張麗燕，劉萬軍，朱紹輝，王洪玲，肖發(fā)沂**

[1.青島菲優(yōu)特檢測(cè)有限公司，山東 青島 266100；2.巴迪泰（青島）生物科技有限公司，山東 青島 266100；3.山東畜牧獸醫(yī)職業(yè)學(xué)院，山東 濰坊 261061；4.孟村縣畜牧局，河北 滄州 061000]

我國(guó)是鴨肉生產(chǎn)和消費(fèi)的大國(guó)，肉鴨的年出欄量占全球總出欄量80%以上[1]。北京鴨作為肉鴨品種的杰出代表，是我國(guó)優(yōu)良的快大型肉鴨品種，肉質(zhì)鮮嫩，皮脂豐厚，是北京烤鴨的主要原料[2]，市場(chǎng)占有率很高。目前，鴨肉揮發(fā)性風(fēng)味的研究報(bào)道主要集中在板鴨[3]、鹽水鴨[4]、醬鴨[5]等加工后熟食制品，對(duì)生鮮鴨肉中揮發(fā)性物質(zhì)的研究較少。揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)是影響生鮮鴨肉風(fēng)味的重要因素之一，由于香氣物質(zhì)具有痕量、易揮發(fā)且組成復(fù)雜的特點(diǎn)，通常采用固相微萃—?dú)庀嗌V—質(zhì)譜聯(lián)用法進(jìn)行分析[6-8]。

固相微萃取 ( Solid phase micro-extraction，SPME) 是20 世紀(jì)90 年代興起的一種樣品前處理與富集技術(shù)，是一種集萃取、濃縮、進(jìn)樣于一體的分析方法[9]，該方法具有操作簡(jiǎn)便快捷、樣品用量少、無溶劑殘留、對(duì)待測(cè)物選擇性高、靈敏度高、變異系數(shù)小等優(yōu)點(diǎn)[10]。SPME 通過使用一根細(xì)的熔融石英纖維絲或在細(xì)的熔融石英纖維絲上涂上一層具有選擇性的聚合物薄膜，從分析基質(zhì)中萃取待測(cè)物，待萃取結(jié)束以后，直接將萃取頭插入進(jìn)樣口進(jìn)行檢測(cè)，可明顯提高檢測(cè)效率。

固相微萃取法有三種基本的萃取模式，即直接萃取、頂空萃取、膜保護(hù)萃取。頂空萃取的原理：被測(cè)組分受熱從固相或液相擴(kuò)散至氣相，之后被萃取頭的石英纖維固定相萃取、富集。頂空固相微萃取模式（HS-SPME）可以有效避免固定相被樣品基質(zhì)中的高分子物質(zhì)和不揮發(fā)性物質(zhì)污染[11]，減輕雜質(zhì)干擾，提高萃取效率，適合所有基質(zhì)的試樣中揮發(fā)性及半揮發(fā)性物質(zhì)的測(cè)定[12]。

影響HS-SPME 結(jié)果的因素有很多，如萃取頭類型、萃取溫度、萃取時(shí)間、樣品取樣量等均會(huì)對(duì)結(jié)果產(chǎn)生不同程度的影響。本研究采用頂空固相微萃取技術(shù)結(jié)合氣相質(zhì)譜分析法，以北京鴨胸肉為研究材料，以萃取頭類型、樣品取樣量、萃取溫度和萃取時(shí)間為試驗(yàn)變量，對(duì)HS-SPME 模式進(jìn)行優(yōu)化，并用優(yōu)化后的方法探究北京鴨胸肉的揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)組成。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

北京鴨購于某農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)，現(xiàn)殺處理后，取鴨胸肉為試驗(yàn)材料，-20 ℃冷凍保存。

1.2 儀器設(shè)備

手動(dòng)固相微萃?。⊿PME）進(jìn)樣器和萃取纖維頭：美國(guó)Supelco 公司；TQ8040 三重四極桿氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀：日本島津公司；DB-5MS 彈性石英毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm)：美國(guó)安捷倫公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 單因素試驗(yàn) 以單因素變量為原則，分別測(cè)試不同類型萃取頭（75 μm CAR/PDMS、85 μm Polyacrylate、100 μm PDMS）、不同取樣量（2、4、6 g）、不同萃取溫度（40、50、60、70℃)、不同萃取時(shí)間（3、35、40、45 min）下的質(zhì)譜檢測(cè)結(jié)果，通過比較峰面積和物質(zhì)峰數(shù)量，選擇最合適的HS-SPME 條件。

1.3.2 樣品處理 將樣品室溫解凍，勻質(zhì)后準(zhǔn)確稱取適量樣品于潔凈的20 mL 頂空萃取瓶中，封蓋，置于恒溫水浴鍋中。將老化處理后的固相微萃取進(jìn)樣器萃取頭插入瓶中，推出纖維頭并保證纖維頭不直接接觸樣品及瓶壁，用頂空吸附萃取的方式對(duì)揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行吸附。吸附結(jié)束后縮回纖維頭，迅速將萃取頭插入氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)樣口端，再次推出纖維頭，250℃解析8 min 并啟動(dòng)氣相色譜質(zhì)譜聯(lián)用儀進(jìn)行色譜分離和質(zhì)譜數(shù)據(jù)采集。

1.3.3 色譜、質(zhì)譜條件 色譜柱：DB-5MS 毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm）；柱溫箱溫度35 ℃；汽化室250 ℃；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度35 ℃，保持2 min，以4 ℃/min升溫至180℃，保持2 min，以10 ℃/min 升溫至250 ℃，保持5 min。載氣：高純氦氣（He），純度99.999%；載氣流量1 mL/min；流量控制方式：恒線速度模式；進(jìn)樣方式：不分流進(jìn)樣。

離子源：EI 源；電子能量70 ev；離子源溫度200℃；接口溫度250 ℃；檢測(cè)器電壓：1.00 KV；質(zhì)量分析器：?jiǎn)嗡臉O桿；采集方式：scan；質(zhì)量掃描范圍：35~500 amu。

2 數(shù)據(jù)分析方法

將GC-MS 采集到的物質(zhì)峰逐一進(jìn)行人工解析，將物質(zhì)峰質(zhì)譜圖與NIST17 標(biāo)準(zhǔn)譜庫中的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)譜圖進(jìn)行相似度比對(duì)以定性，并用面積歸一化法計(jì)算出樣品中各組分的相對(duì)含量以定量。

單因素試驗(yàn)中，試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)用Microsoft office Excel 2016 進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和數(shù)據(jù)匯總。

3 結(jié)果分析

3.1 不同類型萃取頭的比較

固相微萃取進(jìn)樣器的核心部分是萃取頭，不同類型萃取頭內(nèi)的纖維材料及涂層特性存在巨大差異，對(duì)不同組分的萃取吸附能力不同，是影響HS-SPME 萃取效果的關(guān)鍵因素[13]。本試驗(yàn)中，我們選取三種不同類型的萃取頭，其他變量條件不變，采集的GC-MS 色譜圖見圖1，總峰面積及物質(zhì)峰數(shù)量見表1。由表1 可知，75 μm CAR/PDMS萃取頭的可定性揮發(fā)性物質(zhì)峰的總峰面積是85 μm Polyacrylate 萃取頭的1.9 倍，是100 μm PDMS 萃取頭的3.1 倍，而且 75 μm CAR/PDMS 萃取頭物質(zhì)峰數(shù)量最多。由此可見，與其他兩種萃取頭相比，75μm CAR/PDMS 萃取頭更適用于北京鴨胸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析。

表1 不同萃取頭的萃取結(jié)果比較

圖1 3種萃取頭的GC-MS總離子流圖（詳見附錄彩圖）

3.2 不同取樣量的比較

頂空樣品瓶上方氣相體積的大小對(duì)萃取效果有重大影響。研究表明，當(dāng)氣相體積小于樣品瓶總體積的1/3 時(shí)，隨著氣相體積的減小，試驗(yàn)結(jié)果的精密度降低，重復(fù)性變差[14]，而氣相體積過大也會(huì)使萃取效率降低。本試驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)置了3 種不同的取樣量，其他變量條件不變，采集的GC-MS 色譜圖見圖2，總峰面積及物質(zhì)峰數(shù)量見表2。由表2 可知，3 種取樣量的物質(zhì)峰數(shù)量均為30 個(gè)左右，4 g 時(shí)略有優(yōu)勢(shì)。而從總峰面積來看，取樣量為4 g 時(shí)的總峰面積明顯高于其他兩者，說明2 g 時(shí)香味成分濃度不夠，而6 g 時(shí)樣品過于緊實(shí)，不利于香味物質(zhì)擴(kuò)散入氣相。因此，4 g 為20 mL 頂空萃取瓶的最適取樣量。

表2 不同萃取頭的萃取結(jié)果比較

3.3 不同萃取溫度的比較

萃取溫度對(duì)萃取效果的影響是雙方面的，較低的萃取溫度不利于揮發(fā)性物質(zhì)擴(kuò)散至氣相，而過高的溫度又會(huì)降低萃取纖維頭的吸附能力，使萃取效果變差。本試驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)置了4 種不同的萃取溫度，其他變量條件不變，采集的GC-MS色譜圖見圖3，總峰面積及物質(zhì)峰數(shù)量見表3。由表3 可知，萃取溫度為 40 ℃時(shí)，總峰面積最小，物質(zhì)峰數(shù)量也較少，推測(cè)原因可能是低溫不利于揮發(fā)性成分揮出。隨著溫度的升高，總峰面積明顯增加，物質(zhì)峰數(shù)量也逐漸增多，60 ℃時(shí)的總峰面積達(dá)到最大，物質(zhì)峰數(shù)量最多。當(dāng)萃取溫度升至70 ℃時(shí)，總峰面積和物質(zhì)峰數(shù)量均陡然下降，說明此溫度下萃取頭的吸附能力已下降。由此可見，60 ℃為最佳萃取溫度。

表3 不同萃取溫度的萃取結(jié)果比較

圖3 4種萃取溫度的GC-MS總離子流圖（詳見附錄彩圖）

3.4 不同萃取時(shí)間的比較

隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，萃取纖維頭的吸附量呈上升趨勢(shì)，直至達(dá)到萃取平衡狀態(tài)，此時(shí)繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，反而會(huì)引起個(gè)別不穩(wěn)定物質(zhì)變性出逃。本試驗(yàn)中，我們?cè)O(shè)置了4 種不同的萃取時(shí)間，其他變量條件不變，采集的GC-MS 色譜圖見圖4，總峰面積及物質(zhì)峰數(shù)量見表4。由表4 可知，萃取時(shí)間為 30 min 時(shí)，總峰面積和物質(zhì)峰數(shù)量最少，隨著萃取時(shí)間的延長(zhǎng)，總峰面積和物質(zhì)峰數(shù)量逐漸增加，40 min 時(shí)達(dá)到最大量，之后繼續(xù)延長(zhǎng)萃取時(shí)間，總峰面積和物質(zhì)峰數(shù)量反而略有下降。由此可見，40 min 為最佳萃取時(shí)間。由上述單因素試驗(yàn)結(jié)果可知，使用75μm CAR/PDMS 萃取頭，稱取4 g 樣品，60℃萃取40 min，是北京鴨胸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)分析的最佳HSSPME 條件。

表4 4 種萃取時(shí)間的GC-MS 總離子流圖（詳見附錄彩圖）

3.5 HS-SPME-GC-MS 分析北京鴨胸肉的揮發(fā)性物質(zhì)成分

采用優(yōu)化后的HS-SPME 條件，經(jīng)DB-5MS色譜柱分離，GC-MS 共采集到37 種可定性的揮發(fā)性物質(zhì)組分，經(jīng)NIST17 標(biāo)準(zhǔn)譜庫檢索和相似度比對(duì)，結(jié)合人工譜圖解析，鑒定出的化合物及含量信息見表5、表6。

表5 北京鴨胸肉的揮發(fā)性物質(zhì)組分信息

表6 北京鴨胸肉的揮發(fā)性物質(zhì)組分信息

胡強(qiáng)等從水煮甜皮鴨的鴨胸肉中鑒定出31 種揮發(fā)性成分，且以醛類為主，其次為酮類、醇類[7]。張琳等從三黃雞肉中鑒定出59 種揮發(fā)性化合物，醛類最多，其次為酮類、烴類[15]。采用優(yōu)化后的HS-SPME-GC-MG 分析法，本試驗(yàn)鑒定出的北京鴨胸肉的主要風(fēng)味物質(zhì)以醛類和醇類為主，其中1-壬醇、（Z）-癸-2-烯醛、2－十一烯醛、月桂醇、十四醛、正十五碳醛、正辛醛等含量較高，占總含量的一半以上，而烴類化合物和雜環(huán)芳烴類化合物含量較低。肉類中的醛類化合物大多數(shù)來源于脂質(zhì)氧化，是脂肪降解的主要產(chǎn)物之一。因具有脂肪香味，且閾值較低，是肉類揮發(fā)性香氣的主要來源[16]。醇類化合物一般是由脂質(zhì)氧化和蛋白質(zhì)水解產(chǎn)生的，而肉食品中的醇類化合物主要來自脂質(zhì)氧化[17]。本研究鑒定出來的醇類包括飽和醇與不飽和醇，飽和醇因風(fēng)味閾值較高，對(duì)香味的貢獻(xiàn)較少，而不飽和醇的風(fēng)味閾值一般較低，故對(duì)風(fēng)味的貢獻(xiàn)較大。烴類化合物，特別是直鏈烴類因閾值較高，一般認(rèn)為對(duì)食品香氣無明顯貢獻(xiàn)，但有些可能是形成雜環(huán)化合物的重要中間體，有助于提高整體風(fēng)味[18]。雜環(huán)化合物來源復(fù)雜，含量低，對(duì)鴨肉整體揮發(fā)性風(fēng)味只起到輔助和修飾作用。

4 結(jié)論

本研究通過對(duì)萃取頭類型、取樣量、萃取溫度、萃取時(shí)間進(jìn)行比較，優(yōu)化了頂空固相微萃取條件，確定了HS-SPME-GC-MS 法測(cè)定北京鴨胸肉揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)的最優(yōu)條件為：采用75μm CAR/PDMS萃取頭，稱取4 g 樣品，60℃恒溫萃取40 min。采用優(yōu)化后的頂空微萃取條件對(duì)北京鴨胸肉中的揮發(fā)性物質(zhì)組分進(jìn)行萃取，借助氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)進(jìn)行分離和分析，本研究共檢測(cè)出37 種揮發(fā)性風(fēng)味物質(zhì)，分別為醛類、醇類、烴類和雜環(huán)芳烴類，其中醛類化合物含量居首，其次為醇類，此兩類化合物是北京鴨胸肉香味的主要貢獻(xiàn)者。