李明莉,胡冬生,楊秀竹,王西墨,鮑會靜

(天津醫(yī)科大學(xué)南開醫(yī)院精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)實驗室,天津 300100)

卵巢癌是婦科常見的惡性腫瘤之一,主要的治療手段是手術(shù)聯(lián)合化療,一線化療藥物是紫杉醇聯(lián)合卡鉑,但目前越來越多的患者出現(xiàn)卡鉑耐藥,且化療藥物的無差別損傷,使胃腸道反應(yīng)、腎臟損害、過敏反應(yīng)等不良反應(yīng)[1 - 2]嚴(yán)重影響了患者的生存質(zhì)量,常常導(dǎo)致患者預(yù)后不良。蛇床子素是中藥蛇床子的主要活性成分,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn)其具有抗腫瘤的作用,可明顯抑制卵巢癌細(xì)胞的增殖,并可通過多種途徑逆轉(zhuǎn)腫瘤多藥耐藥[3],故可作為治療卵巢癌的藥物補充。但由于其生物利用度低、溶解度低[4]等特點,限制了其臨床應(yīng)用。外泌體是直徑100 nm左右具有脂質(zhì)雙分子層膜結(jié)構(gòu)的細(xì)胞囊泡,參與機(jī)體生理病理過程,作為細(xì)胞間通訊參與細(xì)胞間信號轉(zhuǎn)導(dǎo),可在各種體液如汗液、淚液、乳汁中分離得到[5]。外泌體不僅可以增加藥物的生物利用度和溶解度,也可以增加藥物在腫瘤部位的濃度,還因其低免疫原性和良好的生物相容性作為藥物載體備受關(guān)注[6]。因此,本研究擬探索外泌體裝載蛇床子素的載藥方法,為蛇床子素在卵巢癌治療中的應(yīng)用提供方法支撐。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1細(xì)胞株和培養(yǎng) 293T細(xì)胞來自天津中西醫(yī)結(jié)合急腹癥研究所實驗室,SKOV3細(xì)胞購自ATCC。293T細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的DMEM培養(yǎng)基,SKOV3細(xì)胞用含10% 胎牛血清、1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基,在5% CO2、37 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng),0.25%胰酶消化傳代。

1.1.2主要儀器 透射電子顯微鏡(transmission electron microscope,TEM)(日本日立,HT7700);納米顆粒跟蹤分析儀(nanoparticle tracking analysis,NTA)(英國Malvern,Nanosight300);CO2培養(yǎng)箱(日本三洋電機(jī)株式會社,MCO-15AC);臺式低溫離心機(jī)(日本Kubota公司,K21126-F000);恒溫振蕩水槽(上海精宏實驗設(shè)備有限公司,DKZ-2);高效液相色譜儀(美國安捷倫LC1100);高效液相色譜柱(北京迪馬歐泰科技發(fā)展中心,Diamonsil 5 μm C8,150 × 4.6 mm,XDB-C8);酶標(biāo)儀(上?？迫A生物工程股份有限公司,Khb ST-360);流式細(xì)胞儀(美國安捷倫NovoCyte D2060R)。

1.1.3主要試劑 蛇床子素(上海阿拉丁,O101699);外泌體提取試劑(美國InvitroGen,4478359);CD63分離/檢測試劑(美國InvitroGen,10606D);PE-anti-CD9 antibody(美國Abcam,ab82394);DMEM培養(yǎng)基(美國Gibco,C11995500BT);RPMI 1640培養(yǎng)基(美國Gibco,C11875500BT);胎牛血清(上海Vivacell,C04001050);青霉素-鏈霉素雙抗(北京Solarbio,P1400-100);0.25% Tripisin-EDTA(1 ×)(北京Solarbio,T1320-100);DMSO(北京Solarbio,D8371);RIPA裂解液(天津中實基因科技,ZS-PR21001S);乙腈(上海吉至生化,A27981);BCA(北京天根生化科技,PA115-01);Slide-A-LyzerTMDialysis Cassette(美國Thermo Fisher,66380);PBS緩沖液(北京Biosharp,BL302A)。

1.2 方法

1.2.1蛇床子素對SKOV3的增殖作用 培養(yǎng)SKOV3細(xì)胞,待其在細(xì)胞培養(yǎng)瓶中生長至80%～90%時進(jìn)行鋪板,96孔板,每孔5 000個細(xì)胞;次日取出細(xì)胞培養(yǎng)板,加入藥物,分為PBS、DMSO、蛇床子素組(80 μmol·L-1),每組重復(fù)6孔;培養(yǎng)48 h后取出細(xì)胞培養(yǎng)板,向每孔加入10 μL CCK溶液,然后放回細(xì)胞培養(yǎng)箱,繼續(xù)培養(yǎng)2 h;取出細(xì)胞培養(yǎng)板,用酶標(biāo)儀檢測在450 nm處的吸光度。

1.2.2外泌體的提取 293T細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng),待細(xì)胞密度生長至80%～90%時,換為DMEM培養(yǎng)3天[7],然后收集上層培養(yǎng)基,根據(jù)試劑盒說明書提取外泌體,即先在4 ℃下,以2 000×g轉(zhuǎn)速離心去掉細(xì)胞碎片,收集上清,加入1/2體積的提取試劑,充分混勻后,4 ℃孵育過夜,再進(jìn)行離心(10 000×g,4 ℃,1 h),棄去上清,用100 μL PBS重懸外泌體,用BCA測定其濃度。

1.2.3外泌體的鑒定 取30 μL外泌體溶液,用TEM觀察外泌體的形態(tài)。將外泌體稀釋到1 mL,用NTA測定其粒徑。

1.2.4蛇床子素外泌體制備 稱取10 mg蛇床子素溶解于255.8 μL DMSO溶液中配成濃度為160 mmol·L-1的儲存液,取30 μL(1 172.6 μg)蛇床子素與100 μL(45.9 μg)外泌體混勻,在37 ℃的水浴鍋中輕晃避光孵育2 h或4 h,孵育結(jié)束后將混懸液用注射器小心注入透析卡中,用浮漂固定,懸浮于2 L PBS溶液中,然后置于4 ℃冰箱中透析過夜,以去除游離的蛇床子素,次日取出,放入4 ℃冰箱待用。

1.2.5載藥效率測定

1.2.5.1 標(biāo)準(zhǔn)品制備 將蛇床子素(160 mmol·L-1)用PBS稀釋至0.004、0.008、0.016、0.031、0.063 g·L-1。

1.2.5.2 樣品準(zhǔn)備 將提取的蛇床子素外泌體(osthole-Exo)離心(7 000 r·min-1,4 ℃,5 min),收集上清,分組為2OST-Exo、2OST-Exo-RIPA、4OST-Exo、4OST-Exo-RIPA,其中帶有RIPA的組處理:加入等體積的RIPA裂解液,在冰上靜置30 min后離心(13 000 r·min-1,4 ℃,5 min),取上清。

1.2.5.3 色譜條件 C8色譜柱,乙腈 ∶水=70% ∶30%,30 ℃柱溫,在303 nm處檢測,進(jìn)樣量10 μL,停止時間10 min。

1.2.5.4 根據(jù)峰面積及標(biāo)準(zhǔn)曲線線性關(guān)系計算載藥量,按文獻(xiàn)計算載藥效率[4]:

注:W1表示外泌體裝載的藥物質(zhì)量,W2表示載藥時加入的藥物質(zhì)量。

1.2.6流式細(xì)胞術(shù)測定外泌體 蛇床子素外泌體與CD63磁珠孵育過夜,再與PE-CD9抗體孵育1 h,用PBS清洗后,上流式細(xì)胞儀分析。

2 結(jié)果

2.1 蛇床子素對SKOV3細(xì)胞的增殖作用現(xiàn)代治療卵巢癌的化療藥物存在較多不良反應(yīng),且多發(fā)生耐藥,而中藥在減毒增效方面具有顯著優(yōu)勢[8],擬選某中藥治療卵巢癌。查閱相關(guān)文獻(xiàn)[9],確定中藥單體蛇床子素能夠抑制SKOV3細(xì)胞的生長,為了驗證這一結(jié)果,進(jìn)行了CCK-8實驗,即用80 μmol·L-1蛇床子素處理SKOV3細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)蛇床子素能明顯的抑制SKOV3細(xì)胞的增殖,見Fig 1。

Fig 1 Proliferation of SKOV3 cells

2.2 外泌體的鑒定如Fig 2、Tab 1所示,外泌體直徑100 nm左右,呈典型的杯狀,可見膜型結(jié)構(gòu)。NTA結(jié)果分析顯示納米顆粒粒徑主要集中在104 nm,粒徑為0～200 nm的占比為81%,平均粒徑(158.4±77.9) nm,有的粒徑稍大,可能是顆粒之間的黏附黏連造成的。以上結(jié)果表明從293T細(xì)胞上清所提取的顆粒是外泌體。

Fig 2 Morphological observation of exosomes and size distribution analysis

Tab 1 Particle size distribution statistics of exosomes

2.3 載藥效率測定

Fig 3 Chromatographic peaks of osthole at different concentrations

Tab 2 Chromatographic peak areas of osthole at different concentrations

2.3.2確定載藥條件 外泌體與蛇床子素共孵育2 h或4 h,經(jīng)高效液相色譜儀測得峰面積分別為68.50和16.23,計算出載藥效率分別為0.76%和0.12%,2 h的載藥效率明顯高于4 h,故選擇共孵育2 h作為載藥條件,見Fig 4、Tab 3。

Tab 3 Drug loading efficiency at different times

2.3.3外泌體裝載蛇床子素的途徑 對蛇床子素外泌體(osthole-Exo)進(jìn)行流式分析,CD9是外泌體的表面標(biāo)志蛋白,osthole-Exo中CD9陽性表達(dá),即所提取的osthole-Exo中存在外泌體,見Fig 5A。將osthole-Exo用裂解劑RIPA裂解后,進(jìn)行HPLC分析,可以發(fā)現(xiàn)裂解后的蛇床子素量分別從8.85 μg、1.43 μg增加到21.60 μg和7.80 μg,見Fig 5B、Tab 4。

3 討論

卵巢癌是女性常見的惡性腫瘤之一,手術(shù)聯(lián)合化療是目前的主要治療手段,但化療藥物的不良反應(yīng)使患者的生存質(zhì)量降低。中藥作為傳統(tǒng)醫(yī)藥,有著減輕不良反應(yīng)、逆轉(zhuǎn)耐藥等優(yōu)勢,蛇床子素是中藥蛇床子的有效成分,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究其具有抑制卵巢癌細(xì)胞增殖的作用[10],因此蛇床子素可能成為治療卵巢癌的新策略。但蛇床子素的口服生物利用度和溶解度低[4],限制了它的應(yīng)用,外泌體裝載藥物能提高藥物的溶解度和口服生物利用度[6],所以本研究利用外泌體運輸蛇床子素,使蛇床子素能夠充分發(fā)揮抑制腫瘤的作用。

Tab 4 Osthole loading mass after exosome lysis

HEK293T(293T)細(xì)胞系是HEK293的衍生細(xì)胞株,表達(dá)SV40大T抗原,能夠表達(dá)高滴度的病毒基因載體,常用于逆轉(zhuǎn)錄病毒載體的生產(chǎn)[11]。研究報道,由293T產(chǎn)生的細(xì)胞外囊泡誘導(dǎo)的免疫反應(yīng)和毒性,給C57BL/6小鼠靜脈注射和腹腔注射細(xì)胞外囊泡3周,采集血液以評估血液學(xué)、血液化學(xué)和免疫標(biāo)志物,收集組織進(jìn)行尸檢和組織病理學(xué)檢查,沒有觀察到毒性的跡象,即293T來源的細(xì)胞外囊泡具有免疫惰性,不會在體內(nèi)引發(fā)炎癥反應(yīng)[12],所以我們選擇293T細(xì)胞來源的外泌體。

目前的載藥方式分為分泌前載藥和分泌后載藥。分泌前載藥主要由基因編輯和藥物與產(chǎn)外泌體細(xì)胞共孵育后收集藥物外泌體,分泌后載藥應(yīng)用較多是共孵育、超聲和電穿孔,其他分泌后載藥應(yīng)用較少地是擠壓、凍融循環(huán)和皂素滲透等[13]。分泌前的共孵育載藥效率不易控制,且藥物對細(xì)胞的影響未知,細(xì)胞的正常生理功能可能遭到破外,外泌體的正常分泌是否受到影響尚不明確。

超聲的載藥效率較高,可持續(xù)釋放藥物,但這種方法可能導(dǎo)致外泌體聚集,影響外泌體的免疫活性,另外還可能會破壞外泌體的質(zhì)膜結(jié)構(gòu),造成藥物漏出,導(dǎo)致載藥量不理想[14]。電穿孔是利用電場的電脈沖對外泌體進(jìn)行作用,在短的高壓脈沖下可以導(dǎo)致膜擊穿,會產(chǎn)生暫時的孔隙,藥物分子會借此孔流入到外泌體中。但外泌體的濃度影響電穿孔的效率,發(fā)現(xiàn)外泌體濃度最低在0.25 g·L-1,最高在1 g·L-1時,電穿孔的載藥效率最高,而這種方法也存在許多缺點,比如加載速率低、膜結(jié)構(gòu)完整性破壞、外泌體活性受到影響等,進(jìn)而限制了它的應(yīng)用[15]。共孵育是最直接且簡單的裝載方法,通過藥物與外泌體膜脂質(zhì)層相互作用得以裝載,效率取決于藥物的疏水性[16],因其具備保持外泌體結(jié)構(gòu)完整性的優(yōu)點而被廣泛應(yīng)用。有研究用RAW264.7細(xì)胞分泌的外泌體與抗生素在37 ℃下共孵育,構(gòu)建了抗生素外泌體,提供了一種有效、經(jīng)濟(jì)、安全的替代方案[17],所以本研究選擇共孵育的方式進(jìn)行載藥。

Fig 4 Drug-loaded and dialysate chromatographic peaks of exosomes at 2 or 4 h (n=3)

Fig 5 Pathway of osthole loading by exosomes

外泌體的載藥效率和外泌體與藥物的比例有一定相關(guān)性。據(jù)報道[18],隨著外泌體與藥物比例的增加,載藥效率會逐步升高,但升高到一定程度后,載藥效率并不會繼續(xù)上升反而下降。同我們的前期研究一致,20 μg阿霉素與不同質(zhì)量(0、50、100、200、400、800、1 600 μg)的外泌體在37 ℃共孵育2 h,發(fā)現(xiàn)在400 μg時的載藥效率最高。本研究缺乏蛇床子素與外泌體的比例變化對載藥效率的影響,將在后續(xù)實驗過程中繼續(xù)探索。

外泌體與蛇床子素共孵育后,經(jīng)HPLC測量發(fā)現(xiàn)存在蛇床子素,且經(jīng)流式分析觀察到外泌體標(biāo)志蛋白CD9陽性表達(dá),說明存在外泌體,即獲得的樣品確定是osthole-Exo。另外,經(jīng)RIPA裂解后,蛇床子素的裝載量有了明顯增加,說明外泌體運輸蛇床子素不僅通過黏附的方式,還有部分蛇床子素通過直接進(jìn)入外泌體膜內(nèi)的方式完成運載。

綜上所述,本研究成功提取了外泌體,構(gòu)建了osthole-Exo的載藥體系,為蛇床子素的應(yīng)用提供了研究基礎(chǔ)。