張雨佳 劉 麗 鄒龍海 周敏舒 暢 欣 郭小勤

（浙江農(nóng)林大學(xué)，省部共建亞熱帶森林培育國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/竹子研究院，浙江 杭州 311300）

毛竹（Phyllostachysedulis）是我國(guó)南方最重要的林業(yè)資源之一，在經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境等方面發(fā)揮著重要作用。毛竹有其獨(dú)特的生物學(xué)特性，一旦開(kāi)花，就會(huì)大面積死亡；且主要靠無(wú)性繁殖繁育，即筍芽發(fā)育形成筍，再長(zhǎng)成竹，但自然界中毛竹筍芽發(fā)育率極低，僅為5%～8%［1］。

FLOWERING LOCUS T（FT）亞家族為磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP）家族的3個(gè)亞家族之一，該亞家族只有1個(gè)結(jié)構(gòu)域（PEBP結(jié)構(gòu)域），該結(jié)構(gòu)域在動(dòng)植物中均很保守［2-3］。模式植物擬南芥（Arabidopsisthaliana）中只有1 個(gè)FT蛋白，可長(zhǎng)距離運(yùn)輸調(diào)控開(kāi)花時(shí)間，是成花素的主要成分之一［4-5］。隨后在多種植物中也證實(shí)了FT 直系同源蛋白是成花素的主要成分。水稻（Oryzasativa）中的成花素Heading date 3a（Hd3a）調(diào)控開(kāi)花的功能與FT 類(lèi)似，在野生型水稻中過(guò)表達(dá)Hd3a引起早花表型，插入Hd3a拷貝數(shù)越多，早花表型越明顯［6］。紫蘇（Perilla frutescens）和木薯（Manihotesculenta）中FT基因的同系物均可促進(jìn)開(kāi)花［7-8］。近期研究發(fā)現(xiàn)，在擬南芥中過(guò)表達(dá)毛竹PhFT4基因可使植株提前開(kāi)花［9］。麻竹（Dendrocalamuslatiflorus）中的成花素候選基因DlFT1在開(kāi)花植株中的表達(dá)量顯著上調(diào)，過(guò)表達(dá)DlFT1的水稻表現(xiàn)出強(qiáng)烈的早花表型，過(guò)表達(dá)DlFT1的麻竹可直接從愈傷組織中分化出小穗［10］。

除調(diào)控開(kāi)花外，F(xiàn)T 蛋白在植物發(fā)育過(guò)程中還發(fā)揮著其他作用：光葉薔薇（Rosawichuraiana）的兩個(gè)FT-like基因功能發(fā)生了分化，其中RwFT1可能參與光周期調(diào)控及芽休眠，而RwFT2則參與冷響應(yīng)及花發(fā)育［11］。在芥菜型油菜（Brassicajuncea）中過(guò)表達(dá)BjuFT會(huì)出現(xiàn)分枝模式和角果形狀的變化，花出現(xiàn)畸形［12］。除促進(jìn)開(kāi)花外，水稻中Hd3a還可以在腋生分生組織中積累，促使側(cè)芽向外長(zhǎng)出形成分蘗［13］。在煙草（Nicotiana tabacum）中異位過(guò)表達(dá)陸地棉（Gossypiumhirsutum）GhFT1可使煙草開(kāi)花提前，還可以促進(jìn)煙草基部的側(cè)芽生長(zhǎng)，誘導(dǎo)蓮座葉腋芽增多［14］。浙江農(nóng)林大學(xué)分子育種與筍用林團(tuán)隊(duì)前期研究發(fā)現(xiàn)，毛竹中至少存在16個(gè)FT-like基因，推測(cè)某些FT基因可能參與筍芽發(fā)育［1，15］，但相關(guān)生物學(xué)功能仍有待進(jìn)一步研究。

鑒于此，本研究擬用實(shí)時(shí)熒光定量PCR（quantitative real-time PCR，qRT-PCR）技術(shù)分析毛竹PheFT12a基因的表達(dá)模式，通過(guò)聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）介導(dǎo)的擬南芥原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化技術(shù)分析PheFT12a蛋白的亞細(xì)胞定位，通過(guò)農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥ft突變體分析其生物學(xué)功能，旨在為深入探討毛竹FT基因家族的生物學(xué)功能提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究中的毛竹種子采自廣西桂林，將毛竹種子剝殼，用無(wú)水乙醇浸泡3 min，連續(xù)用反滲透（reverses osmosis，RO）水充分沖洗兩次后浸泡2～3 d，期間每隔24 h 換一次水。將浸泡好的種子取出，均勻地平鋪在已經(jīng)鋪好紗布的水培育苗托盤(pán)上，罩住保鮮膜，室溫靜置發(fā)芽，在自然條件下培養(yǎng)，常規(guī)栽培管理。

擬南芥種植：取干燥處理后的擬南芥種子（Col-0基因型），無(wú)水乙醇清洗1 次，再用75%乙醇洗2～3 次，每次清洗2 min 左右，于超凈工作臺(tái)內(nèi)，將消毒好的擬南芥種子吸出，打在滅菌濾紙上晾干。晾干后，將其均勻撒在1/2 MS 固體培養(yǎng)基上，封口膜密封。在4 ℃冰箱內(nèi)春化處理3 d，然后將其轉(zhuǎn)移至育苗室，培養(yǎng)一周左右，將發(fā)芽的苗移至育苗基質(zhì)，常規(guī)栽培管理。

1.2 總RNA提取及cDNA合成

采集生長(zhǎng)2 個(gè)月的毛竹實(shí)生苗各組織，迅速放入液氮中。采用Trizol（Invitrogen，美國(guó)）法提取各組織總RNA，用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)提取的RNA 完整性，用超微量紫外分光光度計(jì)（NanoDrop One，美國(guó)）檢測(cè)所提取RNA 的OD260/OD280純度值和濃度。用DNaseⅠ（TaKaRa，大連）處理提取總RNA，去除其中殘留的DNA。cDNA 合成參照PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒（TaKaRa，大連）的說(shuō)明進(jìn)行操作，置于-80℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 毛竹PheFT12a基因克隆

根據(jù)PheFT12a序列，運(yùn)用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物（表1），由杭州有康生物科技有限公司合成。以毛竹葉片cDNA 為模板行PCR 擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系共50 μL：Green Taq Mix 25 μL，10 μmol·L-1上下游引物各2.5 μL，cDNA 5 μL，ddH2O 15 μL。PCR 反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性30 s，65 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，34個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸10 min。將回收產(chǎn)物連接pMD18-T 克隆載體（TaKaRa，大連）并轉(zhuǎn)化，挑取陽(yáng)性克隆交送杭州有康生物科技有限公司測(cè)序。

表1 引物信息Table 1 Primer information

1.4 生物信息學(xué)分析

參考文獻(xiàn)［4-5，16］中的FT亞家族信息，從擬南芥基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（https：//www.arabidopsis.org/）和水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//www.ricedata.cn/gene/index.htm）中下載相應(yīng)序列；毛竹FT亞家族成員的鑒定及分析方法借鑒Zhao 等［1］的研究，以擬南芥和水稻中已公布的AtFT及Hd3a序列作為基準(zhǔn)序列在毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//forestry.fafu.edu.cn/db/PhePacBio/blast/blast_cs.php？tdsourcetag=s_pcqq_aiomsg）中進(jìn)行本地blast，Evalue 值設(shè)為1e-10，將比對(duì)結(jié)果用TBtools（v1.059）軟件從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行抽取，將提取序列用Pfam（PF01161）及HAMMER3.0 軟件進(jìn)行驗(yàn)證；利用GSDS 2.0 進(jìn)行基因結(jié)構(gòu)分析；利用Clustal W 網(wǎng)站（https：//www.genome.jp/tools-bin/clustalw）進(jìn)行多序列比對(duì)；利用MEGA X 軟件中的最大似然法（maximum likelihood，ML）構(gòu)建蛋白質(zhì)矩陣的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)，進(jìn)化模型選擇Jones-Taylor-Thornton（JTT）model，bootstrap 值設(shè)為1 000以檢驗(yàn)各分支可靠性；利用Expasy的protparam在線軟件（http：//web.expasy.org/protparam/）計(jì)算氨基酸理化性質(zhì)；通過(guò)Expasy 的ProtScale（https：//web.expasy.org/protscale/）分析蛋白質(zhì)的親、疏水性；利用PRABI 的SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=npsa_sopma.html）進(jìn)行蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；以水稻Hd3a 蛋白結(jié)構(gòu)為模板，通過(guò)Swiss-Model（http：//swissmodel.expasy.org/interactive）進(jìn)行三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)；利用PlantCARE 在線軟件對(duì)起始密碼子上游2 000 bp 的序列進(jìn)行啟動(dòng)子順式作用元件分析；采用NCBI Conserved Domain Database（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）軟件分析蛋白保守結(jié)構(gòu)域。

1.5 qRT-PCR

根據(jù)獲得的PheFT12a基因cDNA序列，采用Primer Premier 5.0 設(shè)計(jì)引物（表1），由杭州有康生物科技有限公司合成。以在毛竹各組織及條件下穩(wěn)定表達(dá)的PheUBQ為內(nèi)參基因［10，17］。PCR反應(yīng)體系共10 μL：cDNA 0.5 μL，10 μmol·L-1上下游引物各0.4 μL，TB Green?Premix Ex Taq? II（TaKaRa，大連）5 μL，ddH2O 3.7 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，39個(gè)循環(huán)；每個(gè)反應(yīng)設(shè)定3次。采用2-ΔΔCt法計(jì)算毛竹PheFT12a在不同組織的相對(duì)表達(dá)量，采用IBM SPSS Statistics26.0軟件進(jìn)行單因素方差分析。

1.6 亞細(xì)胞定位

根據(jù)PheFT12a序列設(shè)計(jì)含有酶切位點(diǎn)引物（表1），以前期獲得的目的基因克隆質(zhì)粒為模板進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，電泳、切膠回收目的條帶。

通過(guò)同源重組的方法構(gòu)建亞細(xì)胞定位重組載體：用BamHⅠ對(duì)植物熒光表達(dá)載體pCAMBIA1300-GFP的質(zhì)粒進(jìn)行單酶切，酶切體系為50 μL：10×QuickCut Green Buffer 5 μL，BamHⅠ1 μL，載體2 μg，加ddH2O至總體積為50 μL，30 ℃金屬浴酶切5 min，電泳檢測(cè)是否酶切完全，切膠回收。運(yùn)用同源重組酶將目的基因擴(kuò)增片段純化產(chǎn)物與酶切后的載體連接，連接體系為：10 μL 目的基因2 μL，載體1.5 μL，5×CEⅡBuffer 2 μL，ExnaseⅡ3 μL，ddH2O 1.5 μL，37 ℃金屬浴連接30 min。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化至DH5α中，涂布于50 μg·mL-1卡那霉素的溶菌肉湯（Luria-Bertani，LB）固體培養(yǎng)基上培養(yǎng)。挑取單克隆，液體培養(yǎng)基培養(yǎng)，對(duì)單克隆進(jìn)行菌液PCR檢測(cè)，將含重組質(zhì)粒的菌液送至杭州有康生物科技有限公司測(cè)序。將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)，再進(jìn)行無(wú)內(nèi)毒素質(zhì)粒大提。

選取在育苗基質(zhì)中培養(yǎng)1～2 周大小的擬南芥，通過(guò)酶解液法提取原生質(zhì)體，利用PEG 法將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化至原生質(zhì)體。制片后用激光共聚焦顯微鏡（Leica，德國(guó)）觀察蛋白定位。

1.7 植物表達(dá)載體構(gòu)建

用XbaⅠ和KpnⅠ對(duì)表達(dá)載體pCAMBIA1301 進(jìn)行雙酶切，酶切體系為50 μL：XbaⅠ1 μL，KpnⅠ1 μL，10×QuickCut Green Buffer 5 μL，載體1 μg，加ddH2O至總體積為50 μL，37 ℃金屬浴酶切30 min，電泳檢測(cè)是否酶切完全，切膠回收。將酶切后的表達(dá)載體與目的基因片段進(jìn)行重組反應(yīng)，后續(xù)操作同亞細(xì)胞定位載體構(gòu)建。將測(cè)序正確的陽(yáng)性菌擴(kuò)大培養(yǎng)之后進(jìn)行質(zhì)粒小提。

1.8 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化

選擇已開(kāi)花且初具果莢、莖葉健壯的擬南芥ft突變體，剪去其果莢，澆透水備用。在含利福平和卡那霉素YEP 固體培養(yǎng)基上接種含pCAMBIA1301-PheFT12a載體的陽(yáng)性農(nóng)桿菌，28 ℃培養(yǎng)48 h，挑取單菌落接種于YEP 液體培養(yǎng)基，28 ℃培養(yǎng)至OD600=0.8～1.0，離心收集菌體，用提前配好的轉(zhuǎn)化液（50 mL：0.11 g 1/2 MS粉末+5%蔗糖+5 μL Silwet-77）懸浮農(nóng)桿菌菌體。將擬南芥花序完全浸入轉(zhuǎn)化液中，侵染20～30 s，侵染結(jié)束，暗培養(yǎng)24 h，轉(zhuǎn)移至正常光照培養(yǎng)，重復(fù)侵染2 次，之后正常培養(yǎng)。待果莢成熟后收種，種子放變色硅膠，于4 ℃冰箱中保存。

2 結(jié)果與分析

2.1 PheFT12a基因克隆及生物信息學(xué)分析

以毛竹實(shí)生苗葉片cDNA 為模板，以全長(zhǎng)引物PheFT12a-F/R（表1）進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。電泳結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小約500 bp，與預(yù)期目的片段大小一致（圖1-A）。測(cè)序結(jié)果顯示，擴(kuò)增片段大小長(zhǎng)為522 bp。

圖1 PheFT12a基因克隆及生信分析Fig.1 Cloning and bioinformatics analysis of PheFT12a

生信分析顯示，PheFT12a基因定位于scaffold 8，包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，第2和第3外顯子分別長(zhǎng)62 和41 bp，具有FT基因典型的結(jié)構(gòu)特征（圖1-B），內(nèi)含子的剪接位點(diǎn)為保守的GT-AG。

PheFT12a基因編碼173 個(gè)氨基酸，含有PEBP 保守結(jié)構(gòu)域，屬于FT-Like 亞家族。與AtFT 氨基酸序列相似性為60.8%，與Hd3a 氨基酸序列相似性為59.78%，與OsFTL12 氨基酸序列相似性為94.15%。蛋白序列比對(duì)結(jié)果顯示，PheFT12a的85 位為保守的酪氨酸殘基Y，同時(shí)含有維持PEBP 家族功能的T66、D73、E84、P94、G102 等9 個(gè)氨基酸殘基，以及形成開(kāi)花復(fù)合體（florigen activation complex，F(xiàn)AC）所必需的氨基酸位點(diǎn)D62、R64、P96、T99、F103 和R132（圖1-C），該結(jié)果提示PheFT12a可能參與開(kāi)花調(diào)控。

蛋白序列分析結(jié)果表明，PheFT12a蛋白分子量為19.31 kD，等電點(diǎn)為8.88，不穩(wěn)定指數(shù)為44.66，平均疏水性為-0.22，脂肪指數(shù)為74.28。

通過(guò)Expasy 在線SOPMA 程序?qū)heFT12a氨基酸序列進(jìn)行二級(jí)結(jié)構(gòu)分析，結(jié)果顯示，其二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由α-螺旋、β-折疊、延伸鏈和無(wú)規(guī)則卷曲組成，其中無(wú)規(guī)則卷曲形式最為豐富，為53.18%，其次是延伸鏈和α-螺旋，分別為24.86%、16.76%（圖1-D）。采用同源建模法（以水稻Hd3a 為參照）預(yù)測(cè)PheFT12a的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果顯示，PheFT12a與水稻Hd3a 的三級(jí)結(jié)構(gòu)一致度為61.59%，提示PheFT12a與Hd3a 的功能可能存在一定相似性（圖1-E）。

2.2 毛竹PheFT12a蛋白聚類(lèi)分析

將擬南芥及水稻中的FT 亞家族與毛竹FT 亞家族構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)（氨基酸序列），結(jié)果如圖2 所示，PheFT12a蛋白首先與水稻OsFTL12 聚在一類(lèi)，親緣關(guān)系最近，再與水稻的其他4條FT聚在一個(gè)小分支上，其中OsFTL10 已被證明具有促進(jìn)開(kāi)花的功能［18］。而與Hd3a 及RFT1 親緣關(guān)系相對(duì)較遠(yuǎn)，表明在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，PheFT12a蛋白功能上與Hd3a 及RFT1 存在有一定差異，但可能依舊參與開(kāi)花。

圖2 基于ML法構(gòu)建毛竹與擬南芥、水稻FT蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.2 Phylogenetic tree of FT proteins from Arabidopsis，rice and moso bamboo on ML method

2.3 PheFT12a順式作用元件分析

對(duì)PheFT12a起始密碼子上游2 000 bp的序列進(jìn)行順式作用元件分析，結(jié)果顯示，PheFT12a啟動(dòng)子含有響應(yīng)非生物脅迫以及激素的順式作用元件，包括ABRE（參與脫落酸響應(yīng)，abscisic acid responsive elements）、P-box（參與赤霉素響應(yīng)）、G-box（參與光響應(yīng)）、circadian（參與晝夜節(jié)律調(diào)控）和MBS（參與干旱誘導(dǎo)，MYBbinding sites）等（表2）。結(jié)果表明，PheFT12a基因表達(dá)可能受外界環(huán)境如光照、干旱及激素的影響。

2.4 PheFT12a組織特異性分析

為了解PheFT12a基因在毛竹不同組織中的表達(dá)情況，對(duì)二月齡毛竹實(shí)生苗的根、莖、葉、側(cè)芽中的基因表達(dá)量進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示，PheFT12a基因在葉片中表達(dá)量最高，莖次之，側(cè)芽和根中相對(duì)較低（圖3）。

圖3 PheFT12a基因在不同組織中的表達(dá)量Fig.3 Expressionof the PheFT12a gene in different tissues

2.5 亞細(xì)胞定位分析

為確定PheFT12a 蛋白的亞細(xì)胞定位，構(gòu)建了PheFT12a-GFP融合蛋白表達(dá)載體，通過(guò)PEG介導(dǎo)法轉(zhuǎn)化擬南芥原生質(zhì)體，在激光共聚焦顯微鏡下觀察融合蛋白的亞細(xì)胞定位。結(jié)果如圖4所示，對(duì)照GFP蛋白在細(xì)胞中均有分布，而PheFT12a-GFP 融合蛋白在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核有明顯的熒光信號(hào)，主要富集于細(xì)胞核。

圖4 PheFT12a蛋白的亞細(xì)胞定位Fig.4 Subcellular localization of PheFT12a protein

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥表型觀察

為了進(jìn)一步研究PheFT12a的生物學(xué)功能，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)法將重組載體35S∷PheFT12a轉(zhuǎn)化ft突變體。對(duì)突變體回補(bǔ)植株進(jìn)行DNA 水平及RNA 水平檢測(cè)，PheFT12a基因已整合進(jìn)突變體植株中（圖5-A），并且在回補(bǔ)植株中穩(wěn)定表達(dá)（圖5-B）。

圖5 PheFT12a回補(bǔ)ft突變體植株開(kāi)花表型Fig.5 Flowering phenotype of ft mutant transformed with 35S∷PheFT12a

將1/2 MS培養(yǎng)基上生長(zhǎng)7 d的擬南芥純合植株移至育苗基質(zhì)中，14 d后野生型擬南芥抽薹，ft突變體在47 d左右抽薹，而突變體回補(bǔ)植株在18～21 d抽薹。突變體回補(bǔ)植株的抽薹時(shí)間比野生型晚6 d左右，但顯著早于ft突變體，部分回補(bǔ)了ft突變體的晚花表型（圖5-C、D）。上述結(jié)果，表明，PheFT12a是開(kāi)花促進(jìn)因子，促進(jìn)開(kāi)花現(xiàn)象明顯。

移植18 d 左右時(shí)，野生型和ft突變體主莖數(shù)均為1，而突變體回補(bǔ)植株主莖數(shù)增多，為2～3 個(gè)。統(tǒng)計(jì)分析顯示，突變體回補(bǔ)植株的主莖數(shù)與野生型和突變體存在顯著差異（圖6-A、B）。在擬南芥生長(zhǎng)56 d 時(shí)，野生型擬南芥的側(cè)枝數(shù)平均為15 個(gè)，ft突變體的側(cè)枝數(shù)約為16 個(gè)，而突變體回補(bǔ)植株的側(cè)枝數(shù)顯著增加，達(dá)到23～24 個(gè)（圖6-C、D），說(shuō)明PheFT12a會(huì)影響擬南芥?zhèn)妊堪l(fā)育。由此可見(jiàn)，PheFT12a可以影響擬南芥開(kāi)花時(shí)間，還可以參與擬南芥?zhèn)妊堪l(fā)育。

圖6 PheFT12a回補(bǔ)ft突變體植株主莖及側(cè)枝表型Fig.6 Stem and lateral branch phenotype of ft mutant transformed with 35S∷PheFT12a

3 討論

FT 蛋白最初被證實(shí)是成花素的主要成分之一，決定著植物的開(kāi)花時(shí)間［4-5］。近年來(lái)，越來(lái)越多的研究表明，F(xiàn)T蛋白還可促進(jìn)鱗莖形成［19-20］、塊莖形成［21］、側(cè)枝生長(zhǎng)及芽的形成［22-23］以及改變植株形態(tài)［24］。

不同物種中FT亞家族成員數(shù)量差異很大，擬南芥和水稻中分別有1和13個(gè)［4，16］，玉米（Zeamays）中有15個(gè)［25］。通過(guò)全基因組分析，本研究從毛竹基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（V2.0）中鑒定到18個(gè)FT成員。本研究從毛竹中獲得的FT基因，與水稻中的OsFTL12相似性最高（圖2），其編碼的氨基酸序列含保守的PEBP結(jié)構(gòu)域、維持PEBP蛋白功能的保守氨基酸及形成開(kāi)花復(fù)合體的必需氨基酸（圖1），推測(cè)本研究中的PheFT12a可能影響植物開(kāi)花時(shí)間。

多種植物中的研究結(jié)果表明，F(xiàn)T-like 蛋白主要在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核富集（圖4）［26-27］。毛竹中FT基因家族各成員表達(dá)量均較低，轉(zhuǎn)錄組測(cè)序很難檢測(cè)到PheFT12a的表達(dá)［1，28］。本研究通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)到PheFT12a在葉中表達(dá)量最高，莖次之，在根和側(cè)芽中表達(dá)量均很低。FT基因的表達(dá)易受外界環(huán)境因子的影響。菊花（Chrysanthemummorifolium）CmFT的表達(dá)具明顯的晝夜節(jié)律特性［29］；毛竹PheFT6和PheFT17的基因表達(dá)受晝夜節(jié)律、溫度、干旱等外界環(huán)境的影響［15］。本研究中PheFT12a基因啟動(dòng)子上包含多個(gè)干旱、光照及激素相關(guān)的順式作用元件，推測(cè)該基因的表達(dá)可能受上述外界環(huán)境的影響。

如前所述，F(xiàn)T 蛋白最初被證實(shí)是成花素，擬南芥FT被CONSTANS（CO）激活后與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜蛋白FTINTERACTING Protein 1（FTIP1）相互作用，從而介導(dǎo)轉(zhuǎn)運(yùn)以誘導(dǎo)開(kāi)花［30］，反之FT 功能喪失后開(kāi)花延遲［31］；水稻Hd3a 蛋白從葉片運(yùn)輸?shù)巾敹朔稚M織中，先與14-3-3 蛋白相互作用，然后與FD 蛋白結(jié)合，形成FAC，繼而激活下游開(kāi)花基因APETALA1（AP1）表達(dá)，誘導(dǎo)水稻開(kāi)花［6，27］。另外，水稻中的RFT1和OsFTL10都可促進(jìn)開(kāi)花［18，32］。在多種植物中發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)T-like在其他發(fā)育階段也發(fā)揮著重要作用，水稻中的成花素蛋白Hd3a 還可以提高水稻分蘗數(shù)［13］。異源過(guò)表達(dá)棉花GhFT1可以促使煙草基部側(cè)枝增多，誘導(dǎo)蓮座葉片腋部出現(xiàn)更多的腋芽［14］。小麥（Triticumaestivum）中的FT-B1可影響每穗的總小穗數(shù)［33］。楊樹(shù)（Populus）的FT2基因過(guò)表達(dá)可導(dǎo)致開(kāi)花顯著提前［34］，還可以調(diào)控楊樹(shù)年生長(zhǎng)周期［35］。同為禾本科的毛竹有性繁殖和無(wú)性繁殖并存，開(kāi)花很不規(guī)律，開(kāi)花時(shí)間很難預(yù)測(cè)。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中，毛竹PheFT6和PheFT17的功能可能發(fā)生變異，PheFT6可能影響筍芽休眠狀態(tài)解除，PheFT17基因可能參與筍芽的發(fā)育［15］，但生物學(xué)功能并未證實(shí)，有關(guān)毛竹FT亞家族各成員生物學(xué)功能的研究鮮見(jiàn)報(bào)道。Yang等［9］研究發(fā)現(xiàn)毛竹PhFT4可促進(jìn)擬南芥開(kāi)花。與前人研究不同的是，本文中的毛竹PheFT12a基因既可以影響擬南芥開(kāi)花時(shí)間，也可以影響擬南芥芽發(fā)育，暗示該基因的功能存在分化的可能性。

4 結(jié)論

本研究結(jié)果表明，PheFT12a基因編碼的蛋白主要富集于細(xì)胞核；PheFT12a可以部分回補(bǔ)ft突變體的晚花表型，還可以促進(jìn)回補(bǔ)植株的主莖及側(cè)枝發(fā)育。