張強強 王雯雯 閆思遠 李 玲 王若彤 顧沛雯 ，

（1寧夏大學(xué)林業(yè)與草業(yè)學(xué)院，寧夏 銀川 750021；2寧夏大學(xué)農(nóng)學(xué)院，寧夏 銀川 750021）

葡萄卷葉病是目前在世界范圍內(nèi)發(fā)生最普遍，且造成經(jīng)濟損失最大的葡萄病毒?。?］。引起卷葉病的病原是葡萄卷葉病相關(guān)的病原物（grapevine leafrollassociated viruses，GLRaVs），目前已被報道的有6 種，分別為GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GLRaV-4（包括GLRaV-4 的變種GLRaV-5、-6、-9、-Pr、-De、-Car）、GLRaV-7 和GLRaV-13［2-3］。其中GLRaV-3 是發(fā)生最為普遍，且危害最大的病原之一［4］。研究表明，GLRaV-3 能抑制葡萄的生長發(fā)育，改變葡萄葉片的生理代謝，降低葡萄光合速率，造成葡萄減產(chǎn)，品質(zhì)變劣，嚴重影響葡萄酒的口感。Maree 等［5］發(fā)現(xiàn)葡萄感染卷葉病毒后，嚴重影響樹勢并縮短樹體的生命周期。Halldorson 等［6］研究表明，釀酒葡萄品種美樂感染GLRaV-3 后，造成葉片變紅，糖分積累減少，凈光合速率降低。進一步的研究發(fā)現(xiàn)GLRaV-3 感染葡萄能中斷正常漿果的成熟過程，降低果粒中花色苷合成和糖代謝等基因的表達量，造成果實總糖、總酚、葉綠素和花色苷含量顯著減低，含酸量增加，嚴重影響葡萄的經(jīng)濟價值［7-8］。葡萄一旦感染GLRaVs便終生帶毒［1］，難以根治，因此建立高效、快速和準確的GLRaVs 檢測體系是病害早期診斷與防控的關(guān)鍵。

逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)恒溫擴增技術(shù)（reverse transcription loop-mediated isothermal amplification，RT-LAMP）是由Notomi 等［9］于2000 年開發(fā)的在恒溫條件下快速完成靶標(biāo)基因擴增的新方法。該方法利用1 對內(nèi)引物FIP/BIP 和1 對外引物F3/B3，在具有鏈置換活性的Bst DNA 聚合酶的作用下，于恒溫條件下催化新鏈的合成，從而實現(xiàn)高效擴增的目的［10-11］。目前，RT-LAMP已應(yīng)用于葡萄病毒的快速檢測。張永江等［12］建立了葡萄病毒A（grapevine virus A，GVA）的RT-LAMP 檢測方法，該方法特異性好，檢測所用時間僅為常規(guī)逆轉(zhuǎn)錄PCR（reverse transcription-polymerase chain reaction，RT-PCR）的1/3，且靈敏度是常規(guī)RT-PCR 的10 倍。范旭東等［13］建立了沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒（grapevine rupestris stem pitting-associated virus，GRSPaV）的RTLAMP 檢測方法，該方法能夠檢測出GRSPaV 的RNA最大稀釋倍數(shù)為10-4，具有簡便、快速、靈敏和可視化等特點。Walsh 等［14］在2013 年開發(fā)了一種GLRaV-3逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，該方法直接以RNA為模板，在LAMP 體系中加入禽成髓細胞瘤病毒（avian myeloblastosis virus，AMV）逆轉(zhuǎn)錄酶，在60 ℃恒溫條件下反應(yīng)2 h 內(nèi)完成檢測。但GLRaV-3 作為RNA 病毒，具有高度變異性，不同國家不同地區(qū)的GLRaV-3 分離物的基因序列存在明顯差異［15-17］，因此，針對我國范圍內(nèi)GLRaV-3的分離物建立快速靈敏RT-LAMP檢測方法十分必要。鑒于此，本研究根據(jù)我國GLRaV-3CP基因的全長序列設(shè)計并合成特異性引物，通過優(yōu)化擴增體系和反應(yīng)條件，檢驗該方法的特異性、靈敏性和實用性，構(gòu)建GLRaV-3的RT-LAMP 檢測技術(shù)體系，以期為GLRaV-3 的快速、準確診斷提供方法。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

前期研究發(fā)現(xiàn)，賀蘭山東麓蛇龍珠葡萄感染病毒病最為嚴重，經(jīng)RT-PCR鑒定其主要感染葡萄卷葉伴隨病毒1～3（GLRaV-1～3）、葡萄扇葉病毒（grapevine fanleaf virus，GFLV）、沙地葡萄莖痘相關(guān)病毒（GRSPaV）、葡萄病毒A（GVA）、灰皮諾葡萄病毒（grapevine pinot gris virus，GPGV）和葡萄漿果內(nèi)壞死病毒（grapevine berry inner necrosis virus，GINV）［18］。本試驗以感染這8種葡萄病毒的蛇龍珠葡萄葉片為陽性對照，于2021 年9 月采自寧夏青銅峽市西鴿酒莊。以脫毒蛇龍珠葡萄組培苗葉片為陰性對照（NC），由寧夏農(nóng)墾玉泉營葡萄苗木繁育中心提供。

1.2 主要儀器與試劑

Simpli Nano 超微量分光光度計（GE Healthcare 公司，美國）；3K 15 通用臺式冷凍離心機（Sigma 公司，美國）；T 100TM Thermal Cycler PCR 儀（Bio-Rad 公司，美國）；電泳儀（北京六一廠）；c200 凝膠成像系統(tǒng)（Azure Biosystems 公司，美國）；Blook 藍光透照儀（Genedirex臺灣德怡科技有限公司）；LE204E 電子分析天平（Mettler-toledo公司，瑞士）。

Plant RNA Kit R6827 植物RNA 提取試劑盒（Omega Bio-tek 公司，美國），PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa 公司，日本）；Bst DNA 聚合酶（北京聚合美生物科技有限公司）；甜菜堿（上海生工生物工程有限公司）；SYBR Green I（上海瑞楚生物公司）；dNTP Mixture（上海BBI生命科學(xué)有限公司）。

1.3 引物設(shè)計與合成

根據(jù)GLRaV-3 的CP基因序列（GenBank 登錄號：KC477128.1），利用Primer Explorer V5（http：//primerexplorer.jp/lampv5e/index.html）軟件，根據(jù)引物長度、引物自由能及GC 含量等篩選，設(shè)計了3 組RTLAMP 引物，GLRaV-3 常規(guī)RT-PCR 引物采用F/R，擴增片段大小為942 bp［19］（表1）。上述所有引物均由上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)公司合成。

表1 用于GLRaV-3檢測的RT-LAMP和RT-PCR引物Table 1 Primers used in RT-LAMP and RT-PCR of GLRaV-3

1.4 RNA 提取及cDNA合成

將采集的葡萄葉片加入液氮迅速研磨至粉末狀，取100 mg至1.5 mL離心管中，按照植物RNA提取試劑盒提取葡萄葉片總RNA，采用反轉(zhuǎn)錄試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA。

1.5 RT-PCR檢測

PCR 擴增反應(yīng)體系50 μL：cDNA 2 μL，正、反向引物各2 μL，Max Taq 酶25 μL，RNase-free Water 19 μL。PCR 擴增條件：94 ℃預(yù)變性3 min；94 ℃ 變性1 min，55 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃終延伸10 min。使用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR 產(chǎn)物后，將PCR 產(chǎn)物送至上海生工生物工程有限公司進行測序。

1.6 RT-LAMP引物初篩

參照李華偉等［20］的方法建立RT-LAMP 反應(yīng)體系，并略作調(diào)整。以GLRaV-3 DNA 為模板，進行RTLAMP 擴增，對表1 中3 組引物（GLRaV3-LAMP-Ⅰ、-Ⅱ和-Ⅲ）進行篩選，以脫毒蛇龍珠葡萄組培苗葉片為陰性對照，ddH2O 為空白對照。反應(yīng)體系為25 μL：10×Reaction Buffer 2.5 μL，100 mmol·L-1MgSO41.5 μL，5 mol·L-1甜菜堿5 μL，10 mmol·L-1dNTPs 2.5 μL，8 U·μL-1Bst DNA 聚合酶1 μL，40 μmol·L-1FIP/BIP 1 μL，10 μmol·L-1F3/B3 1 μL，cDNA 1.5 μL，ddH2O 補足至25 μL。反應(yīng)條件為：65 ℃恒溫擴增60 min。

RT-LAMP 擴增結(jié)果的判斷：通過2.5%瓊脂糖凝膠電泳觀察反應(yīng)結(jié)果（陽性為梯狀條帶；陰性無明顯條帶）；反應(yīng)前在管蓋上加入SYBR Green I 熒光染液，反應(yīng)結(jié)束后離心，分別在自然光和藍光透照儀觀察反應(yīng)管的顏色變化（陽性為綠色、有熒光；陰性為橙紅色、無熒光）［21-22］。

1.7 RT-LAMP引物特異性檢驗

使用篩選出的引物對提取的8種葡萄病毒RNA進行RT-LAMP 擴增，以脫毒蛇龍珠葡萄組培苗葉片為陰性對照，ddH2O 為空白對照。檢測引物特異性。反應(yīng)結(jié)果判斷方法同1.6。

1.8 RT-LAMP反應(yīng)體系優(yōu)化

根據(jù)反應(yīng)條件對RT-LAMP反應(yīng)體系進行優(yōu)化，依次對反應(yīng)時間（30、45、60、75、90、105 min）、反應(yīng)溫度（61.0、61.5、62.3、64.0、65.4、66.7、67.6、68.0 ℃）、Mg2+終濃度（2、4、6、8、10、12、14 mmol·L-1）、dNTPs終濃度（0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4、1.6 mmol·L-1）、甜菜堿終濃度（0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2、1.4 mol·L-1）和Bst DNA聚合酶終濃度（0.16、0.24、0.32、0.40、0.48、0.56、0.64 U·μL-1）進行優(yōu)化。反應(yīng)結(jié)果判斷方法同1.6。

1.9 RT-LAMP和RT-PCR靈敏度比較

用超微量分光光度計測定提取GLRaV-3 的總RNA 濃度，使用DEPC 水將總RNA 原液依次稀釋10-1～10-7倍，分別進行RT-LAMP 和RT-PCR 擴增，對兩種方法的檢測結(jié)果進行分析，反應(yīng)結(jié)果判斷方法同1.6。

1.10 田間樣品檢測

隨機采集了寧夏西鴿酒莊、新牛莊園和西夏王酒莊的蛇龍珠葡萄樣品15 份，以脫毒蛇龍珠葡萄組培苗葉片為對照。按照1.4的方法提取葡萄葉片總RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA，使用優(yōu)化后的RT-LAMP 體系進行擴增，反應(yīng)結(jié)果判斷方法同1.6。

2 結(jié)果與分析

2.1 引物初篩

利用GLRaV-3 特異性引物對樣品RNA 進行RTPCR 擴增，擴增片段與預(yù)期擴增片段大小一致（圖1-A），擴增產(chǎn)物經(jīng)測序比對確定為GLRaV-3。以所得GLRaV-3 的cDNA 為模板，對3 對引物進行篩選，引物Ⅰ和Ⅲ均能擴增出明亮清晰的梯狀條帶，引物Ⅱ無清晰條帶出現(xiàn)（圖1-B）。加入SYBR GreenⅠ熒光染液后，引物Ⅰ和Ⅲ的反應(yīng)底物變?yōu)榫G色，引物Ⅱ與對照一樣為橙紅色（圖1-C）。在藍光儀下，引物Ⅰ和Ⅲ發(fā)出白色亮光，引物Ⅱ無明顯熒光（圖1-D）。

圖1 RT-LAMP引物篩選Fig.1 RT-LAMP primer screening

2.2 特異性檢測

使用引物Ⅰ和Ⅲ分別對帶有GFLV、GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GRSPaV、GVA、GPGV、GINV 的樣品總RNA 進行RT-LAMP 擴增。結(jié)果如圖2 所示，引物Ⅰ只有GLRaV-3 擴增出清晰明亮的梯狀條帶且有明顯熒光，其他病毒以及對照均未擴增出梯狀條帶（圖2-A～C）。引物Ⅲ能擴增出GLRaV-1、GLRaV-2、GLRaV-3、GRSPaV、GPGV、GINV，對GLRaV-3 沒有特異性（圖2-D～F）。因此，選擇引物Ⅰ進行后續(xù)試驗。

圖2 引物特異性檢測Fig.2 Primers specificity test for GLRaV-3

2.3 RT-LAMP 反應(yīng)條件優(yōu)化

2.3.1 反應(yīng)時間 當(dāng)反應(yīng)時間超過60 min時，均能擴增出清晰明亮的梯狀條帶（圖3-A），反應(yīng)底物顏色變?yōu)榫G色，在藍光儀下出現(xiàn)亮光（圖3-B、C）。但出于省時考慮，選取60 min反應(yīng)時間進行后續(xù)試驗。

2.3.2 反應(yīng)溫度 如圖4 所示，隨著溫度的升高，梯狀條帶亮度與清晰度呈先增強后減弱的趨勢，當(dāng)反應(yīng)溫度為62.3 ℃時，開始擴增出梯狀條帶（圖4-A），當(dāng)反應(yīng)溫度為64.0、65.4、66.7 ℃時，反應(yīng)底物均變?yōu)榫G色（圖4-B），在藍光儀下均出現(xiàn)亮光（圖4-C），在這3 個溫度下RT-LAMP 擴增效率差別不大，但溫度為64.0 ℃時梯狀條帶較為明亮清晰（圖4-A）。因此，選取64.0 ℃作為后續(xù)試驗的反應(yīng)溫度。

圖4 反應(yīng)溫度對RT-LAMP的影響Fig.4 Effect of reaction temperature on RT-LAMP

2.3.3 Mg2+濃度 如圖5所示，Mg2+濃度在2～14 mmol·L-1均能擴增出梯狀條帶，條帶亮度呈先增強后減弱。其中Mg2+濃度為8 mmol·L-1時，梯狀條帶最清晰明亮，加入染色劑后所得結(jié)果與之一致。因此，反應(yīng)體系中Mg2+最佳濃度為8 mmol·L-1。

圖5 Mg2+濃度對RT-LAMP的影響Fig.5 Effect of Mg2+ concentration on RT-LAMP

2.3.4 Bst DNA 聚合酶 如圖6 所示，Bst DNA 聚合酶濃度在0.16～0.64 U·μL-1時均能擴增出梯狀條帶，但隨著Bst DNA 聚合酶濃度的增加，條帶亮度逐漸增強（圖6-A）。濃度在0.48 U·μL-1時，反應(yīng)底物變?yōu)榫G色（圖6-B），在藍光儀下出現(xiàn)亮光（圖6-C），之后隨濃度增加反應(yīng)底物顏色和熒光亮度無明顯變化。因此，選取0.48 U·μL-1作為Bst DNA 聚合酶最佳濃度。

圖6 Bst DNA聚合酶濃度對RT-LAMP的影響Fig.6 Effect of Bst DNA polymerase concentration on RT-LAMP

2.3.5 甜菜堿濃度 如圖7所示，甜菜堿濃度在0.2～1.4 mol·L-1時均能擴增出梯狀條帶，且條帶亮度與清晰度隨甜菜堿濃度的增加呈先增強后減弱的趨勢，其中濃度為1.0 mol·L-1時，梯狀條帶最為清晰明亮（圖7-A），反應(yīng)底物變?yōu)榫G色（圖7-B），在藍光儀下出現(xiàn)亮光（圖7-C），之后隨濃度增加梯狀條帶清晰度、反應(yīng)底物顏色和熒光亮度無明顯變化。因此，選取1.0 mol·L-1作為甜菜堿最佳濃度。

圖7 甜菜堿濃度對RT-LAMP的影響Fig.7 Effect of betaine on RT-LAMP

2.3.6 dNTPs 濃度 如圖8 所示，dNTPs 在0.4～1.6 mmol·L-1時均能擴增出梯狀條帶，且條帶亮度與清晰度隨dNTPs濃度的增加而增強（圖8-A），其中濃度在1.0 mmol·L-1時，反應(yīng)底物變?yōu)榫G色（圖8-B），在藍光儀下出現(xiàn)亮光（圖8-C），之后隨濃度增加反應(yīng)底物顏色和熒光亮度無明顯變化，但濃度在1.4 mmol·L-1時梯狀條帶最為清晰明亮（圖8-A）。因此，選取1.4 mmol·L-1作為dNTPs最佳濃度。

圖8 dNTPs濃度對RT-LAMP的影響Fig.8 Effect of dNTPs concentration on RT-LAMP

2.4 RT-LAMP和RT-PCR靈敏度比較

靈敏度測驗結(jié)果顯示，隨著RNA濃度的降低，電泳條帶逐漸變淡（圖9-A、B），經(jīng)SYBR Green Ι熒光染液染色，反應(yīng)底物顏色由綠色逐漸變?yōu)槌燃t色（圖9-C），在藍光儀下的熒光亮度也逐漸降低（圖9-D）。RT-PCR能夠檢測出GLRaV-3 的最低RNA 濃度為100 pg·μL-1（圖9-A），RT-LAMP能夠檢測出GLRaV-3的最低RNA濃度為10 pg·μL-1（圖9-B），說明本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP 檢測法與RT-PCR 檢測法相比，能夠?qū)Ω蜐舛鹊腞NA進行檢測，其靈敏度是RT-PCR的10倍。

圖9 靈敏度檢測Fig.9 Sensitive detection

2.5 田間樣品檢測

應(yīng)用RT-PCR和RT-LAMP對田間隨機采集的15個卷葉樣品進行檢測。結(jié)果表明，RT-PCR 和RT-LAMP均檢測出了13 個陽性樣品（圖10），檢測結(jié)果一致，說明該研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP 檢測方法可用于田間葡萄樣品的檢測。

圖10 RT-PCR 和RT-LAMP 方法檢測田間樣品Fig.10 Field-infected samples detected by RT-PCR and RT-LAMP

3 討論

RT-LAMP 因具有操作簡單、反應(yīng)快、靈敏度高的特點，已廣泛用于植物病毒的檢測［23-27］。Walsh 等［14］在2013 年開發(fā)了一種GLRaV-3 單管一步逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫擴增檢測方法，該方法直接以RNA 為模板，在LAMP 體系中加入AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶，在60 ℃恒溫條件下反應(yīng)2 h 完成檢測，并以羥基萘酚藍（hydroxy napthol blue）作為指示劑，通過觀察反應(yīng)底物由藍紫色到天藍色的變化判斷檢測結(jié)果。本研究前期使用該方法對感染GLRaV-3 的樣品進行了檢測，未擴增出梯狀條帶，推測是由于AMV 逆轉(zhuǎn)錄酶（酶反應(yīng)溫度范圍為42～58 ℃）和Bst DNA 聚合酶（酶反應(yīng)溫度范圍為60 ℃～65 ℃）的反應(yīng)溫度相差較大，導(dǎo)致LAMP敏感性受到一定的影響［28］。本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP快速檢測方法，以SYBR Green Ⅰ作為檢測指示劑，在64 ℃恒溫條件下反應(yīng)1 h 完成檢測。與Walsh 等［14］建立的方法相比，本研究以cDNA為模板的二步LAMP方法具有穩(wěn)定性高的優(yōu)點；本研究建立的GLRaV-3 RTLAMP檢測方法的反應(yīng)時間更短，僅為Walsh等所建體系反應(yīng)時長的1/2；所用的指示劑SYBR GreenⅠ顏色變化是由橙紅色變?yōu)榫G色，與Hydroxynapthol blue指示劑相比更易區(qū)分［29］。此外，還可利用紫外燈對反應(yīng)產(chǎn)物進行照射，根據(jù)熒光強度變化進行結(jié)果判定，進一步保證了結(jié)果的可靠性，增強了該技術(shù)的可視化程度，也更方便實際應(yīng)用［30］。

本研究以GLRaV-3CP基因分離物（GenBank 登錄號：KC477128.1）為靶序列，在其保守區(qū)域內(nèi)設(shè)計了3 對RT-LAMP 檢測引物，結(jié)果顯示引物Ⅰ和Ⅲ均能夠擴增出明亮清晰的梯狀條帶，引物ⅡRT-LAMP反應(yīng)十分微弱，無清晰條帶出現(xiàn)，推測這可能是由該引物不適應(yīng)RT-LAMP 反應(yīng)特點導(dǎo)致的。在進行特異性檢測時，引物Ⅰ僅能擴增出GLRaV-3，而引物Ⅲ卻擴增出其他病毒條帶，對GLRaV-3 沒有特異性，推測可能是該引物與靶標(biāo)序列不完全互補所致。

由于RT-LAMP 檢測方法擴增效率高，靈敏度比常規(guī)RT-PCR 檢測方法高出一個數(shù)量級，產(chǎn)物量多和靈敏度高使得加入核酸染料時，容易發(fā)生氣溶膠污染，產(chǎn)生假陽性［31-33］。張吉紅等［34］建立煙草環(huán)斑病毒RT-LAMP 檢測方法時，采用在反應(yīng)管蓋上滴加SYBR greenⅠ染料的方式，反應(yīng)結(jié)束后離心，可實現(xiàn)不開蓋的情況下直接使染料與擴增產(chǎn)物混合，避免反復(fù)開蓋而造成的污染問題，本研究也采用該方法，大大降低了污染率。與常規(guī)RT-PCR 方法相比，本研究建立的GLRaV-3 RT-LAMP 檢測體系，在保持PCR 技術(shù)優(yōu)點的基礎(chǔ)上，不需要特殊儀器和熱循環(huán)，操作簡單；整個過程可以在60 min 內(nèi)完成，更加省時；加入SYBR GreenⅠ后，陰陽性結(jié)果顏色差別明顯，易于肉眼判斷；適用于基層生產(chǎn)部門進行田間葡萄樣本和脫毒苗木的快速檢測。

4 結(jié)論

本研究以GLRaV-3CP基因為靶序列設(shè)計3 對RT-LAMP 引物，通過引物篩選和體系優(yōu)化，最終獲得RT-LAMP 最佳反應(yīng)引物為GLRaV3-LAMP-Ⅰ；最佳反應(yīng)體系為：Bst DNA 聚合酶濃度為0.48 U·μL-1，Mg2+濃度為8 mmol·L-1，甜菜堿濃度為1.0 mol·L-1，dNTPs濃度為1.4 mmol·L-1；最佳反應(yīng)條件為：64 ℃反應(yīng)60 min。該檢測體系的靈敏度為10 pg·μL-1，適合于鮮食葡萄和糖度較高的釀酒葡萄樣品檢測，可滿足科研、基層單位對GLRaV-3的快速檢測的需要。