劉施妍,廖德宇,胡 凱,余伙梅,余 濤, 陳遠(yuǎn)香,張 彥

(重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院,臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室, 重慶 400016)

盡管目前的診療手段已極大地改善了部分乳腺癌患者的預(yù)后,但其發(fā)病率和癌癥死亡病例數(shù)仍占據(jù)女性惡性腫瘤的第一位[1],乳腺癌的遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移與復(fù)發(fā)仍舊給臨床治療帶來挑戰(zhàn)[2]。微小RNA(microRNA,miRNA或miR)屬于小分子非編碼RNA的范疇,其結(jié)構(gòu)通常包括19～25個(gè)核苷酸。靶基因mRNA的3′-非翻譯區(qū)(3′-untranslated region,3′-UTR)可與之特異性地結(jié)合并受其調(diào)節(jié),是miRNA發(fā)揮作用的經(jīng)典途徑[3-4]。miRNA可以調(diào)節(jié)乳腺癌的生長轉(zhuǎn)移[5-6]和免疫逃逸[7]等生物學(xué)過程。miR-619-5p是近年來新發(fā)現(xiàn)的miRNA,在人類各種惡性腫瘤組織中均有異常表達(dá)[8-10]。例如,miR-619-5p在結(jié)直腸癌[11]、口腔鱗狀細(xì)胞癌[9]中低表達(dá),而在非小細(xì)胞肺癌中高度表達(dá)[12]。本課題組早期研究顯示,miR-619-5p可能對(duì)乳腺癌有重要影響,然而,它的具體功能和機(jī)制仍不明確。本課題擬就miR-619-5p在乳腺癌細(xì)胞的上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(epithelial-mesenchymal transition, EMT)過程以及增殖與轉(zhuǎn)移等生物學(xué)行為中的作用進(jìn)行初步研究,基于一系列生物信息學(xué)分析對(duì)其靶基因進(jìn)行探索,以期為乳腺癌診斷及治療提供新的線索。

1 材料與方法

1.1 材料永生化的正常乳腺上皮MCF-10A細(xì)胞、人類乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞系和MCF-7細(xì)胞保存于重慶醫(yī)科大學(xué)檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)院臨床檢驗(yàn)診斷學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室;miR-619-5p模擬物(mimic)和抑制劑(inhibitor)及其陰性對(duì)照均由上海生工生物工程公司設(shè)計(jì)合成;TranswellTM小室(Corning公司);DMEM高葡萄糖培養(yǎng)基(HyClone company);胎牛血清(Clark公司);上海陶術(shù)(Topscience)生化科技有限公司提供Cell Counting Kit-8(CCK-8)溶液;RNA快速提取試劑盒(奕杉生物科技有限公司);GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑(GenePharma公司);逆轉(zhuǎn)錄試劑盒(TaKaRa公司);qRT-PCR引物由上海生工生物工程股份有限公司合成;2×SYBR Green qPCR Master Mix購自Biomake公司;上海碧云天(Beyotime)生物技術(shù)公司提供RIPA裂解液及Western blot所用試劑;ECL顯影液(BioSharp公司);小鼠抗人類β-肌動(dòng)蛋白(β-actin)抗體(南京鐘鼎生物有限公司);兔抗人上皮鈣黏蛋白(epithelial cadherin, E-cadherin)抗體、兔抗人神經(jīng)鈣黏蛋白(neural cadherin, N-cadherin)抗體、兔抗人波形蛋白(Vimentin)抗體、兔抗人鋅指結(jié)構(gòu)轉(zhuǎn)錄因子(Snail)抗體均來自proteintech公司。

1.2 方法

1.2.1生物信息學(xué)分析 利用dbDEMC數(shù)據(jù)庫(https://www.biosino.org/dbDEMC/index)miRNA-seq數(shù)據(jù),對(duì)miR-619-5p在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達(dá)差異進(jìn)行分析;miR-619-5p的靶基因通過檢索miRTarBase(https://mirtarbase.cuhk.edu.cn/)和miRDB(https://mirdb.org/)數(shù)據(jù)庫取交集預(yù)測得到;富集通路分析通過KOBAS(http://kobas.cbi.pku.edu.cn/)數(shù)據(jù)庫進(jìn)行;利用GEPIA(http://gepia.cancer-pku.cn/detail.php)和HPA(https://www.proteinatlas.org/)數(shù)據(jù)庫分析CREB1在乳腺癌組織與正常乳腺組織中的表達(dá)差異;Kaplan-Meier Plotter工具(http://kmplot.com/analysis/index.phpp=background)用于評(píng)估CREB1對(duì)患者無復(fù)發(fā)生存率的影響。

1.2.2細(xì)胞培養(yǎng)與轉(zhuǎn)染 MDA-MB-231與MCF-7細(xì)胞(貼壁生長)采用DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清和100 kU·L-1鏈霉素-青霉素),并將其置于37 ℃培養(yǎng)箱中恒溫培養(yǎng),CO2濃度為5%。用直徑6 cm培養(yǎng)皿接種3×105個(gè)細(xì)胞,在60%～80%細(xì)胞匯合度時(shí),按照GP-transfect-Mate轉(zhuǎn)染試劑說明,將inhibitor-NC、inhibitor、mimic-NC和mimic分別轉(zhuǎn)染細(xì)胞,4～6 h更換培養(yǎng)基,24～48 h后作后續(xù)處理。

1.2.3qRT-PCR對(duì)乳腺癌細(xì)胞和MCF-10A細(xì)胞中miR-619-5p水平和乳腺癌細(xì)胞的EMT相關(guān)分子的 mRNA水平檢測 轉(zhuǎn)染細(xì)胞24 h后提取細(xì)胞總RNA,用1 μg總RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄(逆轉(zhuǎn)錄程序:37 ℃,15 min;85 ℃,5 s;4 ℃,∞);通過qRT-PCR技術(shù)將上述逆轉(zhuǎn)錄得到的cDNA模板,進(jìn)行擴(kuò)增以檢測目的基因。采用U6或GAPDH為內(nèi)參基因,分別檢測各組miR-619-5p的表達(dá)水平和N-cadherin、 E-cadherin、 Vimentin、 Snail mRNA水平。miR-619-5p的莖環(huán)引物5′-GTCGTATCCAGT GCAGGGTCCGAGGTATTCGCACTGGATACGACGGCT CA-3′用于逆轉(zhuǎn)錄。

Tab 1 Primer sequence of quantitative real-time PCR primer sequence

1.2.4Western blot實(shí)驗(yàn)測定細(xì)胞中目的蛋白的表達(dá) 使用RIPA裂解液將轉(zhuǎn)染48 h后的細(xì)胞完全裂解以獲得的細(xì)胞總蛋白質(zhì),并立即通過分光光度法檢測蛋白的含量,然后每組蛋白樣本中添加1/4體積的上樣緩沖液(5×),100 ℃沸水煮沸加熱10 min以使其變性。將每孔上樣量為25～30 μg的蛋白樣本使用8%或10% SDS-PAGE凝膠進(jìn)行電泳,采取濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜至PVDF膜,然后用5%脫脂奶粉進(jìn)行封閉,37 ℃,2～3 h。PVDF膜與鼠抗人β-actin(內(nèi)參照)單抗(1 ∶1 000)、兔抗人E-cadherin多抗(1 ∶5 000);兔抗人N-cadherin多抗(1 ∶2 000);兔抗人Vimentin多抗(1 ∶2 000);兔抗人Snail多抗(1 ∶1 000);兔抗人CREB1多抗(1 ∶1 000)等一抗,于4 ℃孵育12～16 h。用TBST清洗3 次PVDF膜,每次10 min;加入山羊抗小鼠或山羊抗兔IgG二抗(辣根過氧化物酶標(biāo)記,1 ∶5 000稀釋),37 ℃下孵育1 h;再次清洗膜,用ECL顯影液完全覆蓋膜條,Image Lab自動(dòng)凝膠成像系統(tǒng)曝光顯影并分析目的蛋白的灰度值。相對(duì)蛋白表達(dá)水平通過將每個(gè)目的蛋白的灰度值歸一化表示(以β-actin蛋白的灰度值為內(nèi)參照)。

1.2.5CCK-8法檢測miR-619-5p在細(xì)胞增殖中的作用 96孔板中接種100 μL含轉(zhuǎn)染24 h后的細(xì)胞3×103個(gè)的細(xì)胞懸液,培養(yǎng)6～8 h后,在每組5 個(gè)復(fù)孔中加入10 μL CCK-8試劑,全程避光并混勻(計(jì)為0 h),置于培養(yǎng)箱2 h后,各孔的吸光度(OD值)由酶標(biāo)儀測定,波長參數(shù)為450 nm,在培養(yǎng)24、48、72 h后重復(fù)添加CCK-8試劑并測量的步驟,最后繪制出生長曲線。

1.2.6劃痕愈合實(shí)驗(yàn)評(píng)估m(xù)iR-619-5p對(duì)細(xì)胞橫向遷移的作用 在6孔培養(yǎng)板中培養(yǎng)轉(zhuǎn)染后的乳腺癌細(xì)胞,每孔細(xì)胞數(shù)目3×105個(gè)。在細(xì)胞融合度在90%左右時(shí),用10 μL小槍頭在培養(yǎng)板中間,勻速筆直劃線制造劃痕,隨即用PBS清洗1遍,加入雙無DMEM高糖培養(yǎng)基并拍照(記為0 h)。培養(yǎng)24 h和48 h后,選擇同一位置拍照,劃痕距離由ImageJ軟件檢測分析。平均劃痕愈合率=(0 h劃痕寬度-24 h(或48 h)劃痕寬度)/0 h劃痕寬度×100%。

1.2.7TranswellTM實(shí)驗(yàn)檢驗(yàn)miR-619-5p對(duì)細(xì)胞遷移和侵襲所起作用 遷移實(shí)驗(yàn)不需提前添加基質(zhì)膠,侵襲實(shí)驗(yàn)需提前稀釋基質(zhì)膠(基質(zhì)膠原液 ∶無胎牛血清培養(yǎng)基=1 ∶9)并取40 μL鋪在小室的上層,于37 ℃培養(yǎng)箱中將小室靜置1 h。轉(zhuǎn)染24 h后,細(xì)胞被消化并重懸于雙無DMEM高糖培養(yǎng)基中,鏡下計(jì)數(shù)并調(diào)整密度,隨后沿上室壁加入400 μL細(xì)胞密度為3×107個(gè)·L-1的細(xì)胞懸液,700 μL DMEM高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清)添加至下室,在37 ℃下繼續(xù)培養(yǎng),24 h后用PBS緩沖液將小室輕輕漂洗2次,在室溫下用多聚甲醛(4%)固定15 min,隨后再用結(jié)晶紫染液(0.1%)避光染色15 min,PBS漂洗過程中將上室未通過室膜的細(xì)胞用濕棉簽擦除,等待小室晾干后,每個(gè)組別隨機(jī)選擇3 個(gè)視野在尼康Ti-S倒置顯微鏡下觀察,用NIS-Elements成像軟件對(duì)其進(jìn)行拍照并計(jì)數(shù)。

1.2.8統(tǒng)計(jì)學(xué)方法 獨(dú)立重復(fù)3次以上實(shí)驗(yàn),所有實(shí)驗(yàn)結(jié)果采用GraphPad Prism 8.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析,使用t檢驗(yàn)進(jìn)行各組內(nèi)兩兩比較,使用單因素方差分析比較兩組及以上組間數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果

2.1 miR-619-5p在乳腺癌中低表達(dá)通過分析dbDEMC數(shù)據(jù)庫miRNA-seq數(shù)據(jù)顯示,乳腺癌組織中miR-619-5p的表達(dá)比正常乳腺組織更低。乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與MCF-7中miR-619-5p的表達(dá)量較正常乳腺細(xì)胞MCF-10A更低也經(jīng)qRT-PCR實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。見Fig 1。

2.2 miR-619-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的增殖相較于對(duì)照組,乳腺癌細(xì)胞中miR-619-5p表達(dá)在轉(zhuǎn)染miR-619-5p mimic后明顯升高,轉(zhuǎn)染miR-619-5p inhibitor后,細(xì)胞中miR-619-5p的表達(dá)相應(yīng)減少。CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,通過高表達(dá)miR-619-5p明顯削弱了乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,而抑制miR-619-5p的表達(dá)后,細(xì)胞的增殖能力得到促進(jìn)。見Fig 2。

Fig 1 Expression of miR-619-5p in breast cancer and

Fig 2 Proliferation of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

2.3 miR-619-5p對(duì)乳腺癌細(xì)胞的侵襲和遷移起抑制作用通過劃痕愈合實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),miR-619-5p低表達(dá)的乳腺癌細(xì)胞在24、48 h的劃痕愈合率均高于對(duì)照組,而過表達(dá)miR-619-5p使乳腺癌細(xì)胞24、48 h劃痕愈合率明顯低于對(duì)照組。通過TranswellTM遷移與侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),低表達(dá)miR-619-5p的實(shí)驗(yàn)組通過小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯高于對(duì)照組,而miR-619-5p過表達(dá)的實(shí)驗(yàn)組通過小室膜的細(xì)胞數(shù)目明顯減少。見Fig 3。

Fig 3 Migration and invasion of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

2.4 miR-619-5p抑制乳腺癌細(xì)胞的EMTqRT-PCR和Western blot結(jié)果顯示,在兩種細(xì)胞系中,過表達(dá)miR-619-5p使得促EMT分子Snail或間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下降,但上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào);而在低表達(dá)miR-619-5p的乳腺癌細(xì)胞中則得到相反的結(jié)果。以上結(jié)果提示,miR-619-5p可抑制乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231與MCF-7的EMT過程。見Fig 4。

2.5 miR-619-5p靶基因預(yù)測通過miRTarBase和miRDB數(shù)據(jù)庫對(duì)miR-619-5p的靶基因進(jìn)行了聯(lián)合交集預(yù)測,共篩選到95個(gè)miR-619-5p潛在靶基因,對(duì)以上候選基因進(jìn)行GO和KEGG的富集分析利用KOBAS數(shù)據(jù)庫實(shí)現(xiàn)。分析結(jié)果顯示,miR-619-5p的靶基因在cAMP信號(hào)通路(hsa04024)、代謝通路(hsa01100)、cGMP-PKG信號(hào)通路(hsa04022)、TGF-β信號(hào)通路(hsa04350)、Toll樣受體信號(hào)通路(hsa04620)、TNF信號(hào)通路(hsa04668)等途徑中起重要作用。環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合蛋白1(CREB1)得分較高,且與EMT相關(guān)的miR-619-5p靶基因之一,通過miRDB數(shù)據(jù)庫對(duì)其與miR-619-5p的結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行了預(yù)測。在MDA-MB-231細(xì)胞中分別過表達(dá)或抑制miR-619-5p后,CREB1的mRNA與蛋白表達(dá)隨之下調(diào)或上調(diào),而抑制miR-619-5p的表達(dá)則導(dǎo)致CREB1的蛋白水平上升。GEPIA數(shù)據(jù)庫mRNA-seq數(shù)據(jù)顯示,CREB1在乳腺癌組織中的表達(dá)高于正常組織;HPA數(shù)據(jù)庫的免疫組化結(jié)果進(jìn)一步表明,CREB1在正常乳腺組織中主要高表達(dá)于腺細(xì)胞和肌上皮細(xì)胞,另外,脂肪細(xì)胞的表達(dá)量則處于中等水平;而在乳腺癌組織中,CREB1集中在乳腺癌細(xì)胞核高表達(dá)。此外,通過Kaplan-Meier Plotter分析顯示,CREB1高表達(dá)的患者具有更低的無復(fù)發(fā)生存率(RFS)。見Fig 5。

Fig 4 EMT of breast cancer cells inhibited by miR-619-5p n=3)

Fig 5 Prediction for target genes of miR-619-5p and pathway enrichment and impact of miR-619-5p on CREB1

3 討論

乳腺癌具有全球女性惡性腫瘤中位列第一的高發(fā)病率和死亡率[1]。盡管乳腺癌患者的5年生存率已提升了近15%[13],但對(duì)于乳腺癌晚期和特定亞型,如三陰性乳腺癌,其治療方案十分有限,易發(fā)生治療耐藥、轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)等。因此,探究乳腺癌發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制,尋找治療分子靶點(diǎn)仍至關(guān)重要。

miRNA的異常表達(dá)幾乎貫穿了乳腺癌的整個(gè)發(fā)生發(fā)展過程,對(duì)乳腺癌的增殖、轉(zhuǎn)移、代謝、免疫逃逸以及調(diào)控腫瘤微環(huán)境等多方面等產(chǎn)生影響。目前,miR-619-5p作為一種新發(fā)現(xiàn)的miRNA,在腫瘤中主要通過與LncRNA, circRNA構(gòu)成競爭性RNA網(wǎng)絡(luò)(ceRNETs)發(fā)揮作用。例如,miR-619-5p在結(jié)腸腺癌組織中低表達(dá),且在機(jī)制上LncRNA ILF3-AS1可與miR-619-5p結(jié)合并降低其表達(dá),從而調(diào)節(jié)下游靶基因CAMK1D促進(jìn)結(jié)腸腺癌的進(jìn)展[14]。另有研究表明LncRNA PVT1可通過吸附miR-619-5p調(diào)節(jié)Pygo2和ATG14的表達(dá)水平,進(jìn)而影響Wnt/β-catenin信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑和自噬活性,促進(jìn)胰腺癌對(duì)吉西他濱耐藥[10]。在血清外泌體和尿外泌體中的miR-619-5p也可作為新型腫瘤標(biāo)志物[8-15]。本研究選用三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231和ER陽性的MCF-7細(xì)胞株進(jìn)行實(shí)驗(yàn),通過分別轉(zhuǎn)染miR-619-5p的模擬物以及抑制劑來進(jìn)行正反驗(yàn)證。多項(xiàng)體外功能試驗(yàn)顯示,乳腺癌細(xì)胞的增殖活性,遷移與侵襲能力,在一定程度上均被miR-619-5p抑制。這與在胰腺癌[10],口腔鱗狀細(xì)胞癌[9]等所報(bào)道的miR-619-5p發(fā)揮抑制癌細(xì)胞增殖與轉(zhuǎn)移的作用類似,而與在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中miR-619-5p發(fā)揮促癌作用則截然不同。

腫瘤細(xì)胞在EMT發(fā)生時(shí)逐漸由上皮樣(Ep樣)轉(zhuǎn)變?yōu)殚g質(zhì)樣(M樣),這使其在轉(zhuǎn)移過程中適應(yīng)能力更強(qiáng),在到達(dá)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移前生態(tài)位重新激活時(shí)也更易存活[16],而miRNA也可能參與調(diào)控乳腺癌細(xì)胞的EMT[17]。本研究中,miR-619-5p過表達(dá)后,乳腺癌細(xì)胞中促EMT分子Snail或間充質(zhì)標(biāo)志物N-cadherin和Vimentin的表達(dá)下降,但上皮標(biāo)志物E-cadherin的表達(dá)上調(diào);在miR-619-5p低表達(dá)組的結(jié)果相反,上述結(jié)果均證明miR-619-5p能使乳腺癌細(xì)胞的EMT進(jìn)程受阻,從而抑制乳腺癌細(xì)胞的遷移侵襲。

進(jìn)一步利用生物信息學(xué)對(duì)miR-619-5p作用的下游分子機(jī)制進(jìn)行初步探索,發(fā)現(xiàn)miR-619-5p的靶基因主要與cAMP信號(hào)通路(hsa04024)、代謝通路(hsa01100)、cGMP-PKG信號(hào)通路(hsa04022)、TGF-β信號(hào)通路(hsa04350)、TNF信號(hào)通路(hsa04668),Toll樣受體信號(hào)通路(hsa04620)等相關(guān)。在miR-619-5p的靶基因中,CREB1是一種轉(zhuǎn)錄因子,通過與DNA的cAMP反應(yīng)元件(CRE)結(jié)合刺激轉(zhuǎn)錄,其異常表達(dá)與細(xì)胞周期、增殖、分化和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中的其他生物學(xué)過程密切相關(guān)。既往研究表明,CREB1在乳腺癌中高表達(dá),CREB1沉默對(duì)乳腺癌細(xì)胞的增殖有一定的抑制作用[18]。在本研究中,通過生物信息學(xué)分析同樣表明CREB1在乳腺癌中低表達(dá),且其表達(dá)與臨床患者的無復(fù)發(fā)生存率密切相關(guān)。CREB1可受miR-619-5p調(diào)控,因此推測,在乳腺癌中miR-619-5p可通過下調(diào)CREB1發(fā)揮作用。

綜上所述,本研究首次報(bào)道了miR-619-5p在乳腺癌中發(fā)揮的生物學(xué)作用,即miR-619-5p能抑制MDA-MB-231與MCF-7乳腺癌細(xì)胞的增殖活性、遷移、侵襲能力和EMT過程,其作用可能通過靶向調(diào)控CREB1實(shí)現(xiàn)。接下來我們將進(jìn)一步驗(yàn)證miR-619-5p是否直接靶向CREB1進(jìn)而調(diào)控其他信號(hào)通路來抑制乳腺癌侵襲與轉(zhuǎn)移,為臨床診斷和治療乳腺癌提供新的參考。