唐敏敏，邵雪梅，高 巍，宋錦柱，朱曉軍，馮 云，鄒 潔,*，許丹科*

（1.江蘇省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，江蘇 南京 210000；2.南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院，生命分析化學(xué)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 南京 210046；3.南京醫(yī)科大學(xué)公共衛(wèi)生學(xué)院，江蘇 南京 211166）

氨基糖苷類藥物（aminoglycosides，AGs）是一類廣譜抗生素，自1943年首次發(fā)現(xiàn)以來，在治療重大細(xì)菌感染和結(jié)核病方面發(fā)揮著重要作用[1]。但是毒理學(xué)研究表明，AGs表現(xiàn)出相當(dāng)嚴(yán)重的副作用，例如耳毒性和腎毒性，過敏反應(yīng)。牛奶是日常飲食中的常見食物，含有脂肪、多肽、蛋白質(zhì)和礦物質(zhì)元素等多種營養(yǎng)物質(zhì)。AGs具有廣譜抗菌性，可治療奶牛乳腺炎、奶牛結(jié)核病等，還可作為促生長劑提高飼料報(bào)酬率，因此被直接或間接使用于奶和奶制品的生產(chǎn)、加工和貯藏中[2]。人類食用這些有藥物殘留的動物產(chǎn)品也會遭受風(fēng)險(xiǎn)，此外，還易導(dǎo)致細(xì)菌耐藥性的發(fā)展，從而給疾病治療增加難度。GB 31650—2019《食品中獸藥最大殘留限量》中規(guī)定了AGs在不同動物組織中的最大殘留限量，規(guī)定在牛奶中慶大霉素不得超過200 μg/kg，卡那霉素不得超過150 μg/kg，新霉素不得超過1 500 μg/kg。為規(guī)范AGs使用，政府每年均需要投入大量的人力物力保證農(nóng)產(chǎn)品安全。因此，建立具有高準(zhǔn)確度和靈敏度的AGs的檢測方法尤為重要。

固相萃?。╯olid phase extract，SPE）在獸藥前處理中發(fā)揮相當(dāng)重要的作用，不僅能夠富集目標(biāo)物，還可以凈化樣品基質(zhì)。牛奶中AGs中最常用的是C18反相SPE[3]或MCX、WCX離子交換模式的SPE[4-7]。與單模式吸附劑相比，混合模式吸附劑通過多種相互作用具有更好的吸附選擇性，可以通過控制洗滌條件輕松去除雜質(zhì)。除了常規(guī)使用的SPE柱外，不少研究者利用分子印跡[8-9]或磁珠、石墨烯等材料鍵合硼酸基團(tuán)[10]、羥基[11-12]、羧基[13]開發(fā)了一系列AGs的吸附劑。介孔材料MCM-41型材料的骨架由六邊形排列的圓柱形介孔組成，具有高表面積和窄孔徑分布，優(yōu)異的孔隙結(jié)構(gòu)，高的熱穩(wěn)定性和化學(xué)穩(wěn)定性，其表面具有大量的硅羥基，可通過官能團(tuán)的修飾增加功能，在吸附化學(xué)領(lǐng)域引起了極大的研究興趣[14]。目前已有文獻(xiàn)報(bào)道表面修飾的介孔材料在鉛、陰離子有毒偶氮染料、生物毒素等方面的應(yīng)用[15-18]，但在AGs富集上還應(yīng)用較少。

由于AGs不具有揮發(fā)性，沒有發(fā)色團(tuán)或者熒光團(tuán)，不適合直接進(jìn)行紫外或熒光檢測[1]，需要進(jìn)行衍生處理，這增加了前處理的復(fù)雜性。隨著質(zhì)譜技術(shù)的出現(xiàn)，液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)成為最簡單和準(zhǔn)確的檢測手段[2]。在色譜分離上，AGs是具有高極性的化合物，它們在普通反相色譜柱上的保留相當(dāng)弱[13]。最常見的解決方法是在流動相中添加離子對試劑[10]。但是，這些添加劑可能會導(dǎo)致色譜柱嚴(yán)重污染和電噴霧電離（electrospray ionization，ESI）的離子抑制作用[19]。Amide柱為酰胺基鍵合亞乙基橋雜化顆粒色譜柱，較C18反相柱、親水型的HSS T3和BEH HILIC正相柱，具有易保留與分離強(qiáng)極性分析物的特點(diǎn)，同時可避免離子對試劑對儀器的污染，因此比離子對色譜法更有優(yōu)勢。

本研究基于介孔材料MCM-41開發(fā)了一種新的反相/陽離子交換混合模式的吸附劑，以安普霉素（apramycin，APC）、慶大霉素（gentamicin，GTC）、卡那霉素（kanamycin，KNM）、新霉素（neomycin，NMC）、阿米卡星（amikacin，AKH）和妥布霉素（tobramycin，TBC）6 種AGs為目標(biāo)分析物。合成的雙官能團(tuán)化的吸附劑中含有豐富的羧基，在合適的pH值下可解離，預(yù)期通過陽離子交換作用有效地提取AGs，同時，合成材料和AGs有一定的疏水相互作用，可通過調(diào)整淋洗液洗去雜質(zhì)，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)凈化。開發(fā)的吸附劑對目標(biāo)物有較好的吸附能力和良好的選擇性，并進(jìn)一步評估其在超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（ultra-high performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）分析中對基質(zhì)效應(yīng)（matrix effect，ME）的改善效果。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

全脂牛奶樣品 江蘇南京蘇果超市。實(shí)驗(yàn)前經(jīng)過國家標(biāo)準(zhǔn)方法（GB/T 22969—2008《奶粉和牛奶中鏈霉素、雙氫鏈霉素和卡那霉素殘留量的測定 液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法》）測定不含6 種AGs中的任何一種，作為基質(zhì)空白樣品用于ME和方法開發(fā)研究。

MCM-41 江蘇先豐納米材料科技有限公司；十八烷基三甲氧基硅烷（octadecyltrimethoxysilane，C18TMS） 上海泰坦科技股份有限公司；無水甲苯、N,N-二甲基甲酰胺（N,N-dimethylformamide，DMF）南京化學(xué)試劑股份有限公司；3-氨丙基三乙氧基硅烷（3-aminopropyltriethoxysilane，APTES）、琥珀酸苷（succinic acid glycoside，SAA）、三氯乙酸、磷酸氫二鉀 阿拉丁化學(xué)試劑有限公司；無水乙醇、氫氧化鈉國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；以上試劑均為分析純。AGs標(biāo)準(zhǔn)品 上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司（生產(chǎn)商為德國Dr.EhrensorferGmbH公司）。

1.2 儀器與設(shè)備

Arium Pro超純水系統(tǒng) 德國Sartorius公司；ME104E萬分之一電子分析天平 瑞士Mettler Toledo公司；5810R高速冷凍離心機(jī) 美國Eppendorf公司；DZF-6051真空干燥箱 南京市南北儀器公司；Nicolet Is50傅里葉變換紅外光譜儀 美國Thermo Scientific公司；JEOL JSM-7800F熱場掃描電子顯微鏡、JEOL 2800高通量投射電子顯微鏡 日本電子公司；JWBK200B比表面積和孔徑分析儀 北京精微高博科技有限公司；API 6500 Plus三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（搭載Sciex Exion LC超高效液相色譜） 美國AB SCIEX公司。

1.3 方法

1.3.1 C18/COOH功能化介孔MCM-41材料的合成

1.3.1.1 C18/NH2功能化介孔MCM-41材料的制備

根據(jù)文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行合成，并作修改。具體如下，將1 g MCM-41分散于100 mL無水甲苯中，在60 ℃機(jī)械攪拌20 min，隨后逐滴加入APTES和C18TMS各1.2 mL，于110 ℃油浴中劇烈攪拌回流15 h，將所得的白色固體產(chǎn)物收集，并用無水乙醇洗滌3 次，于烘箱中真空干燥（真空度-0.08 MPa，65 ℃，12 h）得到C18/NH2功能化的介孔MCM-41材料（MCM-41@NH2@C18）。同時，對照材料分別為不加入APTES和C18TMS，僅加入APTES，其余處理方法相同。

1.3.1.2 C18/COOH功能化介孔MCM-41材料的制備

羧基功能化的方法參照文獻(xiàn)[21]，并作修改。稱取C18/NH2功能化介孔MCM-41材料0.8 g，分散于100 mL DMF中，室溫?cái)嚢?0 min。稱取11.5 g SAA溶于50 mL DMF中，逐滴緩慢滴入攪拌均勻的反應(yīng)體系中，滴加完之后繼續(xù)室溫?cái)嚢?4 h。反應(yīng)結(jié)束后，收集白色粉末，并用無水乙醇洗滌3 次，于烘箱中真空干燥（65 ℃、12 h）得到最終反應(yīng)產(chǎn)物（MCM-41@COOH@C18）。制備流程示意圖見圖1。

圖1 MCM-41@COOH@C18的合成示意圖和檢測流程圖Fig.1 Schematic diagram for the synthesis of MCM-41@COOH@C18 and its application in SPE

1.3.2 樣品制備

準(zhǔn)確吸取牛奶樣品1.0 mL，加入5%三氯乙酸溶液10 mL和0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL，于50 mL塑料離心管中混合。渦旋30 s，振蕩5 min。在4 ℃、10 000 r/min離心2 min后，將上清液轉(zhuǎn)移到另一50 mL離心管中，用10 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)pH值至6.0，備用。

1.3.3 SPE步驟

將MCM-41@COOH@C18介孔微球（30 mg）裝填至兩端具有篩板的SPE小柱中（3 mL）。使用前預(yù)先用3 mL甲醇和3 mL水活化填料。將上述提取溶液全部通過SPE小柱后，依次用2 mL水和2 mL甲醇淋洗，抽干。用1 mL水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）洗脫，收集洗脫液，在UPLC-MS/MS分析之前使用0.22 μm濾膜過濾，SPE過程示意圖見圖1。

1.3.4 回收率實(shí)驗(yàn)

日內(nèi)回收率實(shí)驗(yàn)：在空白牛奶樣品中分別加入5、50、200 ng/mL的AGs標(biāo)準(zhǔn)品，每個質(zhì)量濃度做6 次重復(fù)。按照建立的方法進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，計(jì)算回收率和精密度。

日間回收率：在空白牛奶樣品中分別加入5、50、200 ng/mL的AGs標(biāo)準(zhǔn)品，每個濃度做6 次重復(fù)，按照建立的方法測試3 d，計(jì)算回收率和精密度。

1.3.5 UPLC-MS/MS檢測

在Waters ACQUITY BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）上進(jìn)行色譜分離，流動相A為2 mmol/L乙酸銨溶液（1%甲酸），流動相B為2 mmol/L乙酸銨乙腈溶液（1%甲酸）。線性梯度為：0～2.5 min，20% A、80% B；2.5～3.5 min，20%～65% A、80%～35% B；3.5 ～5.5 m i n，6 5%～9 0% A、3 5%～1 0% B；5.5～6.5 min，90% A、10% B；6.5～6.6 min，90%～20% A、10%～80% B；6.6～9 min，20% A、80% B。流動相流速為0.3 mL/min。柱溫設(shè)置為40 ℃，進(jìn)樣量為2 μL。

通過使用注射泵以10.0 μL/min的流速連續(xù)注入AGs混合標(biāo)準(zhǔn)溶液（100.0 ng/mL），優(yōu)化ESI＋的質(zhì)譜參數(shù)。MS條件：ESI＋模式，離子源電壓5.5 kV；霧化溫度550 ℃；霧化氣（空氣）壓力50 psi；輔助氣（空氣）壓力55 psi；氣簾氣（氮?dú)猓毫?5.0 psi。在多反應(yīng)監(jiān)測（multiple reaction monitoring，MRM）掃描模式下進(jìn)行采集。選擇質(zhì)子化的分子離子作為母離子，使用兩個子離子進(jìn)行定量和定性。MRM模式質(zhì)譜參數(shù)如表1所示。

表1 MRM模式下AGs的質(zhì)譜優(yōu)化參數(shù)Table 1 Optimized MS parameters for AGs in MRM mode

1.3.6 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

標(biāo)準(zhǔn)儲備液配制：準(zhǔn)確稱取適量標(biāo)準(zhǔn)品于10 mL聚丙烯容量瓶中，用水溶解后定容，配制成0.5 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液。

混合標(biāo)準(zhǔn)中間溶液配制：分別吸取5 mL標(biāo)準(zhǔn)儲備溶液置于50 mL聚丙烯容量瓶中，用水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）定容，配制成50 μg/mL的中間液。

混合標(biāo)準(zhǔn)工作溶液配制：溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線用水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）將混合標(biāo)準(zhǔn)中間液稀釋至5.0、10.0、20.0、50.0、100.0、500.0 ng/mL的一系列質(zhì)量濃度?；|(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)溶液用基質(zhì)空白溶液稀釋至相同質(zhì)量濃度。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

使用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析處理，采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行圖表繪制。

2 結(jié)果與分析

2.1 吸附材料的表征

由于MCM-41介孔材料具有均一孔徑的長程有序的孔道結(jié)構(gòu)和極高的比表面積，非常適合作為吸附材料[14]。所制備的MCM-41@COOH@C18不破壞原有的孔道結(jié)構(gòu)，在SEM（圖2a）中可以清楚地觀察到蠕蟲狀的顆粒，呈簇狀生長，與Zhang Jiaojing等[22]的報(bào)道一致，排列致密，最小粒徑約為200 nm。此外，如圖2b所示，TEM顯微圖片證明了高度有序的介孔結(jié)構(gòu)，顯示了約4 nm寬的有序通道的存在。

圖2 MCM-41@COOH@C18的掃描電鏡圖（a）和透射電鏡圖（b）Fig.2 SEM (a) and TEM (b) micrographs of MCM-41@COOH@C18

通過氮?dú)馕矫摳郊夹g(shù)，MCM-41和MCM-41@COOH@C18兩種材料的吸附-脫附曲線和孔徑分布如圖3所示。根據(jù)IUPAC分類，這兩條曲線為IV型。這種等溫線是介孔材料的典型特征曲線[23]。MCM-41的BET比表面積為1 049.9 m2/g，平均孔徑為3.6 nm。從圖3a可以看出，相對壓力（P/P0）＜0.3時，氮的吸附量隨著P/P0增加而增加。這是因?yàn)樵诔跏茧A段發(fā)生了單層吸附。P/P0為0.3～0.4時，由于氮?dú)庠诮榭撞牧现邪l(fā)生毛細(xì)管團(tuán)聚，氮?dú)馕搅考眲∩仙?。?dāng)P/P0為0.4～1時，氮吸附量增長緩慢，說明材料外比表面積較低，孔隙數(shù)量較少。引入—C18和—COOH基團(tuán)時，樣品表現(xiàn)出不那么尖銳的臺階，并且MCM-41@COOH@C18的孔徑顯示出了雙峰孔分布，雙官能團(tuán)修飾后材料的比表面積和孔徑都有一定程度的減小，比表面積為505.8 m2/g，平均孔徑為2.6 nm，這歸因于修飾的基團(tuán)占據(jù)了結(jié)構(gòu)通道。

圖3 N2吸附-脫附等溫線和孔徑分布曲線Fig.3 N2 adsorption-desorption isotherm and pore size distribution curves of MCM-41 and MCM-41@COOH@C18

為了驗(yàn)證合成的吸附劑有效基團(tuán)，圖4顯示了MCM-41原材料和合成后的MCM-41@COOH@C18的傅里葉變換紅外光譜。MCM-41和MCM-41@COOH@C18在808、978 cm-1和1 088 cm-1處顯示出二氧化硅的典型特征峰，分別對應(yīng)Si—O—Si對稱鍵、Si—OH伸縮鍵、Si—O—Si不對稱鍵的振動。光譜中觀察到的3 445、3 550 cm-1和1 632 cm-1，1 651 cm-1處的吸附帶為硅烷醇基團(tuán)的—OH拉伸[22]。由于C18和羧基基團(tuán)的修飾，合成后的MCM-41@COOH@C18在2 855 cm-1和2 928 cm-1處出現(xiàn)兩個新峰，這是由于C18鏈上—CH2—和—CH3的C—H振動[18]。1 724 cm-1的新峰是羧基的C＝O峰，這些結(jié)果證實(shí)了MCM-41表面改性的成功。

圖4 MCM-41, MCM-41@COOH@C18的傅里葉紅外光譜圖Fig.4 Fourier infrared spectra of MCM-41 and MCM-41@COOH@C18

2.2 SPE條件的優(yōu)化

以上結(jié)果證明成功合成了該介孔材料，制備好的MCM-41@COOH@C18材料具有良好的水分散性，可以在水溶液中均勻分散，沒有任何聚集。選擇的6 種AGs化學(xué)結(jié)構(gòu)中均有許多氨基和羥基，屬于親水性的化合物。預(yù)測富集機(jī)理是反相和離子交換兩種模式共同決定的，由于MCM-41@COOH@C18含有豐富的羧基，羧基在合適的pH值條件下可解離，可通過陽離子交換有效地富集AGs，同時，鍵合的C18和AGs有一定的疏水相互作用，可以利用淋洗液的選擇進(jìn)一步分離目標(biāo)物和雜質(zhì)。為評估MCM-41@COOH@C18介孔材料在富集AGs的適用性，進(jìn)一步優(yōu)化可能影響提取的參數(shù)，例如提取液種類、提取時的pH值（3.0～7.0）、吸附劑的量、洗脫溶劑種類、洗脫溶劑體積。

2.2.1 提取液種類選擇

常用的AGs提取溶劑有磷酸鹽緩沖溶液、三氯乙酸、乙二胺四乙酸二鈉鹽溶液。對這3 種溶液的提取效果分別進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)用磷酸鹽緩沖液和乙二胺四乙酸二鈉處理后的樣品提取液渾濁，影響后續(xù)SPE柱凈化和回收率實(shí)驗(yàn)。三氯乙酸提取后，離心后的溶液較為澄清，沒有絮狀雜質(zhì)。說明三氯乙酸易于沉淀牛奶中的蛋白質(zhì)，同時加入的磷酸鹽緩沖液有助于pH值的調(diào)節(jié)，因此最終選擇5%三氯乙酸溶液10 mL和0.1 mol/L磷酸氫二鉀溶液5 mL作為提取溶液。

2.2.2 pH值的優(yōu)化

所制備的MCM-41@COOH@C18具有大的比表面積、均勻的孔徑和良好的雙官能團(tuán)修飾。經(jīng)過SPE時，備用溶液的pH值會影響目標(biāo)物的離子化。合成的雙功能化吸附劑中含有豐富的羧基，在適宜的pH值下可解離，與AGs上的氨基發(fā)生離子交換作用，因此比較了備用溶液的pH值為3、4、5、5.5、6、6.5、7時，目標(biāo)物在SPE柱上的保留情況。富集前牛奶中的AGs質(zhì)量濃度為100 ng/mL，保證同樣的SPE柱填充量為30 mg，將通過SPE柱的不同p H 值的樣品溶液收集，用G B/T 2 2 9 6 9—2 0 0 8 進(jìn)行檢測（預(yù)先經(jīng)過實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，該方法回收率范圍86.9%～98.5%），得到富集前后備用溶液中的AGs含量。圖5表明，當(dāng)溶液pH值為3和4時，每種目標(biāo)藥物在合成的吸附填料上的富集率均不超過50%，當(dāng)pH值為5和5.5時，AKH、KNM的富集率不超過80%，當(dāng)溶液pH值為6～7時，溶液中的AGs在SPE柱上的富集率較高。這說明樣品pH值是影響離子交換模式的關(guān)鍵因素，綜合考慮，選定樣品溶液的pH值為6，此時目標(biāo)物的富集率為84.0%～97.6%。

圖5 樣品pH值對富集效率的影響Fig.5 Effect of pH on enrichment efficiency

2.2.3 SPE柱填料用量的選擇

因?yàn)槲絼┏休d目標(biāo)物的能力有限，為了獲得最大的富集效果，足夠的吸附劑用量必不可少，選擇SPE柱填充量為30 mg，比較不同質(zhì)量濃度（40、80、400 ng/mL和2 000 ng/mL）的氨基糖苷溶液的回收率情況（圖6a），發(fā)現(xiàn)對于每一種AGs，不同質(zhì)量濃度的相應(yīng)目標(biāo)物均能取得較為一致和穩(wěn)定的回收率，且回收率范圍均在70%～110%之間，滿足分析方法要求，說明30 mg的填料含量不會存在柱過載現(xiàn)象，因此選擇SPE填料量為30 mg。

圖6 不同條件對回收率的影響（n=3）Fig.6 Effect of SPE conditions on recovery (n = 3)

2.2.4 淋洗液的選擇

淋洗液在一個完整的SPE過程中可洗滌富集在SPE填料上的共萃取物，有效將目標(biāo)物和干擾組分分離。理想的淋洗液應(yīng)不損失目標(biāo)物同時又可洗滌雜質(zhì)，減少基質(zhì)干擾。選擇2 mL水和2 mL甲醇兩種不同性質(zhì)的溶劑作為淋洗液，收集后經(jīng)過UPLC-MS/MS檢測，均沒有目標(biāo)物存在，說明淋洗液不會造成目標(biāo)物的損失。

2.2.5 洗脫溶劑的選擇

AGs分子中具有豐富的氨基，可以與合成的MCM-41@COOH@C18中的羧基產(chǎn)生陽離子交換作用，在洗脫溶劑中加入酸會有助于削弱陽離子交換相互作用[24]。AGs又是極性較高的一類藥物，因此在洗脫溶劑的選擇上，選擇乙腈、水和甲酸的混合物為洗脫溶劑，其中，乙腈的比例不宜過高，過高的乙腈含量會導(dǎo)致目標(biāo)藥物和吸附劑之間的親水相互作用不易被破壞。設(shè)定為在整個洗脫體系中乙腈體積分?jǐn)?shù)為5%，酸溶液的選擇既能提供一定的酸度，也要適用于質(zhì)譜離子源的離子化，因此選擇揮發(fā)性酸甲酸。選擇提取液的pH值為6，SPE填料量為30 mg，水和甲醇為淋洗液，比較甲酸體積分?jǐn)?shù)從0%到5%以選擇最優(yōu)的洗脫溶劑。從圖6b可以看出，當(dāng)甲酸體積分?jǐn)?shù)為2%時，6 種AGs回收率均超過70%。因此，選擇洗脫液比例為水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）。

2.2.6 洗脫液體積優(yōu)化

除了洗脫溶劑的類型，洗脫溶劑的體積也影響著整個SPE的回收率。比較水-乙腈-甲酸（93∶5∶2，V/V）1 mL和2 mL對目標(biāo)物回收率的影響，其他參數(shù)保持相同。如圖6c所示，這兩種洗脫體積對目標(biāo)物的回收率并沒有造成顯著性差異，1 mL的洗脫液用量回收率均超過70%，說明1 mL的洗脫用量足夠洗脫AGs。洗脫體積增加，造成目標(biāo)物的稀釋，還需要采取后續(xù)的濃縮步驟，會增加實(shí)驗(yàn)的復(fù)雜程度。因此選擇洗脫液用量為1 mL。

2.3 ME評估

在HPLC-MS/MS經(jīng)常觀察到信號增強(qiáng)或抑制效應(yīng)，導(dǎo)致回收率偏高或者偏低[25]。牛奶中含有一些內(nèi)源性物質(zhì)，如蛋白、脂質(zhì)、氨基酸和其他復(fù)雜成分[10]，ME可通過基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線和溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線評估。ME/%=空白基質(zhì)中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積/溶劑中標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)的峰面積×100。當(dāng)ME在80%～120%范圍內(nèi)時，ME被認(rèn)為可以忽略。ME大于120%表示信號增強(qiáng)，而ME小于80%表示信號抑制[6,26-27]。不使用任何凈化方式，直接將備用液進(jìn)行UPLC-MS/MS檢測，會導(dǎo)致ME值很低（42.0%～62.0%）（圖7），表明存在信號抑制。相比之下，使用僅經(jīng)過羧基修飾的MCM-41@COOH材料，部分藥物的ME值得到了改善，如AKH、KNM的ME值在80%～120%的合理范圍內(nèi)，但GTC的ME值高達(dá)229.9%。在羧基化填料的基礎(chǔ)上，同時引入了C18基團(tuán)，這時目標(biāo)物產(chǎn)生的ME值范圍為78.0%～120.0%，說明雙官能化的MCM-41@COOH@C18的材料在基質(zhì)凈化方面更有優(yōu)勢。將合成的MCM-41@COOH@C18吸附劑與商業(yè)產(chǎn)品WCX（3 mL/60 mg，Waters）進(jìn)行比較。如圖7所示，由于WCX SPE柱是陽離子交換柱，它的ME值為72.0%～114%，主要是因?yàn)樗梢赃x擇性地吸附堿性目標(biāo)物，而用水和甲醇洗滌可以排除中性和脂類化合物。因此，混合模式SPE在降低ME方面與商業(yè)WCX SPESPE柱相當(dāng)，說明合成的MCM-41@COOH@C18具有顯著的改善ME的效果。從理論上講，混合模式吸附劑降低ME的能力與大量疏水性、中性等雜質(zhì)有關(guān)，這些雜質(zhì)可以通過用水和甲醇洗滌去除。

圖7 不同SPE填料對ME的影響Fig.7 Effect of different SPE fillers on matrix effect

2.4 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

色譜分離上，由于AGs是強(qiáng)極性化合物，在普通反相色譜柱上的保留相當(dāng)弱。為了在反相色譜柱上有較好的保留，常會在流動相中加入三氟乙酸等離子對試劑[28]，但是離子對試劑會造成基質(zhì)抑制，損害柱壽命等問題，因此AGs的分離也是檢測人員面臨的挑戰(zhàn)之一。近年來，氨基柱也被廣泛用于AGs的分析[29]。該柱在亞乙基橋雜化的高純硅膠顆粒上鍵合了酰胺基，相較于HILIC柱具有更高的穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)用的是Waters ACQUITY BEH Amide（2.1 mm×100 mm，1.7 μm）色譜柱，其適用于分離強(qiáng)極性物質(zhì)?？疾旒兯⒓姿崛芤?、乙酸溶液、乙酸銨緩沖液作為水相，乙腈作為有機(jī)相對AGs的分離效果，發(fā)現(xiàn)2 mmol/L的乙酸銨溶液的峰形和靈敏度最佳。在流動相中加入1%的甲酸有助于增強(qiáng)離子化程度，提高靈敏度。在有機(jī)相中加入2 mmol/L乙酸銨時，穩(wěn)定的酸性環(huán)境增強(qiáng)了對目標(biāo)物的洗脫能力，減少拖尾現(xiàn)象[30]。從圖8可以看出，牛奶基質(zhì)中添加100 ng/mL AGs的色譜圖，目標(biāo)峰附近沒有明顯的干擾，峰形和響應(yīng)良好，這表明該實(shí)驗(yàn)條件下可以分離6 種AGs。

圖8 6 種AGs的提取離子流圖Fig.8 Extracted ion current chromatograms of six AGs

AGs結(jié)構(gòu)中含有氨基環(huán)醇、羥基和伯胺或仲胺基團(tuán)等，呈強(qiáng)極性和弱堿性，適合ESI＋掃描模式。選擇100 ng/mL混合標(biāo)準(zhǔn)溶液連續(xù)注射進(jìn)入質(zhì)譜離子源入口，優(yōu)化后的質(zhì)譜條件見表1。

2.5 方法驗(yàn)證

采用基質(zhì)匹配標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，標(biāo)準(zhǔn)曲線質(zhì)量濃度為5.0、10.0、20.0、50.0、100.0 ng/mL和500.0 ng/mL，線性方程見表2，相關(guān)系數(shù)（r）為0.992 7～0.999 5，均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

表2 6 種AGs的線性方程、相關(guān)系數(shù)、檢出限和定量限Table 2 Linear equations, correlation coefficients, LODs and LOQs of six AGs

基于信噪比為3，牛奶中AGs檢出限為0.30～2.50 ng/mL，基于信噪比為1 0 ， 牛奶中A G s 定量限為1.00～10.0 ng/ mL，這完全符合牛奶中AGs檢測的要求。使用低、中、高質(zhì)量濃度（5、50、200 ng/mL）的加標(biāo)空白樣品進(jìn)行回收率實(shí)驗(yàn)考察，結(jié)果見表3。每個水平做6 次重復(fù)，6 種AGs的平均日內(nèi)回收率范圍為74.3%～107%，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（relative standard deviation，RSD）范圍分別為3.0%～13.3%；日間回收率范圍為77.2%～106%，RSD范圍為2.6%～15.7%。這些結(jié)果表明，將合成的MCM-41@COOH@C18填料應(yīng)用于牛奶中的AGs檢測的準(zhǔn)確度和精密度能夠滿足常規(guī)監(jiān)測的要求。

表3 牛奶中添加3 個水平的AGs的回收率和重復(fù)性（n=6）Table 3 Recoveries and repeatability RSDs of AGs at different concentrations in spiked milk (n = 6)%

2.6 與已經(jīng)報(bào)道的方法的比較

將所建立的方法與近年來報(bào)道的不同基質(zhì)樣品中的AGs的其他技術(shù)進(jìn)行比較（表4）。報(bào)道的文獻(xiàn)主要基于SPE、MDSPE與MS/MS檢測系統(tǒng)的耦合。無論使用哪種SPE類型，報(bào)道的吸附劑都是基于分子印跡材料，反相或離子交換的，僅針對單獨(dú)吸附模式。相比之下，反相/陽離子交換型吸附劑與AGs的結(jié)構(gòu)相匹配，因此可以通過靜電基團(tuán)選擇性地吸附目標(biāo)物，同時利用反相作用有效分離目標(biāo)物和雜質(zhì)。在材料制備上，原料成本低廉，合成方式簡單；在目標(biāo)物檢測方面，所建立的方法覆蓋種類多，能夠同時有效測定6 種AGs，說明合成的MCM-41@COOH@C18對AGs具有良好的吸附和洗脫特性；在方法性能上，AKH、TBC、KNM、GTC、NMC、APC的回收率均在74.3%～107%之間，方法檢出限在同類樣品檢測中也優(yōu)于其他已報(bào)道的方法。

表4 與其他報(bào)道的AGs LC-MS/MS檢測方法的比較Table 4 Comparison of the proposed method with other reported methods for detection of AGs

3 結(jié) 論

通過兩步反應(yīng)法合成了MCM-41@COOH@C18介孔材料，并將其作為SPE吸附劑填料用于牛奶中AGs的殘留分析?；诮榭撞牧系拇蟮耐獗砻娣e和介孔通道，對其進(jìn)行羧基和烷基的雙官能團(tuán)修飾。由于材料上的羧基和氨基之間的離子交換相互作用，通過調(diào)節(jié)淋洗液將樣品基質(zhì)進(jìn)行了凈化，顯示了該合成材料在復(fù)雜基質(zhì)中選擇性富集和純化AGs的巨大能力。為了獲得最佳SPE富集效果，進(jìn)一步系統(tǒng)優(yōu)化SPE條件，結(jié)果表明在5～500 ng/mL線性范圍內(nèi)具有良好的回收率和精密度。該方法簡便、經(jīng)濟(jì)、靈敏，可操作性強(qiáng)，已將其成功應(yīng)用于牛奶樣品中6 種AGs的提取。未來可將該MCM-41@COOH@C18介孔材料作為吸附劑拓展到其他食品基質(zhì)中。