張娜，劉興剛，牛亞麗，王亞楠，姜東，李娥，余海濤

（豪威生物科技有限公司，天津 武清 301700）

1992 年，H9N2 禽流感病毒（AIV）在廣東地區(qū)首次發(fā)生，隨后向其他地區(qū)蔓延[1]，1998 年，擴(kuò)散到部分省份[2]，已成為雞群中流行的禽流感病毒的主要亞型[3]。禽流感的防治目前主要采用的是滅活疫苗進(jìn)行免疫接種，滅活疫苗效力檢驗(yàn)一般采用抗體檢測(cè)的方法。禽流感抗體檢測(cè)通常采用血凝抑制方法（HI）、瓊脂擴(kuò)散檢驗(yàn)法（AGP）和ELISA 方法，其中HI 以其簡(jiǎn)便、快捷、經(jīng)濟(jì)的優(yōu)點(diǎn)成為最常用的檢測(cè)方法。

為保證檢測(cè)環(huán)境不被污染，HI 檢測(cè)所需要的禽流感抗原需要經(jīng)過(guò)滅活處理。甲醛作為最常用的一種滅活劑，廣泛用于滅活疫苗的生產(chǎn)中[4]。甲醛滅活作用于病毒核酸的同時(shí)也作用于殼蛋白，可能破壞病原體蛋白的抗原性。據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，β-丙內(nèi)酯具有對(duì)H9N2 滅活能力強(qiáng)、對(duì)HA 效價(jià)影響小且在機(jī)體內(nèi)極易水解成無(wú)殘留、無(wú)害產(chǎn)物等優(yōu)點(diǎn)[5]。因此，本文通過(guò)將H9N2 病毒接種SPF雞胚，收獲尿囊液，分別用甲醛和β-丙內(nèi)酯進(jìn)行滅活、凍干，并在不同溫度條件下進(jìn)行保存，定期進(jìn)行病毒HA 效價(jià)檢驗(yàn)。結(jié)果表明，與甲醛滅活效果比較，采用β-丙內(nèi)酯滅活的方法對(duì)病毒HA 效價(jià)影響更小，穩(wěn)定性也更好。

1 材料

1.1 毒種

禽流感病毒（WD 株）毒種（效價(jià)107.63EID50/0.1 mL），由豪威生物科技有限公司提供。

1.2 SPF 雞胚

購(gòu)自北京勃林格殷格翰維通生物技術(shù)有限公司。

1.3 檢驗(yàn)用試劑和試劑盒

禽流感病毒（AIV）H9 亞型HI 試驗(yàn)用陽(yáng)性血清購(gòu)自哈爾濱維科生物技術(shù)開(kāi)發(fā)公司，陰性血清購(gòu)自哈爾濱國(guó)生生物科技股份有限公司；雞減蛋綜合征陽(yáng)性血清及雞新城疫紅細(xì)胞凝集抑制試驗(yàn)（HI）用陽(yáng)性血清購(gòu)自中國(guó)獸醫(yī)藥品監(jiān)察所。

1.4 無(wú)菌檢驗(yàn)用培養(yǎng)基

購(gòu)自北京中海生物科技有限公司 。

1.5 主要儀器

生物安全柜（型號(hào)BSC-1100-L ⅡB2）購(gòu)自北京東聯(lián)哈爾儀器制造有限公司；移液器購(gòu)自Sartorius、eppendorf、RAININ；孵化器（FQ-1）購(gòu)自黃石市恒豐醫(yī)療器械有限公司；管式離心機(jī)（型號(hào)GQLY-125N）購(gòu)自遼寧富一機(jī)械有限公司；醫(yī)用離心機(jī)[TD3(800B)] 購(gòu)自湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司，膜包（100 k）購(gòu)自密理博公司；真空冷凍干燥機(jī)（GZLY-0.2）購(gòu)自?shī)W特佳美科技（北京）有限公司； 高壓蒸汽滅菌器 （型號(hào)為MOST-L 型） 購(gòu)自山東新華醫(yī)療器械股份有限公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱（DHP-9272B） 購(gòu)自上海一恒科學(xué)儀器有限公司；

2 試驗(yàn)方法

2.1 抗原制備

禽流感毒種稀釋5 000 倍，接種10 日齡SPF雞胚300 枚，培養(yǎng)至72 h，棄掉48 h 前非特異性死亡雞胚，至4 ℃放置12~24 h，無(wú)菌收獲尿囊液（每胚預(yù)計(jì)收獲10 mL），混勻后測(cè)定血凝價(jià)，HA 應(yīng)≥1:29。

2.2 抗原澄清濃縮

先將收獲的禽流感病毒液分別經(jīng)管式離心機(jī)按照 10 000 r/min 轉(zhuǎn)速，離心澄清。再利用蠕動(dòng)泵提供動(dòng)力，采用100 k 膜堆對(duì)澄清后的禽流感病毒液進(jìn)行濃縮。病毒液在經(jīng)過(guò)膜包時(shí)小分子物質(zhì)經(jīng)膜包的內(nèi)壁滲透出來(lái)成為濾出液，而病毒液中的病毒蛋白等大分子物質(zhì)則得以保留并返回至濃縮罐中。依此往復(fù)循環(huán)將禽流感病毒液濃縮至原體積的 1/4 終止，收集濃縮后病毒液并測(cè)定血凝價(jià)。

2.3 滅活

2.3.1 甲醛滅活 取濃縮后的一半抗原，按原量的1%加入4 倍稀釋后的甲醛，37 ℃滅活24 h，中間搖3~4 次，收至2~8 ℃保存，按現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)獸藥典》做無(wú)菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)，并測(cè)定血凝價(jià)[6]。

2.3.2 β 丙內(nèi)酯滅活 取剩余的一半抗原，按抗原量的1/4000 加入β-丙內(nèi)酯，2~8 ℃滅活24 h，中間搖3~4 次。

2.4 抗原檢驗(yàn)

滅活后的抗原做無(wú)菌及滅活檢驗(yàn)，測(cè)定血凝價(jià)，HA 應(yīng)≥1:29。

2.5 保護(hù)劑配制及凍干

凍干保護(hù)劑配制：按照最后的配苗總量測(cè)算，凍干總量中含明膠0.8%、蛋白胨1%、蔗糖3% ，高壓條件116 ℃ 40 min，將配好的保護(hù)劑與滅活抗原按2:3 比例混勻分裝至西林瓶中，每瓶2 mL，凍干，冷凍保存，備用。

2.6 檢驗(yàn)

2.6.1 真空度測(cè)定 按現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)[6]，應(yīng)出現(xiàn)輝光。

2.6.2 物理性狀 眼觀凍干抗原物理性狀是否為白色海綿狀疏松團(tuán)塊，是否易與瓶壁脫離，加稀釋液后是否迅速溶解。

2.6.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行版《中華人民共和國(guó)獸藥典》檢驗(yàn)[6]，應(yīng)無(wú)菌生長(zhǎng)。

2.6.4 特異性檢驗(yàn) 將制備的抗原分別對(duì)雞新城疫陽(yáng)性血清、禽流感（H9 亞型）陽(yáng)性血清、雞減蛋綜合征陽(yáng)性血清進(jìn)行HI 試驗(yàn)[6]，鑒定其對(duì)本病毒產(chǎn)生的抗體反應(yīng)的特異性。

2.6.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn)[7]將凍干好的抗原，分別在4、-20℃條件下保存，并于1 d 和1 、3、6 、9 、12 、15、18 、21 、24 個(gè)月各拿出1 支，進(jìn)行HA測(cè)定，每個(gè)時(shí)間段均要進(jìn)行2 次重復(fù)測(cè)定，評(píng)價(jià)不同保存溫度及時(shí)間對(duì)不同滅活劑滅活的禽流感抗原血凝效價(jià)的影響。

3 結(jié)果

3.1 抗原制備結(jié)果

禽流感（WD 株）毒種接種SPF 雞胚300 枚，培養(yǎng)后收獲雞胚液約3 300 mL，測(cè)定血凝價(jià)，離心濃縮至約800 mL，再測(cè)定血凝價(jià)，400 mL 經(jīng)甲醛滅活，400 mL 經(jīng)β-丙內(nèi)酯滅活，測(cè)定血凝價(jià)，無(wú)菌檢驗(yàn)及滅活檢驗(yàn)結(jié)果均合格，如表1 所示。甲醛滅活后，HA 可達(dá)10log2；β-丙內(nèi)酯滅活，HA 可達(dá)11log2。

表1 禽流感（WD）株抗原制備檢驗(yàn)結(jié)果

3.2 分裝凍干

將配制好的保護(hù)劑分別與兩種滅活抗原按2:3比例混勻，分裝至西林瓶中，每瓶2 mL，凍干。

3.3 抗原檢驗(yàn)

3.3.1 真空度測(cè)定 兩種抗原各取40 瓶進(jìn)行真空度測(cè)定，全部出現(xiàn)紫色輝光，表明結(jié)果合乎規(guī)定。

3.3.2 物理性狀 眼觀凍干抗原，物理性狀為白色海綿狀疏松團(tuán)塊，易與瓶壁脫離，加稀釋液后迅速溶解，結(jié)果顯示符合規(guī)定。

3.3.3 無(wú)菌檢驗(yàn) 按現(xiàn)行獸藥典進(jìn)行抽樣檢驗(yàn)，各組檢驗(yàn)10 瓶，結(jié)果顯示均無(wú)菌生長(zhǎng)。

3.3.4 特異性檢驗(yàn) 將制備的抗原分別對(duì)雞新城疫陽(yáng)性血清、禽流感（H9 亞型）陽(yáng)性血清、雞減蛋綜合征陽(yáng)性血清進(jìn)行HI 試驗(yàn)，結(jié)果表明各毒株對(duì)本病毒產(chǎn)生的抗體反應(yīng)均有特異性，禽流感（H9亞型）陽(yáng)性血清效價(jià)為1:29，ND、EDS 均為陰性。

3.3.5 穩(wěn)定性檢驗(yàn) 不同保存溫度對(duì)不同滅活劑抗原血凝效價(jià)的影響（表2），每次用新開(kāi)封抗原，減少反復(fù)凍融對(duì)其影響。

表2 溫度和時(shí)間對(duì)甲醛和β- 丙內(nèi)酯滅活抗原血凝效價(jià)的影響

通過(guò)表2 可知，甲醛滅活凍干后的抗原-20℃保存至3 個(gè)月HA 開(kāi)始下降，2~8℃保存至6 個(gè)月HA開(kāi)始下降；β-丙內(nèi)酯滅活凍干后的抗原2~8 ℃及-20℃放置18 個(gè)月效價(jià)均無(wú)變化，到21 個(gè)月效價(jià)略有下降，說(shuō)明β-丙內(nèi)酯滅活的H9 亞型禽流感抗原保存時(shí)間長(zhǎng)，穩(wěn)定性好。

4 討論

HI 試驗(yàn)可以用于以下幾方面： 第一，檢測(cè)血清中的抗體水平； 第二，鑒定病毒的類型及亞型；第三，輔助診斷病毒性疾?。?第四，作為適時(shí)實(shí)施免疫的依據(jù)，從而避免免疫空檔期及重復(fù)免疫造成的損失?？乖|(zhì)量的差異對(duì)禽流感 HI 試驗(yàn)結(jié)果準(zhǔn)確性起到了決定性作用。

目前國(guó)內(nèi)許多禽病滅活疫苗都用甲醛作滅活劑。對(duì)滅活疫苗的生產(chǎn)起到一定的作用，血凝抑制用抗原制備往往也用甲醛進(jìn)行滅活。甲醛既可作用于病毒核苷酸堿基（如A、G、U），又可作用病毒殼蛋白。作用于病毒殼蛋白時(shí)，易使蛋白質(zhì)發(fā)生交聯(lián)或病毒顆粒聚集，故不能再作用于殼蛋白內(nèi)的核酸。這樣，病原體蛋白的抗原性會(huì)遭到嚴(yán)重破壞，并可能有病原體存活的概率；用甲醛滅活時(shí)間長(zhǎng)，一般需要在37~39 ℃處理24 h 以上或更長(zhǎng)時(shí)間。在本抗原的研制過(guò)程中，前期使用甲醛進(jìn)行滅活，驗(yàn)證顯示，甲醛滅活后抗原效價(jià)受影響大，且不穩(wěn)定，保存期短，給生產(chǎn)中帶來(lái)一定困擾。β-丙內(nèi)酯是一種有機(jī)化合物，用作殺菌消毒劑具有對(duì)H9N2 滅活能力強(qiáng)、HA 效價(jià)影響小的特點(diǎn)[5]。β-丙內(nèi)酯易水解，無(wú)殘留，水解后無(wú)危害；可直接作用于病毒或病原核酸，改變病毒核酸結(jié)構(gòu)達(dá)到滅活目的，不直接作用于蛋白，且滅活效果理想，滅活時(shí)間短，能縮短疫苗生產(chǎn)周期。因此，自1984 年β-丙內(nèi)酯作為狂犬疫苗滅活劑使用以來(lái)，已成功并廣泛地應(yīng)用于多種人和動(dòng)物疫苗的生產(chǎn)。

本試驗(yàn)共制備出了符合要求的H9 抗原190瓶；通過(guò)對(duì)比甲醛滅活和β-丙內(nèi)酯滅活禽流感抗原的效價(jià)，結(jié)果顯示甲醛滅活的抗原凍干后效價(jià)下降，2~8 ℃可以保存6 個(gè)月，-20 ℃僅可保存3 個(gè)月；β-丙內(nèi)酯滅活的抗原凍干后HA 保持不變，在2~8 ℃及-20 ℃均可以保存18 個(gè)月，效價(jià)無(wú)變化，具有保存時(shí)間長(zhǎng)、穩(wěn)定性好的優(yōu)點(diǎn)可用于實(shí)驗(yàn)血清抗體檢測(cè)。本研究建立了血凝抑制抗原制備方法，為相關(guān)抗體檢測(cè)和不同毒株的交叉保護(hù)試驗(yàn)奠定了基礎(chǔ)。