林雅玲，何康來(lái)，王振營(yíng)，尚素琴，張?zhí)鞚?

（1.中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所/植物病蟲害生物學(xué)全國(guó)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100193；2.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院，蘭州 730070）

亞洲玉米螟Ostriniafurnacalis(Guenée)（Asian corn borer，ACB）屬鱗翅目Lepidoptera，草螟科Crambidae，是玉米上重要的鉆蛀性害蟲，主要在心葉期和穗期造成為害，并且取食后的傷口更利于植物病原體的侵入[1]，對(duì)玉米的產(chǎn)量和品質(zhì)造成直接或間接的損害，是制約玉米產(chǎn)業(yè)高質(zhì)量發(fā)展的重要因素。蘇云金芽胞桿菌Bacillusthuringiensis（Bt）是迄今為止應(yīng)用最成功的病原菌[2]。Bt 在孢子形成過(guò)程中產(chǎn)生的殺蟲晶體蛋白對(duì)鱗翅目、鞘翅目、雙翅目等害蟲具有特異性殺蟲作用，但對(duì)人類和其他非靶標(biāo)昆蟲無(wú)害[3,4]。轉(zhuǎn)Bt基因作物能夠有效控制亞洲玉米螟，但長(zhǎng)期種植轉(zhuǎn)單一Bt基因作物，使害蟲一直處于高選擇壓力之下，抗性的產(chǎn)生不可避免[5]。害蟲的抗性進(jìn)化是威脅轉(zhuǎn)Bt 作物殺蟲效率的主要因素[6]。目前，對(duì)于抗性的治理可采用的策略主要是“高劑量/庇護(hù)所”策略和“多基因”策略[7,8]。但是Kaduskar 等[9]利用Crispr/cas9技術(shù)逆轉(zhuǎn)黑腹果蠅Drosophilamelanogaster對(duì)擬除蟲菊酯的抗性，使得利用基因編輯技術(shù)逆轉(zhuǎn)昆蟲的抗性成為一種可能。

植物和昆蟲之間的關(guān)系在不斷發(fā)展，許多昆蟲依靠生化策略來(lái)減輕在其食用植物中有毒化學(xué)物質(zhì)的影響[10]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶（UDP-glucuronosyl transferase，UGTs）參與糖基化反應(yīng)，在植物體內(nèi)是最大的糖基轉(zhuǎn)移酶家族[11]，分布廣泛，在動(dòng)物、細(xì)菌及病毒中也皆存在。在UGT 酶的催化下，供體分子的糖基可轉(zhuǎn)移到受體分子的糖苷配基上，對(duì)溶解度、穩(wěn)定性和生物活性都有影響[12]，從而使受體的性質(zhì)發(fā)生改變，能將疏水性物質(zhì)轉(zhuǎn)變成水溶性物質(zhì)[13,14]，糖基化反應(yīng)使得糖苷具有更強(qiáng)的極性，更容易溶于水，毒性更小，更容易排出[15]。昆蟲可通過(guò)UGT 酶的糖基化反應(yīng)將食物中的有毒物質(zhì)降解，以減少有毒成分對(duì)其產(chǎn)生的為害，糖基化反應(yīng)在生物體排除和抑制內(nèi)生或外源性的有毒物質(zhì)的過(guò)程中至關(guān)重要。草地貪夜蛾Spodopterafrugiperda利用SfUGT33F28基因特異的dsRNA 干擾沉默特定的UDP-糖基轉(zhuǎn)移酶使得玉米防御性物質(zhì)苯并噁嗪類化合物失活，證明了UGT 酶在體內(nèi)糖基化中的作用[16]。然而，對(duì)昆蟲UGT基因的特性，尤其是在功能水平上的研究仍然很少，對(duì)這種解毒酶超家族的研究不如細(xì)胞色素P450 單加氧酶（cytochrome P450 monooxygenase，P450）、谷胱甘肽S-轉(zhuǎn)移酶（glutathione S-transferase，GST）和羧酸酯酶（carboxylesterase，CarE）等解毒酶的深入。

RNA 干擾（RNA interference, RNAi）是通過(guò)雙鏈RNA（double-stranded RNA, dsRNA）誘導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)基因沉默的現(xiàn)象，dsRNA 降解了mRNA 或調(diào)控靶標(biāo)基因的表達(dá)，從而表現(xiàn)出相應(yīng)的功能缺陷。RNAi 技術(shù)在病蟲害防治中展示出巨大的應(yīng)用潛力，且因其有效性和潛在靶標(biāo)基因的多樣性不易與其他殺蟲劑等產(chǎn)生交互抗性，因此成為一種新興的病蟲害防控手段[17,18]。RNAi 技術(shù)在昆蟲基因功能的研究方面應(yīng)用較多，昆蟲許多重要基因功能應(yīng)用RNAi 技術(shù)而得到闡明。Yang 等[19]使用GST基因特異的干擾dsRNA 飼喂稻飛虱Nilaparvatalugens若蟲后繼續(xù)飼喂含阿魏酸的飼料，發(fā)現(xiàn)若蟲死亡率顯著高于飼喂對(duì)照飼料的若蟲，RNA干擾后增強(qiáng)了阿魏酸對(duì)稻飛虱的毒性。還有研究通過(guò)飼喂亞洲玉米螟膜結(jié)合海藻糖酶基因dsRNA，發(fā)現(xiàn)48 h 后幼蟲中腸幾丁質(zhì)合成酶基因表達(dá)量下降，并且導(dǎo)致幼蟲發(fā)育遲緩，因此推測(cè)膜結(jié)合海藻糖酶基因可能是防治亞洲玉米螟的靶標(biāo)基因[20]。

本研究基于前期對(duì)抗性和敏感亞洲玉米螟轉(zhuǎn)錄組比較篩選出尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶基因OfUGT（GenBank 登錄號(hào)：XM_028311489.1）[21]，為進(jìn)一步研究其功能，我們以亞洲玉米螟抗Cry1Ie 蛋白品系為研究對(duì)象，利用RNAi 方法沉默該基因，明確沉默該基因后對(duì)抗性品系耐藥性的影響。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 供試?yán)ハx 亞洲玉米螟各種群均飼養(yǎng)于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院植物保護(hù)研究所玉米害蟲組。飼養(yǎng)條件為溫度（27±1）℃，相對(duì)濕度70%～80%，光周期16L:8D。敏感品系（ACB-BtS）在室內(nèi)使用無(wú)瓊脂半人工飼料[22]飼養(yǎng)，未接觸任何Bt 制劑或蛋白；Cry1Ie 抗性品系是以敏感品系為蟲源，在飼料中加入一定量Cry1Ie蛋白篩選得到。

1.1.2 供試蛋白 試驗(yàn)所用Cry1Ie 蛋白購(gòu)自北京安百勝生物科技有限公司。

1.2 UGT 基因序列分析

通過(guò)EditSeq 軟件查找序列開放閱讀框。利用DNAMAN 軟件進(jìn)行氨基酸的翻譯。

1.3 UGT 基因在亞洲玉米螟不同品系中表達(dá)量測(cè)定

將亞洲玉米螟3 齡幼蟲置于冰上，待其昏迷后，用鑷子取出腸道，放入PBS 緩沖液中，剪去后腸，用解剖針將中腸撕開，洗去內(nèi)容物，放到蒸餾水中再清洗一遍，用濾紙吸干水份，放入200 μL Trizol 中，5頭幼蟲中腸為1 個(gè)處理，每個(gè)處理3 個(gè)重復(fù)。

采用Trizol 法提取總RNA，經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)質(zhì)量和Nanodrop 2000（Thermo Scientific，USA）測(cè)定濃度后，使用TransScript One-Step gDNA Removal and cDNA Synthesis SuperMix（TransGen Biotech，China）試劑盒反轉(zhuǎn)錄成cDNA 用于qRT-PCR 試驗(yàn)。

使用Primer 3PLUS 設(shè)計(jì)引物，對(duì)引物的擴(kuò)增效率進(jìn)行驗(yàn)證后用于qRT-PCR，以亞洲玉米螟核糖體蛋白L8OfRPL8（登錄號(hào)：NW_021132278）基因?yàn)閮?nèi)參基因[23]，采用2-??CT方法[24]計(jì)算目的基因的相對(duì)表達(dá)量。qRT-PCR 反應(yīng)體系使用PerfectStart Green qPCR SuperMix（TransGen Biotech，China）試劑盒，采用20 μL 反應(yīng)體積，包含10 μL 2×PerfectStart Green qPCR SuperMix、0.8 μL 正向引物、0.8 μL 反向引物、0.4 μL passive reference dye（50×）、1.0 μL cDNA 模板和7.0 μL 無(wú)離子水。使用ABI 7500 fast real-time PCR系統(tǒng)，采用兩步法進(jìn)行反應(yīng)，95 ℃變性30 s 后進(jìn)行40 次循環(huán)：95 ℃（10 s）和60 ℃（20 s），然后進(jìn)行熔解曲線分析，評(píng)價(jià)擴(kuò)增的特異性。

1.4 dsRNA 合成及沉默效率驗(yàn)證

采用T7 Ribo MaxTMExpress RNAi System（Promega，USA）試劑盒合成dsRNA；dsRNA 純化后測(cè)定濃度并分裝保存于-80 ℃冰箱中備用。

隨機(jī)選取Cry1Ie 抗性品系3 齡幼蟲注射，以注射GFP基因dsRNA 的幼蟲為對(duì)照，通過(guò)qRT-PCR 檢測(cè)對(duì)UGT基因沉默效率。將3 齡亞洲玉米螟幼蟲放到冰上麻醉5 min，使用NANOJECT Ⅱ（Drummond，USA）顯微注射器將體外合成UGT基因的dsRNA 從第3 對(duì)腹足注射到幼蟲體內(nèi)，每頭幼蟲注射100.00 nL濃度為3000.00 ng/μL 的dsRNA，注射相同含量GFPdsRNA 的幼蟲為對(duì)照，每組處理各注射45 頭；24 h、48 h 及72 h 后分離中腸，并提取總RNA，使用qRT-PCR 進(jìn)行定量分析。每個(gè)處理包括3 個(gè)生物學(xué)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)5 頭幼蟲。

1.5 沉默UGT 基因前后生測(cè)試驗(yàn)

將3 齡幼蟲注射300.00 ng 的dsRNA 后，放到普通飼料飼養(yǎng)48 h 后，轉(zhuǎn)移到蛋白毒素濃度為500.00 μg/g和1000.00 μg/g 的飼料上進(jìn)行試驗(yàn)，設(shè)置空白對(duì)照組CK，7 d 后統(tǒng)計(jì)存活數(shù)，比較注射dsUGT和dsGFP后的致死效果。

1.6 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用Excel 2016 進(jìn)行數(shù)據(jù)處理和分析。利用GraphPad Prism 9.0 軟件進(jìn)行差異顯著性分析（P＜0.05）。

2 結(jié)果與分析

2.1 UGT 基因序列分析

OfUGT（XM_028311489.1）cDNA 序列全長(zhǎng)1610 bp，開放閱讀框的長(zhǎng)度為1545 bp，編碼514 個(gè)氨基酸（圖1），相對(duì)分子質(zhì)量為187.47 kDa，等電點(diǎn)（PI）為6.57。

2.2 UGT 基因在亞洲玉米螟抗性和敏感品系中表達(dá)量差異

與敏感品系相比，UGT基因在ACB-IeR 中相對(duì)表達(dá)量顯著增高22.52 倍（P＝0.0026）（圖2）。試驗(yàn)中所用引物列于表1。

表1 qRT-PCR 和合成dsRNA 所用引物Table 1 Primers for qRT-PCR and dsRNA synthesis

圖2 OfUGT 基因在亞洲玉米螟抗性品系（ACB-IeR）和敏感品系（ACB-BtS）3 齡幼蟲中的表達(dá)量Fig.2 The expression of OfUGT in resistant strain (ACB-IeR) and susceptible strain (ACB-BtS) of Asian corn borer 3rd instar larvae

2.3 亞洲玉米螟抗性品系注射UGT 基因和GFP 的dsRNA 后表達(dá)量差異

注射dsRNA 后，24 h、48 h 及72 h 的亞洲玉米螟目的基因UGT的相對(duì)表達(dá)量均低于對(duì)照GFP（圖3），且處理后48 h 顯著降低75%（P＝0.0053），處理后72 h 顯著降低60%（P＝0.0101）。結(jié)果表明，通過(guò)顯微注射dsRNA 能夠沉默亞洲玉米螟UGT基因。

圖3 RNA 干擾對(duì)Cry1Ie 亞洲玉米螟抗性品系3 齡幼蟲UGT 基因相對(duì)表達(dá)量的影響Fig.3 Effects of RNAi on relative expression of UGT gene in Cry1Ie ACB-IeR 3rd instar larvae

2.4 沉默抗性品系亞洲玉米螟UGT 基因后對(duì)Cry1Ie 蛋白抗性變化

經(jīng)過(guò)基因沉默效率驗(yàn)證，結(jié)果表明在處理后48 h，對(duì)Cry1Ie 抗性品系中UGT基因沉默效率最高。因此，在注射dsRNA 48 h 后進(jìn)行生測(cè)，將幼蟲轉(zhuǎn)移至濃度為500.00 μg/g 和1000.00 μg/g 的混合Cry1Ie 蛋白的人工飼料上，7 d 后，對(duì)照組在蛋白毒素濃度為1000.00 μg/g 時(shí)的存活率較濃度為500.00 μg/g 時(shí)降低4.17%，但無(wú)顯著性差異；亞洲玉米螟注射dsGFP后在不同濃度蛋白中存活率也無(wú)顯著性差異，但注射dsUGT后亞洲玉米螟在蛋白毒素濃度為1000.00 μg/g 時(shí)的存活率顯著降低（P＜0.001，圖4）。在蛋白毒素濃度為500.00 μg/g 時(shí)，注射dsUGT和dsGFP的抗性亞洲玉米螟存活率無(wú)顯著性差異，分別為80.56%和81.94%；在蛋白毒素濃度為1000.00 μg/g 時(shí)，注射dsUGT后的抗性玉米螟較注射dsGFP的存活率顯著降低（P＜0.01），分別為55.56%和79.17%（表2）。

圖4 亞洲玉米螟Cry1Ie 抗性品系幼蟲沉默UGT 基因后在不同濃度Cry1Ie 蛋白飼料上的存活率比較Fig.4 Comparison of survival rates of Cry1Ie ACB-IeR larvae with the knockdown UGT gene on different concentrations of Cry1Ie protein

3 討論

靶標(biāo)害蟲對(duì)Bt 毒素的抗性是影響轉(zhuǎn)基因作物長(zhǎng)期使用的關(guān)鍵，昆蟲抵抗外源性有毒物質(zhì)的機(jī)制十分復(fù)雜[25]，因此，了解抗性的產(chǎn)生原因?qū)τ陂_發(fā)和實(shí)施新的病蟲控制策略非常重要。對(duì)抗性產(chǎn)生關(guān)鍵基因進(jìn)行改造，實(shí)施針對(duì)性的研究成為迫切的需要。Kaduskar 等[9]使用CRISPR/Cas9 編輯的果蠅抗性品系逆轉(zhuǎn)了對(duì)擬除蟲菊酯的抗性，使得將抗殺蟲劑種群恢復(fù)到敏感狀態(tài)成為可能，這種成功的先例使我們看到利用基因編輯技術(shù)逆轉(zhuǎn)昆蟲抗性的可能性。故而，當(dāng)前研究利用RNAi 方法驗(yàn)證UGT基因在抗性亞洲玉米螟中的功能，為逆轉(zhuǎn)亞洲玉米螟對(duì)Bt 毒素的抗性奠定基礎(chǔ)。

解毒酶是昆蟲代謝殺蟲劑和植物次生物質(zhì)的主要措施之一，在降解外源性有毒物質(zhì)發(fā)揮著重要的作用[26]。昆蟲主要的三大解毒酶是P450、GST 和CarE[27]，此外，有報(bào)道認(rèn)為UGTs 在昆蟲解毒過(guò)程中也扮演重要角色[28]。UGT 酶屬二相代謝酶，它通過(guò)糖苷結(jié)合參與多種親脂性物質(zhì)的生物轉(zhuǎn)化，從而達(dá)到解毒和排除外源有毒物質(zhì)的作用[29]。前人研究發(fā)現(xiàn)昆蟲可以利用UGTs 代謝寄主植物中的有毒物質(zhì)，如亞洲玉米螟可利用UGT 酶降解玉米中的有毒物質(zhì)環(huán)狀異羥肟酸（cyclic hydroxamic acids，cHx）[30]。此外，Li 等[29]對(duì)小菜蛾P(guān)lutellaxylostella中的UGT進(jìn)行了全基因組鑒定，當(dāng)小菜蛾暴露于殺蟲劑的半致死濃度時(shí)大多數(shù)UGT基因的表達(dá)受到影響?？梢?，昆蟲對(duì)Bt 毒素產(chǎn)生抗性可能不僅僅與受體基因突變或缺失相關(guān)，值得注意的是，相關(guān)研究表明UGT與幾種昆蟲對(duì)氯蟲苯甲酰胺、擬除蟲菊酯、噻蟲嗪等殺蟲劑的抗性有關(guān)，UGT基因被抑制后可增加昆蟲對(duì)殺蟲劑的敏感性。Pan 等[31]研究發(fā)現(xiàn)UGT344M2基因被抑制后顯著增加了抗性品系棉蚜Aphisgossypii若蟲對(duì)螺蟲乙酯的敏感性。還有報(bào)道指出[32]，UGT2B17基因在四個(gè)氯蟲苯甲酰胺抗性品系中相對(duì)表達(dá)量上調(diào)，RNAi 沉默該基因后，氯蟲苯甲酰胺對(duì)小菜蛾的毒性顯著增加；并且該研究在使用UGT 酶抑制劑磺吡酮和5-硝基尿嘧啶處理后，氯蟲苯甲酰胺對(duì)小菜蛾3 齡幼蟲的毒性也顯著增加了，由此推斷UGT基因表達(dá)量的上調(diào)可能在昆蟲對(duì)殺蟲劑產(chǎn)生耐藥性中起重要作用。此外，Du 等[33]從轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中鑒定并克隆了煙粉虱Bemisiatabaci兩個(gè)UGT基因，命名為UGT352A4和UGT352A5，RT-qPCR驗(yàn)證兩個(gè)UGT基因在噻蟲嗪抗性品系中相對(duì)于敏感品系過(guò)度表達(dá)，并且RNAi 后，UGT352A5在煙粉虱抗性品系中表達(dá)量下降，導(dǎo)致了抗性品系死亡率顯著升高。這是解毒基因在外源有毒物質(zhì)代謝分解中起關(guān)鍵作用的證據(jù)。

與前人報(bào)道一致，當(dāng)前研究的UGT基因（XM_028311489.1）在ACB-IeR 中相對(duì)表達(dá)量與ACB-BtS相比顯著上調(diào)。ACB-IeR 3 齡幼蟲注射dsUGT后，UGT基因表達(dá)量下降。Cry1Ie 抗性品系3 齡幼蟲在Cry1Ie蛋白濃度為1000.00 μg/g 時(shí)存活率為86.11%，故其致死中濃度大于1000.00 μg/g，所以對(duì)照組在Cry1Ie蛋白濃度為1000.00 μg/g 時(shí)的存活率低于濃度為500.00 μg/g 時(shí)，但無(wú)顯著性差異。在濃度為500.00 μg/g的Cry1Ie 蛋白毒素中，注射dsUGT和dsGFP后的幼蟲的存活率沒有顯著性差異，但較空白對(duì)照組存活率顯著降低；然而注射dsGFP后的幼蟲在濃度為1000.00 μg/g 的Cry1Ie 蛋白毒素中存活率較空白對(duì)照組降低，但無(wú)顯著性差異，推測(cè)是由于注射造成的傷害帶來(lái)的差異。此外，注射dsUGT后的幼蟲在濃度為1000.00μg/g 的Cry1Ie 蛋白毒素中的存活率較空白對(duì)照和注射dsGFP的都顯著下降，由此可以看出RNAi 沉默OfUGT基因后可以降低抗性品系亞洲玉米螟對(duì)Cry1Ie 蛋白的抗性，但對(duì)抗性的逆轉(zhuǎn)程度還需要后續(xù)更進(jìn)一步的研究。