翟莎菲,張麗慧,李 雪,劉雅楠,馬笑笑,張 典,劉昌奎

(1西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔組織病理學(xué)教研室,西安 710021;2西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔正畸學(xué)教研室;3西安醫(yī)學(xué)院臨床醫(yī)學(xué)院;4西安醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)部;5西安醫(yī)學(xué)院口腔醫(yī)學(xué)院口腔頜面外科學(xué)教研室;*通訊作者,E-mail:dentistlck@126.com)

牙周炎造成的牙槽骨吸收是導(dǎo)致牙齒喪失的首要原因。很多研究提示氧化應(yīng)激參與骨代謝的調(diào)節(jié)過程。核轉(zhuǎn)錄因子-E2相關(guān)因子2(nuclear factor erythroid-2 related factor 2,Nrf2)作為轉(zhuǎn)錄因子,其本身及其對(duì)氧化應(yīng)激的調(diào)控均參與骨代謝[1]。牙髓干細(xì)胞具有易獲得性和高成骨潛力,是一種有前途的骨再生的細(xì)胞來源。以往的研究顯示,Nrf2是調(diào)節(jié)成骨細(xì)胞和骨形成的重要因素,Nrf2活化參與了牙周膜干細(xì)胞循環(huán)機(jī)械拉伸下的成骨分化[2]。在缺氧環(huán)境下,敲低人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞中的Nrf2表達(dá)會(huì)損害干細(xì)胞標(biāo)志物的表達(dá)和成骨過程,而Nrf2的過表達(dá)能使間充質(zhì)干細(xì)胞增殖增加,細(xì)胞凋亡率顯著降低[3],提示Nrf2對(duì)干細(xì)胞的增殖和分化有調(diào)節(jié)作用。但Nrf2是否能夠調(diào)節(jié)牙髓干細(xì)胞的自我更新和成骨分化能力,目前未見有研究。本研究旨在探索Nrf2過表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移能力和成骨分化的影響,為組織工程學(xué)的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

α-MEM細(xì)胞培養(yǎng)基、Ⅰ型膠原酶、胎牛血清購自美國Gibco公司,慢病毒載體構(gòu)建和病毒包裝由上海吉?jiǎng)P基因公司設(shè)計(jì)及提供;轉(zhuǎn)染試劑lipo2000購自美國Invitrogen公司;茜素紅購自國藥;細(xì)胞增殖MTT檢測(cè)試劑盒和堿性磷酸酶(ALP)試劑盒購自碧云天公司;青鏈霉素、含EDTA的胰蛋白酶、β-甘油磷酸鈉、牛血清白蛋白購自美國Sigma公司;地塞米松、抗壞血酸購自阿拉丁公司;嘌呤霉素購自MCE公司;Q-PCR試劑套裝(Trizol、反轉(zhuǎn)錄及擴(kuò)增試劑盒)購自日本TaKaRa公司。CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱(Heraeus,日本);倒置顯微鏡及照相系統(tǒng)(Olympus公司,日本);酶標(biāo)儀(BioTek,美國);熒光定量PCR儀(ABI,美國);Transwell小室(Corning,美國)。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

實(shí)驗(yàn)經(jīng)過西安醫(yī)學(xué)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn),收集15～24歲在門診因正畸或者阻生要求拔出的健康第三磨牙。參考文獻(xiàn)[4]方法,含青鏈霉素的PBS溶液反復(fù)沖洗清潔牙齒,高速球鉆開髓后無菌取出牙髓組織,剪棄根尖,組織剪碎后加入4 000 mg/L的Ⅰ型膠原酶37 ℃孵箱中消化40 min,PBS漂洗,加入2 ml含20%胎牛血清,100 U/ml青霉素,100 mg/L鏈霉素的α-MEM培養(yǎng)基重懸,單細(xì)胞懸液接種在6孔板,5% CO2、37 ℃培養(yǎng),細(xì)胞匯合80%時(shí),按1∶3傳代,有限稀釋法純化細(xì)胞。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)染效率的驗(yàn)證

細(xì)胞分為Nrf2過表達(dá)組和空病毒組。帶有熒光標(biāo)記的過表達(dá)Nrf2的載體和病毒的包裝由吉?jiǎng)P公司完成。載體名稱:GV358。元件順序?yàn)?Ubi-MCS-3FLAG-SV40-EGFP-IRES-puromycin。載體序列見圖1。按照Lipo2000說明書,將吉?jiǎng)P公司已包裝后的過表達(dá)Nrf2的慢病毒轉(zhuǎn)染人牙髓干細(xì)胞,分別用不同濃度的嘌呤霉素(濃度分別為0.5,1,2,4 mg/L)處理細(xì)胞。分別用不同感染復(fù)數(shù)(multiplicity of infection,MOI,分別為1∶10,1∶100,1∶200和1∶500)的病毒感染細(xì)胞,熒光顯微鏡下觀察,篩選合適的轉(zhuǎn)染條件。通過實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative real time polymerase chain reaction,Q-PCR)對(duì)轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞進(jìn)行篩選和鑒定。Nrf2引物序列Forward:5′-TTCCCGGTCACATCGAGAG-3′,Reverse:5′-TCCTGTTGCATACCGTCTAAATC-3′。

圖1 過表達(dá)Nrf2載體序列

1.4 MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

實(shí)驗(yàn)分為3組:過表達(dá)組、空病毒組和空白組。過表達(dá)組為方法1.3已經(jīng)篩選的穩(wěn)定過表達(dá)Nrf2的牙髓干細(xì)胞;空病毒組為方法1.3已經(jīng)篩選的轉(zhuǎn)染慢病毒對(duì)照載體的牙髓干細(xì)胞;空白組是未加刺激的牙髓干細(xì)胞。MTT實(shí)驗(yàn)步驟如下:各組分別稀釋細(xì)胞,每孔1 000個(gè)細(xì)胞懸液在96孔板中鋪板,每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔,分別在培養(yǎng)時(shí)間到達(dá)24,48,72,96 h時(shí)結(jié)束培養(yǎng),培養(yǎng)時(shí)間結(jié)束后避光,每孔加入10 μl的5 mg/ml MTT,放回培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h,終止培養(yǎng),輕柔吸盡孔內(nèi)液體,避光加入DMSO,酶標(biāo)儀490 nm波長檢測(cè)吸光度(OD值)。

1.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移能力

實(shí)驗(yàn)分2組:過表達(dá)組和空病毒組。過表達(dá)組為方法1.3已經(jīng)篩選的穩(wěn)定過表達(dá)Nrf2的牙髓干細(xì)胞,空病毒組為方法1.3已經(jīng)篩選的轉(zhuǎn)染慢病毒對(duì)照載體的牙髓干細(xì)胞。Transwell實(shí)驗(yàn)方法如下:將各組細(xì)胞按照1×105個(gè)/ml重懸于100 μl無血清(含0.1%牛血清白蛋白)培養(yǎng)基,接種細(xì)胞入Transwell小室的上室,下室加600 μl α-MEM培養(yǎng)基,將細(xì)胞在37 ℃下孵育4 h。取出含有過濾器的上部腔室,用甲醇固定細(xì)胞15 min。用棉簽小心地去除膜上部未遷移的細(xì)胞,用1 mg/L DAPI染色膜下部細(xì)胞5 min,熒光顯微鏡下觀察。在8個(gè)隨機(jī)的視野中統(tǒng)計(jì)遷移細(xì)胞數(shù)量。

1.6 茜素紅染色檢測(cè)鈣化結(jié)節(jié)

實(shí)驗(yàn)分2組:空病毒組和過表達(dá)組。兩組細(xì)胞分別加入礦化誘導(dǎo)液進(jìn)行礦化誘導(dǎo)培養(yǎng)。礦化誘導(dǎo)液為含10%胎牛血清的α-MEM培養(yǎng)基,其中加入包括0.01 mg/L地塞米松、10 mg/L β-甘油磷酸鈉和50 mg/L維生素C。細(xì)胞培養(yǎng)14 d,棄去培養(yǎng)基,PBS洗2次,加入4%多聚甲醛常溫固定10 min,PBS洗2次,加入0.1%茜素紅溶液(pH值4.2),避光染色30 min,蒸餾水沖洗3次,倒置顯微鏡下拍照。拍照后將經(jīng)過礦化誘導(dǎo)的空病毒組和過表達(dá)組這兩組細(xì)胞每孔加入0.5 ml的10%(W/V)氯化烷基十六吡啶,室溫靜置30 min,吸取溶液100 μl于96孔板,酶標(biāo)儀562 nm波長記錄OD值。

1.7 ALP活性檢測(cè)

實(shí)驗(yàn)分為空病毒組和過表達(dá)組。按1.6誘導(dǎo)配方加入礦化誘導(dǎo)液。兩組細(xì)胞礦化誘導(dǎo)至7 d,棄去培養(yǎng)基,PBS洗2次,加入50 μl 0.2%的Triton X-100,4 ℃過夜,在鏡下確認(rèn)細(xì)胞完全裂解后,按照試劑盒要求,分別加入緩沖液、基質(zhì)液,混勻,37 ℃水浴孵育15 min,加入顯色劑,酶標(biāo)儀520 nm波長記錄OD值。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用GraphPad prism 7.0軟件進(jìn)行獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)及單因素方差分析,單因素方差分析后進(jìn)一步兩兩比較采用Tukey檢驗(yàn)。P<0.05為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 過表達(dá)Nrf2慢病毒轉(zhuǎn)染人牙髓干細(xì)胞的熒光顯微鏡觀察結(jié)果

不同濃度嘌呤霉素和不同MOI感染人牙髓干細(xì)胞的實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn),2 mg/L嘌呤霉素以感染復(fù)數(shù)MOI=100轉(zhuǎn)染人牙髓干細(xì)胞作用時(shí)間24 h,感染效率接近90%(見圖2)。Q-PCR結(jié)果顯示:相對(duì)于空病毒組,過表達(dá)組人牙髓干細(xì)胞中Nrf2表達(dá)水平增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖3)。

空病毒組 過表達(dá)組

與空病毒組比較,*P<0.05

2.2 過表達(dá)Nrf2對(duì)人牙髓干細(xì)胞增殖和遷移能力的影響

MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:細(xì)胞分別培養(yǎng)至48,72,96 h時(shí),與空病毒組和空白組相比,過表達(dá)組人牙髓干細(xì)胞的OD值減小(P<0.05,見圖4)。與空病毒組相比,過表達(dá)組人牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞遷移數(shù)量減少(P<0.05,見圖5)。

與空病毒組比較,*P<0.05;與空白組比較,#P<0.05

與空病毒組比較,*P<0.05

2.3 過表達(dá)Nrf2對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨礦化誘導(dǎo)的影響

茜素紅染色結(jié)果顯示:經(jīng)過14 d的成骨誘導(dǎo),過表達(dá)組人牙髓干細(xì)胞形成的礦化結(jié)節(jié)數(shù)低于空病毒組(見圖6)。半定量分析表明:過表達(dá)組茜素紅染色OD值低于空病毒組OD值,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖7)。

圖6 Nrf2過表達(dá)對(duì)人牙髓干細(xì)胞成骨誘導(dǎo)形成的礦化結(jié)節(jié)的影響 (茜素紅染色,×40)

與空病毒組比較,*P<0.05

2.4 過表達(dá)Nrf2對(duì)人牙髓干細(xì)胞ALP活性的影響

ALP活性檢測(cè)結(jié)果顯示,與空病毒組相比,過表達(dá)組人牙髓干細(xì)胞ALP活性降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05,見圖8)。

與空病毒組比較,*P<0.05

3 討論

Keap1-Nrf2系統(tǒng)通過調(diào)節(jié)細(xì)胞氧化還原穩(wěn)態(tài)在機(jī)體的防御機(jī)制中起關(guān)鍵作用。Nrf2是一種可誘導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄因子,可激活編碼抗氧化蛋白和Ⅱ期酶的基因,以響應(yīng)氧化應(yīng)激。Nrf2的活性受Kelch樣環(huán)氧氯丙烷相關(guān)蛋白1(Kelch-1ike ECH-associated protein l,Keap1)調(diào)控,Keap1在正常條件下促進(jìn)Nrf2的泛素化和隨后的降解,并在應(yīng)激或者損傷時(shí)釋放抑制的Nrf2活性[5]。盡管Keap1-Nrf2系統(tǒng)在保護(hù)細(xì)胞免受外源性和內(nèi)源性損傷方面具有重要的作用,但一系列證據(jù)表明Keap1-Nrf2系統(tǒng)具有各種新功能,特別是在細(xì)胞增殖和分化方面[6]。由于不同細(xì)胞類型的增殖和分化通常受到細(xì)胞氧化還原平衡的影響和調(diào)節(jié),因此Nrf2被認(rèn)為通過調(diào)節(jié)活性氧的細(xì)胞水平來控制這些細(xì)胞過程。

干細(xì)胞的產(chǎn)生和命運(yùn)通常受到細(xì)胞氧化還原和代謝穩(wěn)態(tài)的調(diào)節(jié)。在應(yīng)激或損傷激活后,增殖的成體組織干細(xì)胞通過生長因子激酶信號(hào)的影響增加其氧利用,改變細(xì)胞代謝物水平和氧化還原狀態(tài),降低其抗氧化酶的表達(dá),并激活活性氧信號(hào)[7-9]。Nrf2是許多抗氧化酶的共同上游調(diào)控因子[10]。Nrf2的過表達(dá)提高了不良環(huán)境中間充質(zhì)干細(xì)胞的存活率和對(duì)氧化應(yīng)激的抗性[11,12]。Nrf2的缺失導(dǎo)致缺氧對(duì)間充質(zhì)干細(xì)胞增殖和成骨促進(jìn)能力的下降,而Nrf2過表達(dá)能夠抑制間充質(zhì)干細(xì)胞凋亡[11]。這些結(jié)果說明Nrf2在體內(nèi)不良微環(huán)境中調(diào)節(jié)間充質(zhì)干細(xì)胞治療效率方面發(fā)揮作用[13]。

牙髓干細(xì)胞容易從接受正畸治療的健康供體的牙齒中分離獲取,其具有分化為神經(jīng)細(xì)胞、成牙細(xì)胞和成骨細(xì)胞的能力,后兩種細(xì)胞類型能夠在體外形成礦化結(jié)節(jié)。與非牙源性間充質(zhì)干細(xì)胞相比,牙髓干細(xì)胞具有更高的增殖率、更低的細(xì)胞衰老和更強(qiáng)的成骨能力。牙髓干細(xì)胞在抵抗脂多糖誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡和衰老方面優(yōu)于骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞,并且在體內(nèi)小型豬牙周炎模型中注射牙髓干細(xì)胞后牙周再生得到改善[16,17]。牙髓干細(xì)胞對(duì)傳代培養(yǎng)和炎癥誘導(dǎo)的衰老具有優(yōu)越的抗性,為牙周炎性微環(huán)境下再生提供了優(yōu)良的種子細(xì)胞來源。因此,本研究選用了牙髓干細(xì)胞,探討過表達(dá)Nrf2對(duì)牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞功能的影響,不同于以往的研究,牙髓干細(xì)胞沒有給與藥物處理或者環(huán)境刺激,因此細(xì)胞處于非應(yīng)激狀態(tài)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)2 mg/L嘌呤霉素以感染復(fù)數(shù)MOI=100轉(zhuǎn)染人牙髓干細(xì)胞作用24 h,感染效率接近90%,并且轉(zhuǎn)染過表達(dá)Nrf2載體可以促進(jìn)人牙髓干細(xì)胞中Nrf2表達(dá)水平,說明過表達(dá)Nrf2人牙髓干細(xì)胞構(gòu)建成功。對(duì)Nrf2全基因組分布的分析已經(jīng)確定了新的Nrf2靶基因集,其產(chǎn)物參與細(xì)胞增殖和分化,但不一定參與氧化應(yīng)激的調(diào)節(jié)[14]。因此,Nrf2對(duì)未受到應(yīng)激或損傷的成體干細(xì)胞亦可能具有調(diào)節(jié)作用。但是這方面的研究報(bào)道不多。本研究實(shí)驗(yàn)結(jié)果首次觀察到過表達(dá)Nrf2能影響非應(yīng)激狀態(tài)下的牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞功能,豐富了Nrf2對(duì)于非應(yīng)激條件成體干細(xì)胞功能影響的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。推測(cè)Nrf2對(duì)于非應(yīng)激條件牙髓干細(xì)胞功能的調(diào)節(jié)作用,可能與不參與氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)的新的Nrf2靶基因有關(guān)。

Nrf2在成骨細(xì)胞分化中的作用仍存在爭議,在小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成脂分化過中,核Nrf2蛋白水平持續(xù)下降,而延長細(xì)胞傳代過程中Nrf2活化程度降低,從而影響人骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞成骨分化[15]。也有研究指出Nrf2負(fù)調(diào)控大鼠脂肪間充質(zhì)干細(xì)胞成骨細(xì)胞分化[16]。這說明由于實(shí)驗(yàn)的異質(zhì)性(不同的物種、組織和/或方案),Nrf2在間充質(zhì)干細(xì)胞中的機(jī)制功能存在差異,因此,為明確Nrf2在生理或應(yīng)激條件下對(duì)人類間充質(zhì)干細(xì)胞的影響,需要使用人類間充質(zhì)干細(xì)胞進(jìn)行研究和驗(yàn)證。因此,本研究探討了Nrf2在牙髓干細(xì)胞增殖、遷移和成骨分化的作用,通過建立慢病毒過表達(dá)Nrf2的人牙髓干細(xì)胞后進(jìn)行細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移和成骨能力檢測(cè)。研究結(jié)果提示,穩(wěn)定過表達(dá)Nrf2人牙髓干細(xì)胞增殖和遷移能力降低,成骨誘導(dǎo)的礦化結(jié)節(jié)數(shù)量減少,ALP活性降低,提示過表達(dá)Nrf2能降低人牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移能力,同時(shí)抑制牙髓干細(xì)胞成骨分化。

在生理?xiàng)l件下,Nrf2維持細(xì)胞的氧化還原穩(wěn)態(tài),并發(fā)揮抗炎功能和進(jìn)一步的抗癌活性,從而支持細(xì)胞存活。因此,Nrf2的激活在腫瘤化學(xué)預(yù)防中很重要。但是,Nrf2的過度活化也會(huì)賦予腫瘤細(xì)胞多種優(yōu)勢(shì),一些研究表明在各種腫瘤中Nrf2信號(hào)通路組成性激活會(huì)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的生長和增殖,阻止細(xì)胞凋亡,增強(qiáng)腫瘤干細(xì)胞的自我更新能力,甚至可增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞的化學(xué)耐藥性[17]。本研究結(jié)果提示過表達(dá)Nrf2能抑制人牙髓干細(xì)胞增殖、遷移能力和成骨分化能力,說明Nrf2的組成性激活對(duì)正常牙髓干細(xì)胞的作用是不同于腫瘤干細(xì)胞的。通常來說,細(xì)胞傾向于保持氧化還原動(dòng)態(tài)平衡,因此也會(huì)高表達(dá)還原型谷胱甘肽。但是腫瘤細(xì)胞總體呈現(xiàn)氧化應(yīng)激態(tài),也就是ROS的產(chǎn)生與抗氧化防御之間的失衡,傾向于氧化,故在腫瘤細(xì)胞內(nèi),ROS的濃度通常是正常細(xì)胞的100倍。此外,Nrf2活化參與了牙周膜干細(xì)胞循環(huán)機(jī)械拉伸下的成骨分化,Nrf2激活劑T-BHQ可促進(jìn)牙周膜干細(xì)胞體外和體內(nèi)成骨分化,這可能與循環(huán)機(jī)械拉伸提高了成骨細(xì)胞分化過程中ROS水平和Nrf2的活化有關(guān)[2]?？偨Y(jié)以上研究,Nrf2激活促進(jìn)干細(xì)胞增殖和成骨分化能力與高水平的ROS直接相關(guān)。在穩(wěn)態(tài)條件的生理水平,ROS濃度基本穩(wěn)定,本研究觀察正常牙髓干細(xì)胞Nrf2的組成性激活對(duì)細(xì)胞功能(包括細(xì)胞增殖、遷移和成骨分化能力)的影響,因此,與腫瘤干細(xì)胞或者受到刺激的正常干細(xì)胞研究結(jié)果相反,過表達(dá)Nrf2可降低人牙髓干細(xì)胞的細(xì)胞增殖和遷移能力,同時(shí)抑制牙髓干細(xì)胞成骨分化。靶向Nrf2的預(yù)處理可能是提高人牙髓干細(xì)胞生存和功能的可行策略。但該思路仍需進(jìn)行深入探究,這也將是下一步研究的方向。