zhì)譜圖，利用搜庫(kù)軟件Maxquant及UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)解析譜圖，根據(jù)理論序列和譜圖匹配出碎裂的離子，通過碎裂方式進(jìn)行拼接得到肽段，從肽段水平匹配到蛋白水平，得到部分?jǐn)?shù)據(jù)結(jié)果如表2 所示。可以看出，分子量為11.6 kDa 的蛋白覆蓋率為59%，鑒定出6 條肽段，匹配到53 個(gè)二級(jí)譜圖，等電點(diǎn)為4.86，蛋白得分為205.98（＞60），結(jié)果可信，因此可以確定該蛋白為小清蛋白。

表2 小清蛋白LC/MS質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定分析結(jié)果Table 2 Structure identification and analysis results of parvalbumin by LC/MS mass spectrometry

圖6 小清蛋白LC/MS質(zhì)譜結(jié)構(gòu)鑒定譜圖Fig.6 Structure identification spectrum of parvalbumin by LC/MS mass spectrometry

2.2 鱸魚小清蛋白多克隆抗的制備

圖7 為小清蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果，抗體效價(jià)達(dá)1∶128 000，滿足后續(xù)試驗(yàn)要求。利用該多克隆抗體進(jìn)行免疫印跡測(cè)定，得圖8，鱸魚粗提蛋白和純化的小清蛋白能與該多克隆抗體結(jié)合，反應(yīng)條帶在12 kDa 左右，沒有進(jìn)行多抗孵育的陰性對(duì)照組未與抗體結(jié)合，進(jìn)一步說明小清蛋白多克隆抗體純度已經(jīng)較高。

圖7 小清蛋白多克隆抗體效價(jià)測(cè)定結(jié)果Fig.7 Result of polyclonal antibody titer determination of parvalbumin

圖8 小清蛋白多克隆抗體免疫印跡Fig.8 Immunoblotting with a polyclonal antibody against parvalbumin

2.3 電子束輻照對(duì)鱸魚小清蛋白濃度、濁度、疏水性和分子量的影響

利用Bradford法測(cè)定595 nm處的吸光度，以吸光度值表示濃度，由表3可知，相同狀態(tài)下，隨著電子束輻照劑量的增加，凍干粉及溶液處理的A595nm值均整體顯著降低，說明電子束輻照能使鱸魚小清蛋白濃度降低，這是由于輻照處理使蛋白降解，導(dǎo)致溶液中的蛋白碎片增多，蛋白溶解度降低。溶液經(jīng)7 kGy 輻照后濃度增大，原因是蛋白碎片增多，溶液濁度增大，透明度降低［25］。相同輻照劑量下（3、5、7 或9 kGy），與凍干粉處理相比，溶液處理的A595nm值更低，均達(dá)到顯著差異水平。

表3 輻照下鱸魚小清蛋白A595 nm的變化Table 3 Changes of bass parvalbumin in the A595 nm under irradiation

以280 nm處的吸光度值表示蛋白濁度。由表4可知，相同輻照劑量下，溶液處理的蛋白濁度顯著大于凍干粉處理。相同狀態(tài)下，隨著輻照劑量的增加，凍干粉及溶液的濁度均整體顯著增大，該結(jié)果與蛋白濃度的變化趨勢(shì)一致，即：蛋白濃度越低，濁度越高，產(chǎn)生的蛋白碎片越多。

表4 輻照下鱸魚小清蛋白A280 nm的變化Table 4 Changes of bass parvalbumin in the A280 nm under irradiation

表5 是不同電子束輻照劑量下的蛋白熒光強(qiáng)度變化，熒光探針ANS 的熒光強(qiáng)度越大，反映蛋白疏水性越強(qiáng)。相同狀態(tài)下，隨著輻照劑量的增加，凍干粉處理及溶液處理均使熒光強(qiáng)度顯著增大，說明經(jīng)過電子束輻照處理后，蛋白的的疏水性顯著增大，輻照使小清蛋白的疏水性基團(tuán)大量暴露在分子表面，使鱸魚小清蛋白疏水性提高。同時(shí)可以看出，在3～7 kGy 輻照劑量范圍內(nèi)，凍干粉處理的蛋白疏水性較大，溶液處理的蛋白疏水性較小，均達(dá)到顯著差異，而在9 kGy 劑量處理下，結(jié)果則相反。

表5 輻照下鱸魚小清蛋白熒光強(qiáng)度的變化Table 5 Changes of fluorescence intensity of bass parvalbumin under irradiation

SDS-PAGE 電泳分析（圖9-A 和圖10-A）表明，隨著輻照劑量增大，小清蛋白帶逐漸模糊，9 kGy 時(shí)條帶較低劑量輻照條帶更模糊，說明溶液狀態(tài)下，輻照使部分小清蛋白發(fā)生斷裂和破壞，輻照劑量越大，破壞越嚴(yán)重。而凍干粉處理的條帶變化始終不明顯。

圖9 不同電子束輻照劑量處理鱸魚小清蛋白溶液條件下的SDS-PAGE電泳圖和免疫印跡Fig.9 SDS-PAGE electrophoretograms and immunoblotting of parvalbumin solution from bass treated with different electron beam irradiation doses

圖10 不同電子束輻照劑量處理鱸魚小清蛋白凍干粉條件下的SDS-PAGE電泳圖和免疫印跡Fig.10 SDS-PAGE electrophoretograms and immunoblotting of parvalbumin lyophilized from bass treated with different electron beam irradiation doses

2.4 電子束輻照對(duì)鱸魚小清蛋白抗原性的影響

表6 是不同電子束輻照劑量處理下的鱸魚小清蛋白半抑制濃度（half maximal inhibitory concentration，IC50）值的變化，反映小清蛋白的抗原性變化，IC50值越小，抗原性越高。結(jié)果表明，輻照劑量為9 kGy 時(shí)，凍干粉IC50值比0 kGy 增大40 倍，溶液IC50值比0 kGy 增大43 倍，隨著輻照劑量的增加，溶液和凍干粉狀態(tài)處理小清蛋白的IC50值均增大。說明隨著輻照劑量增大，小清蛋白的抗原性降低。從相同輻照劑量處理看，溶液狀態(tài)處理的IC50值較大，凍干粉處理較小，說明溶液狀態(tài)處理的抗原性降低更明顯。從圖9-B 和圖10-B 的免疫印跡結(jié)果同樣可以看出，隨著輻照劑量的增大，免疫印跡條帶越來越淡化。

表6 不同電子束輻照處理下鱸魚小清蛋白IC50值的變化Table 6 Changes of IC50 value of bass parvalbumin under different electron beam irradiation

2.5 電子束輻照后鱸魚小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化

利用圓二色譜（circular dichroism，CD）測(cè)定輻照處理后小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的變化，結(jié)果如圖11和圖12所示，可見波形和波幅發(fā)生了變化。由表7可知，與0 kGy相比，凍干粉狀態(tài)及溶液狀態(tài)輻照后的蛋白α-螺旋及無規(guī)則卷曲比例均升高；相同劑量下，溶液狀態(tài)處理無規(guī)則卷曲升高明顯，凍干狀態(tài)處理α-螺旋升高明顯，但不同輻照劑量之間無明顯差異。同時(shí)可以看出，輻照處理β-折疊及β-轉(zhuǎn)角比例較未輻照處理無明顯變化。說明輻照破壞了蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)。

表7 CD鑒定鱸魚小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)含量變化Table 7 Change of secondary structure content of bass parvalbumin identified by CD

圖11 鱸魚小清蛋白溶液CD圖Fig.11 CD diagram of bass parvalbumin solution

圖12 鱸魚小清蛋白凍干粉CD圖Fig.12 CD diagram of bass parvalbumin powderr

3 討論

輻照通過電離輻射與物質(zhì)相互作用對(duì)食品進(jìn)行加工處理［26］。食品輻照已被證明是一種安全、高效的物理加工手段，逐步應(yīng)用于食品殺菌、脫敏等方面［27］。與顧可飛［28］在研究輻照對(duì)蝦過敏原影響中得出的隨著輻照劑量增大，過敏原溶液濃度顯著增大，過敏原粉濃度未發(fā)生顯著變化的結(jié)果不同，本試驗(yàn)結(jié)果表明，不同劑量輻照處理溶液和凍干粉濃度均較未輻照處理顯著減小，濁度則均顯著增大，可能是由鱸魚和蝦的蛋白結(jié)構(gòu)及輻照破壞程度不同所致。相同輻照劑量下，溶液和凍干粉的濃度及濁度表現(xiàn)出差異，可能是由于輻照處理具有射線的直接破壞作用和通過超自由基的間接破壞作用，溶液處理除了直接作用還具有間接作用，蛋白質(zhì)破壞效應(yīng)更明顯，蛋白濃度更低，濁度更大。

溶液和凍干粉疏水性隨輻照劑量的增大而顯著提高，這與張明琦等［29］研究輻照對(duì)蟹過敏蛋白影響的結(jié)果相近，可能是由鱸魚小清蛋白中親水性基團(tuán)對(duì)輻照作用更為敏感所致。3～7 kGy 劑量處理時(shí)，凍干粉處理的蛋白疏水性較大，溶液處理的蛋白疏水性較小，而9 kGy 劑量處理時(shí)，結(jié)果則相反，可能是由于溶液狀態(tài)水分子與小清蛋白中的親水基團(tuán)結(jié)合成氫鍵，低劑量輻照不足以使氫鍵斷裂，疏水性基團(tuán)不易顯露，而在高輻照劑量下，氫鍵斷裂，疏水性基團(tuán)大量暴露，疏水性顯著增大［30］。SDS-PAGE 結(jié)果表明，隨著輻照劑量增加，小清蛋白的含量逐漸減少，推測(cè)小清蛋白多肽鏈斷裂成小肽段或交聯(lián)成更長(zhǎng)的肽鏈。相同輻照劑量下，溶液狀態(tài)處理的抗原性較凍干處理降低更明顯，抗原位點(diǎn)破壞更多，這同樣可能是由于溶液狀態(tài)存在水分子，輻照處理容易形成超自由基所致。過敏原與抗原位點(diǎn)結(jié)合激發(fā)免疫反應(yīng)，抗原位點(diǎn)包括立體結(jié)構(gòu)位點(diǎn)和一級(jí)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，輻照處理有可能既破壞通過氫鍵、二硫鍵等連接的立體結(jié)構(gòu)，又破壞蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)位點(diǎn)，使有效抗原位點(diǎn)顯著減少，鱸魚小清蛋白與抗體的結(jié)合率降低。結(jié)合濃度、濁度及SDS-PAGE結(jié)果推斷，電子束輻照使小清蛋白發(fā)生多肽鏈斷裂、抗原位點(diǎn)破壞等一級(jí)結(jié)構(gòu)改變，導(dǎo)致抗原性降低，這也證實(shí)了前人的研究結(jié)果，即輻照能降低鱸魚小清蛋白的抗原性［31］。

輻照處理使鱸魚小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)破壞，雖然β-折疊及β-轉(zhuǎn)角變化不明顯，但α-螺旋及無規(guī)則卷曲比例升高，張振山等［32］在研究霉變和輻照對(duì)大豆蛋白質(zhì)理化性質(zhì)和結(jié)構(gòu)的影響時(shí)也得出相同結(jié)論。結(jié)合免疫印跡及間接競(jìng)爭(zhēng)ELISA 結(jié)果，小清蛋白的抗原性變化與無規(guī)則卷曲比例變化趨勢(shì)一致，推測(cè)輻照對(duì)小清蛋白抗原性的影響主要與無規(guī)則卷曲有關(guān)。輻照后小清蛋白α-螺旋及無規(guī)則卷曲比例升高，疏水性基團(tuán)暴露，改變小清蛋白的構(gòu)象及聚合形式，同時(shí)改變二級(jí)結(jié)構(gòu)及三級(jí)結(jié)構(gòu)，進(jìn)而改變蛋白的生物學(xué)功能［29］，但輻照降低鱸魚小清蛋白抗原性的機(jī)理還有待進(jìn)一步研究。

此外，本研究發(fā)現(xiàn)溶液狀態(tài)和凍干粉狀態(tài)輻照處理效果顯著不同，溶液狀態(tài)的輻照處理效果更明顯，這是輻照的直接作用和間接作用所致，直接作用是射線直接切斷活性基團(tuán)或化學(xué)鍵，從而使蛋白斷裂、結(jié)構(gòu)破壞；而由于水分子的存在，輻照處理容易形成超自由基，間接作用于蛋白分子，從而破壞蛋白一級(jí)結(jié)構(gòu)和立體結(jié)構(gòu)。不同狀態(tài)的鱸魚小清蛋白對(duì)輻照的敏感性不同，溶液比凍干粉對(duì)輻照更為敏感。該結(jié)果為未來脫敏技術(shù)的發(fā)展提供了新思路，過敏原的狀態(tài)對(duì)達(dá)到最佳脫敏效果是否存在較大影響，仍需要進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

電子束輻照處理溶液狀態(tài)和凍干粉狀態(tài)的鱸魚小清蛋白后，蛋白濃度顯著減低，濁度顯著增加，疏水性顯著提高，過敏條帶逐漸變淺，免疫印跡條帶變淺甚至消失，說明輻照使鱸魚小清蛋白空間構(gòu)象改變；與對(duì)照組相比，9 kGy 劑量輻照的凍干粉IC50值增大40 倍，溶液IC50值增大43 倍，小清蛋白與抗體的結(jié)合能力顯著減弱，表明輻照可以顯著降低鱸魚小清蛋白抗原性；鱸魚小清蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)被破壞，輻照對(duì)小清蛋白抗原性的影響主要與無規(guī)則卷曲有關(guān)。與凍干粉狀態(tài)相比，輻照處理對(duì)溶液狀態(tài)效果更明顯，溶液狀態(tài)輻照處理可作為降敏輻照加工的主要方式。