張雨佳 劉 麗 鄒龍海 周敏舒 暢 欣 郭小勤

（浙江農(nóng)林大學(xué)，省部共建亞熱帶森林培育國家重點實驗室/竹子研究院，浙江 杭州 311300）

毛竹（Phyllostachysedulis）是我國南方最重要的林業(yè)資源之一，在經(jīng)濟和生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用。毛竹有其獨特的生物學(xué)特性，一旦開花，就會大面積死亡；且主要靠無性繁殖繁育，即筍芽發(fā)育形成筍，再長成竹，但自然界中毛竹筍芽發(fā)育率極低，僅為5%～8%［1］。

FLOWERING LOCUS T（FT）亞家族為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP）家族的3個亞家族之一，該亞家族只有1個結(jié)構(gòu)域（PEBP結(jié)構(gòu)域），該結(jié)構(gòu)域在動植物中均很保守［2-3］。模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）中只有1 個FT蛋白，可長距離運輸調(diào)控開花時間，是成花素的主要成分之一［4-5］。隨后在多種植物中也證實了FT 直系同源蛋白是成花素的主要成分。水稻（Oryzasativa）中的成花素Heading date 3a（Hd3a）調(diào)控開花的功能與FT 類似，在野生型水稻中過表達Hd3a引起早花表型，插入Hd3a拷貝數(shù)越多，早花表型越明顯［6］。紫蘇（Perilla frutescens）和木薯（Manihotesculenta）中FT基因的同系物均可促進開花［7-8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過表達毛竹PhFT4基因可使植株提前開花［9］。麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）中的成花素候選基因DlFT1在開花植株中的表達量顯著上調(diào)，過表達DlFT1的水稻表現(xiàn)出強烈的早花表型，過表達DlFT1的麻竹可直接從愈傷組織中分化出小穗［10］。

除調(diào)控開花外，F(xiàn)T 蛋白在植物發(fā)育過程中還發(fā)揮著其他作用：光葉薔薇（Rosawichuraiana）的兩個FT-like基因功能發(fā)生了分化，其中RwFT1可能參與光周期調(diào)控及芽休眠，而RwFT2則參與冷響應(yīng)及花發(fā)育［11］。在芥菜型油菜（Brassicajuncea）中過表達BjuFT會出現(xiàn)分枝模式和角果形狀的變化，花出現(xiàn)畸形［12］。除促進開花外，水稻中Hd3a還可以在腋生分生組織中積累，促使側(cè)芽向外長出形成分蘗［13］。在煙草（Nicotiana tabacum）中異位過表達陸地棉（Gossypiumhirsutum）GhFT1可使煙草開花提前，還可以促進煙草基部的側(cè)芽生長，誘導(dǎo)蓮座葉腋芽增多［14］。浙江農(nóng)林大學(xué)分子育種與筍用林團隊前期研究發(fā)現(xiàn)，毛竹中至少存在16個FT-like基因，推測某些FT基因可能參與筍芽發(fā)育［1，15］，但相關(guān)生物學(xué)功能仍有待進一步研究。

鑒于此，本研究擬用實時熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)分析毛竹PheFT12a基因的表達模式，通過聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)分析PheFT12a蛋白的亞細胞定位，通過農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥ft突變體分析其生物學(xué)功能，旨在為深入探討毛竹FT基因家族的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本研究中的毛竹種子采自廣西桂林，將毛竹種子剝殼，用無水乙醇浸泡3 min，連續(xù)用反滲透（reverses osmosis，RO）水充分沖洗兩次后浸泡2～3 d，期間每隔24 h 換一次水。將浸泡好的種子取出，均勻地平鋪在已經(jīng)鋪好紗布的水培育苗托盤上，罩住保鮮膜，室溫靜置發(fā)芽，在自然條件下培養(yǎng)，常規(guī)栽培管理。

擬南芥種植：取干燥處理后的擬南芥種子（Col-0基因型），無水乙醇清洗1 次，再用75%乙醇洗2～3 次，每次清洗2 min 左右，于超凈工作臺內(nèi)，將消毒好的擬南芥種子吸出，打在滅菌濾紙上晾干。晾干后，將其均勻撒在1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，封口膜密封。在4 ℃冰箱內(nèi)春化處理3 d，然后將其轉(zhuǎn)移至育苗室，培養(yǎng)一周左右，將發(fā)芽的苗移至育苗基質(zhì)，常規(guī)栽培管理。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采集生長2 個月的毛竹實生苗各組織，迅速放入液氮中。采用Trizol（Invitrogen，美國）法提取各組織總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測提取的RNA 完整性，用超微量紫外分光光度計（NanoDrop One，美國）檢測所提取RNA 的OD260/OD280純度值和濃度。用DNaseⅠ（TaKaRa，大連）處理提取總RNA，去除其中殘留的DNA。cDNA 合成參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）的說明進行操作，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 毛竹PheFT12a基因克隆

根據(jù)PheFT12a序列，運用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物（表1），由杭州有康生物科技有限公司合成。以毛竹葉片cDNA 為模板行PCR 擴增。PCR 反應(yīng)體系共50 μL：Green Taq Mix 25 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 15 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將回收產(chǎn)物連接pMD18-T 克隆載體（TaKaRa，大連）并轉(zhuǎn)化，挑取陽性克隆交送杭州有康生物科技有限公司測序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息學(xué)分析

參考文獻［4-5，16］中的FT亞家族信息，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因組數(shù)據(jù)庫（http：//www.ricedata.cn/gene/index.htm）中下載相應(yīng)序列；毛竹FT亞家族成員的鑒定及分析方法借鑒Zhao 等［1］的研究，以擬南芥和水稻中已公布的AtFT及Hd3a序列作為基準序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫（http：//forestry.fafu.edu.cn/db/PhePacBio/blast/blast_cs.php？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）中進行本地blast，Evalue 值設(shè)為1e-10，將比對結(jié)果用TBtools（v1.059）軟件從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫中進行抽取，將提取序列用Pfam（PF01161）及HAMMER3.0 軟件進行驗證；利用GSDS 2.0 進行基因結(jié)構(gòu)分析；利用Clustal W 網(wǎng)站（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進行多序列比對；利用MEGA X 軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建蛋白質(zhì)矩陣的系統(tǒng)進化樹，進化模型選擇Jones-Taylor-Thornton（JTT）model，bootstrap 值設(shè)為1 000以檢驗各分支可靠性；利用Expasy的protparam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）計算氨基酸理化性質(zhì)；通過Expasy 的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的親、疏水性；利用PRABI 的SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進行蛋白質(zhì)二級結(jié)構(gòu)預(yù)測；以水稻Hd3a 蛋白結(jié)構(gòu)為模板，通過Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）進行三級結(jié)構(gòu)預(yù)測；利用PlantCARE 在線軟件對起始密碼子上游2 000 bp 的序列進行啟動子順式作用元件分析；采用NCBI Conserved Domain Database（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）軟件分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 qRT-PCR

根據(jù)獲得的PheFT12a基因cDNA序列，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計引物（表1），由杭州有康生物科技有限公司合成。以在毛竹各組織及條件下穩(wěn)定表達的PheUBQ為內(nèi)參基因［10，17］。PCR反應(yīng)體系共10 μL：cDNA 0.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，TB Green?Premix Ex Taq? II（TaKaRa，大連）5 μL，ddH2O 3.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，39個循環(huán)；每個反應(yīng)設(shè)定3次。采用2-ΔΔCt法計算毛竹PheFT12a在不同組織的相對表達量，采用IBM SPSS Statistics26.0軟件進行單因素方差分析。

1.6 亞細胞定位

根據(jù)PheFT12a序列設(shè)計含有酶切位點引物（表1），以前期獲得的目的基因克隆質(zhì)粒為模板進行PCR 擴增，電泳、切膠回收目的條帶。

通過同源重組的方法構(gòu)建亞細胞定位重組載體：用BamHⅠ對植物熒光表達載體pCAMBIA1300-GFP的質(zhì)粒進行單酶切，酶切體系為50 μL：10×QuickCut Green Buffer 5 μL，BamHⅠ1 μL，載體2 μg，加ddH2O至總體積為50 μL，30 ℃金屬浴酶切5 min，電泳檢測是否酶切完全，切膠回收。運用同源重組酶將目的基因擴增片段純化產(chǎn)物與酶切后的載體連接，連接體系為：10 μL 目的基因2 μL，載體1.5 μL，5×CEⅡBuffer 2 μL，ExnaseⅡ3 μL，ddH2O 1.5 μL，37 ℃金屬浴連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，涂布于50 μg·mL-1卡那霉素的溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取單克隆，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對單克隆進行菌液PCR檢測，將含重組質(zhì)粒的菌液送至杭州有康生物科技有限公司測序。將測序正確的陽性菌擴大培養(yǎng)，再進行無內(nèi)毒素質(zhì)粒大提。

選取在育苗基質(zhì)中培養(yǎng)1～2 周大小的擬南芥，通過酶解液法提取原生質(zhì)體，利用PEG 法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至原生質(zhì)體。制片后用激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國）觀察蛋白定位。

1.7 植物表達載體構(gòu)建

用XbaⅠ和KpnⅠ對表達載體pCAMBIA1301 進行雙酶切，酶切體系為50 μL：XbaⅠ1 μL，KpnⅠ1 μL，10×QuickCut Green Buffer 5 μL，載體1 μg，加ddH2O至總體積為50 μL，37 ℃金屬浴酶切30 min，電泳檢測是否酶切完全，切膠回收。將酶切后的表達載體與目的基因片段進行重組反應(yīng)，后續(xù)操作同亞細胞定位載體構(gòu)建。將測序正確的陽性菌擴大培養(yǎng)之后進行質(zhì)粒小提。

1.8 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

選擇已開花且初具果莢、莖葉健壯的擬南芥ft突變體，剪去其果莢，澆透水備用。在含利福平和卡那霉素YEP 固體培養(yǎng)基上接種含pCAMBIA1301-PheFT12a載體的陽性農(nóng)桿菌，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于YEP 液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0，離心收集菌體，用提前配好的轉(zhuǎn)化液（50 mL：0.11 g 1/2 MS粉末+5%蔗糖+5 μL Silwet-77）懸浮農(nóng)桿菌菌體。將擬南芥花序完全浸入轉(zhuǎn)化液中，侵染20～30 s，侵染結(jié)束，暗培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至正常光照培養(yǎng)，重復(fù)侵染2 次，之后正常培養(yǎng)。待果莢成熟后收種，種子放變色硅膠，于4 ℃冰箱中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PheFT12a基因克隆及生物信息學(xué)分析

以毛竹實生苗葉片cDNA 為模板，以全長引物PheFT12a-F/R（表1）進行PCR 擴增。電泳結(jié)果顯示，擴增片段大小約500 bp，與預(yù)期目的片段大小一致（圖1-A）。測序結(jié)果顯示，擴增片段大小長為522 bp。

圖1 PheFT12a基因克隆及生信分析Fig.1 Cloning and bioinformatics analysis of PheFT12a

生信分析顯示，PheFT12a基因定位于scaffold 8，包含4個外顯子和3個內(nèi)含子，第2和第3外顯子分別長62 和41 bp，具有FT基因典型的結(jié)構(gòu)特征（圖1-B），內(nèi)含子的剪接位點為保守的GT-AG。

PheFT12a基因編碼173 個氨基酸，含有PEBP 保守結(jié)構(gòu)域，屬于FT-Like 亞家族。與AtFT 氨基酸序列相似性為60.8%，與Hd3a 氨基酸序列相似性為59.78%，與OsFTL12 氨基酸序列相似性為94.15%。蛋白序列比對結(jié)果顯示，PheFT12a的85 位為保守的酪氨酸殘基Y，同時含有維持PEBP 家族功能的T66、D73、E84、P94、G102 等9 個氨基酸殘基，以及形成開花復(fù)合體（florigen activation complex，F(xiàn)AC）所必需的氨基酸位點D62、R64、P96、T99、F103 和R132（圖1-C），該結(jié)果提示PheFT12a可能參與開花調(diào)控。

蛋白序列分析結(jié)果表明，PheFT12a蛋白分子量為19.31 kD，等電點為8.88，不穩(wěn)定指數(shù)為44.66，平均疏水性為-0.22，脂肪指數(shù)為74.28。

通過Expasy 在線SOPMA 程序?qū)heFT12a氨基酸序列進行二級結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，其二級結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無規(guī)則卷曲組成，其中無規(guī)則卷曲形式最為豐富，為53.18%，其次是延伸鏈和α-螺旋，分別為24.86%、16.76%（圖1-D）。采用同源建模法（以水稻Hd3a 為參照）預(yù)測PheFT12a的三級結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PheFT12a與水稻Hd3a 的三級結(jié)構(gòu)一致度為61.59%，提示PheFT12a與Hd3a 的功能可能存在一定相似性（圖1-E）。

2.2 毛竹PheFT12a蛋白聚類分析

將擬南芥及水稻中的FT 亞家族與毛竹FT 亞家族構(gòu)建系統(tǒng)進化樹（氨基酸序列），結(jié)果如圖2 所示，PheFT12a蛋白首先與水稻OsFTL12 聚在一類，親緣關(guān)系最近，再與水稻的其他4條FT聚在一個小分支上，其中OsFTL10 已被證明具有促進開花的功能［18］。而與Hd3a 及RFT1 親緣關(guān)系相對較遠，表明在長期進化過程中，PheFT12a蛋白功能上與Hd3a 及RFT1 存在有一定差異，但可能依舊參與開花。

圖2 基于ML法構(gòu)建毛竹與擬南芥、水稻FT蛋白的系統(tǒng)進化樹Fig.2 Phylogenetic tree of FT proteins from Arabidopsis，rice and moso bamboo on ML method

2.3 PheFT12a順式作用元件分析

對PheFT12a起始密碼子上游2 000 bp的序列進行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，PheFT12a啟動子含有響應(yīng)非生物脅迫以及激素的順式作用元件，包括ABRE（參與脫落酸響應(yīng)，abscisic acid responsive elements）、P-box（參與赤霉素響應(yīng)）、G-box（參與光響應(yīng)）、circadian（參與晝夜節(jié)律調(diào)控）和MBS（參與干旱誘導(dǎo)，MYBbinding sites）等（表2）。結(jié)果表明，PheFT12a基因表達可能受外界環(huán)境如光照、干旱及激素的影響。

2.4 PheFT12a組織特異性分析

為了解PheFT12a基因在毛竹不同組織中的表達情況，對二月齡毛竹實生苗的根、莖、葉、側(cè)芽中的基因表達量進行檢測，結(jié)果顯示，PheFT12a基因在葉片中表達量最高，莖次之，側(cè)芽和根中相對較低（圖3）。

圖3 PheFT12a基因在不同組織中的表達量Fig.3 Expressionof the PheFT12a gene in different tissues

2.5 亞細胞定位分析

為確定PheFT12a 蛋白的亞細胞定位，構(gòu)建了PheFT12a-GFP融合蛋白表達載體，通過PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的亞細胞定位。結(jié)果如圖4所示，對照GFP蛋白在細胞中均有分布，而PheFT12a-GFP 融合蛋白在細胞質(zhì)和細胞核有明顯的熒光信號，主要富集于細胞核。

圖4 PheFT12a蛋白的亞細胞定位Fig.4 Subcellular localization of PheFT12a protein

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察

為了進一步研究PheFT12a的生物學(xué)功能，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體35S∷PheFT12a轉(zhuǎn)化ft突變體。對突變體回補植株進行DNA 水平及RNA 水平檢測，PheFT12a基因已整合進突變體植株中（圖5-A），并且在回補植株中穩(wěn)定表達（圖5-B）。

圖5 PheFT12a回補ft突變體植株開花表型Fig.5 Flowering phenotype of ft mutant transformed with 35S∷PheFT12a

將1/2 MS培養(yǎng)基上生長7 d的擬南芥純合植株移至育苗基質(zhì)中，14 d后野生型擬南芥抽薹，ft突變體在47 d左右抽薹，而突變體回補植株在18～21 d抽薹。突變體回補植株的抽薹時間比野生型晚6 d左右，但顯著早于ft突變體，部分回補了ft突變體的晚花表型（圖5-C、D）。上述結(jié)果，表明，PheFT12a是開花促進因子，促進開花現(xiàn)象明顯。

移植18 d 左右時，野生型和ft突變體主莖數(shù)均為1，而突變體回補植株主莖數(shù)增多，為2～3 個。統(tǒng)計分析顯示，突變體回補植株的主莖數(shù)與野生型和突變體存在顯著差異（圖6-A、B）。在擬南芥生長56 d 時，野生型擬南芥的側(cè)枝數(shù)平均為15 個，ft突變體的側(cè)枝數(shù)約為16 個，而突變體回補植株的側(cè)枝數(shù)顯著增加，達到23～24 個（圖6-C、D），說明PheFT12a會影響擬南芥?zhèn)妊堪l(fā)育。由此可見，PheFT12a可以影響擬南芥開花時間，還可以參與擬南芥?zhèn)妊堪l(fā)育。

圖6 PheFT12a回補ft突變體植株主莖及側(cè)枝表型Fig.6 Stem and lateral branch phenotype of ft mutant transformed with 35S∷PheFT12a

3 討論

FT 蛋白最初被證實是成花素的主要成分之一，決定著植物的開花時間［4-5］。近年來，越來越多的研究表明，F(xiàn)T蛋白還可促進鱗莖形成［19-20］、塊莖形成［21］、側(cè)枝生長及芽的形成［22-23］以及改變植株形態(tài)［24］。

不同物種中FT亞家族成員數(shù)量差異很大，擬南芥和水稻中分別有1和13個［4，16］，玉米（Zeamays）中有15個［25］。通過全基因組分析，本研究從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫（V2.0）中鑒定到18個FT成員。本研究從毛竹中獲得的FT基因，與水稻中的OsFTL12相似性最高（圖2），其編碼的氨基酸序列含保守的PEBP結(jié)構(gòu)域、維持PEBP蛋白功能的保守氨基酸及形成開花復(fù)合體的必需氨基酸（圖1），推測本研究中的PheFT12a可能影響植物開花時間。

多種植物中的研究結(jié)果表明，F(xiàn)T-like 蛋白主要在細胞質(zhì)和細胞核富集（圖4）［26-27］。毛竹中FT基因家族各成員表達量均較低，轉(zhuǎn)錄組測序很難檢測到PheFT12a的表達［1，28］。本研究通過qRT-PCR 檢測到PheFT12a在葉中表達量最高，莖次之，在根和側(cè)芽中表達量均很低。FT基因的表達易受外界環(huán)境因子的影響。菊花（Chrysanthemummorifolium）CmFT的表達具明顯的晝夜節(jié)律特性［29］；毛竹PheFT6和PheFT17的基因表達受晝夜節(jié)律、溫度、干旱等外界環(huán)境的影響［15］。本研究中PheFT12a基因啟動子上包含多個干旱、光照及激素相關(guān)的順式作用元件，推測該基因的表達可能受上述外界環(huán)境的影響。

如前所述，F(xiàn)T 蛋白最初被證實是成花素，擬南芥FT被CONSTANS（CO）激活后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白FTINTERACTING Protein 1（FTIP1）相互作用，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)運以誘導(dǎo)開花［30］，反之FT 功能喪失后開花延遲［31］；水稻Hd3a 蛋白從葉片運輸?shù)巾敹朔稚M織中，先與14-3-3 蛋白相互作用，然后與FD 蛋白結(jié)合，形成FAC，繼而激活下游開花基因APETALA1（AP1）表達，誘導(dǎo)水稻開花［6，27］。另外，水稻中的RFT1和OsFTL10都可促進開花［18，32］。在多種植物中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T-like在其他發(fā)育階段也發(fā)揮著重要作用，水稻中的成花素蛋白Hd3a 還可以提高水稻分蘗數(shù)［13］。異源過表達棉花GhFT1可以促使煙草基部側(cè)枝增多，誘導(dǎo)蓮座葉片腋部出現(xiàn)更多的腋芽［14］。小麥（Triticumaestivum）中的FT-B1可影響每穗的總小穗數(shù)［33］。楊樹（Populus）的FT2基因過表達可導(dǎo)致開花顯著提前［34］，還可以調(diào)控楊樹年生長周期［35］。同為禾本科的毛竹有性繁殖和無性繁殖并存，開花很不規(guī)律，開花時間很難預(yù)測。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在長期進化過程中，毛竹PheFT6和PheFT17的功能可能發(fā)生變異，PheFT6可能影響筍芽休眠狀態(tài)解除，PheFT17基因可能參與筍芽的發(fā)育［15］，但生物學(xué)功能并未證實，有關(guān)毛竹FT亞家族各成員生物學(xué)功能的研究鮮見報道。Yang等［9］研究發(fā)現(xiàn)毛竹PhFT4可促進擬南芥開花。與前人研究不同的是，本文中的毛竹PheFT12a基因既可以影響擬南芥開花時間，也可以影響擬南芥芽發(fā)育，暗示該基因的功能存在分化的可能性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，PheFT12a基因編碼的蛋白主要富集于細胞核；PheFT12a可以部分回補ft突變體的晚花表型，還可以促進回補植株的主莖及側(cè)枝發(fā)育。