藏 偉，劉 葉，劉 宇，彭 帥，陳學(xué)蓮，王 婧,*

（1.甘肅農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅紫軒酒業(yè)有限公司，甘肅 嘉峪關(guān) 735100）

酵母菌對(duì)葡萄酒品質(zhì)和風(fēng)格起著重要作用。由于釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）酒精轉(zhuǎn)化率高、發(fā)酵完全等優(yōu)點(diǎn)，在葡萄酒行業(yè)中被開發(fā)成活性干粉制劑廣泛使用[1]。然而，在葡萄酒釀造中，用單一商業(yè)S.cerevisiae菌劑進(jìn)行發(fā)酵，雖可確保酒精發(fā)酵（alcoholic fermentation，AF）的順利進(jìn)行和完成，但會(huì)導(dǎo)致發(fā)酵過(guò)程中酵母菌群多樣性下降，酵母代謝產(chǎn)生的化學(xué)反應(yīng)復(fù)雜度降低，使葡萄酒質(zhì)量風(fēng)味趨近，產(chǎn)品風(fēng)格特色不突出[2]。近幾年，大量的研究已經(jīng)證實(shí)，在葡萄酒AF前期，一些非S.cerevisiae的菌種參與發(fā)酵會(huì)增加葡萄酒感官特征的復(fù)雜性[3-4]。畢赤酵母（Pichia）是葡萄酒自然發(fā)酵過(guò)程中普遍存在的酵母菌種，也是重要的產(chǎn)酯酵母之一，對(duì)葡萄酒香氣成分的多樣性做出了重要貢獻(xiàn)[5-6]。

季也蒙畢赤酵母（Meyerozyma guilliermondii）由于其獨(dú)特的代謝活動(dòng)，在各種代謝產(chǎn)物的合成、功能蛋白的生產(chǎn)和生物防治方面表現(xiàn)出了巨大潛力[7-9]；M.guilliermondii與一些化學(xué)物質(zhì)結(jié)合可以提高對(duì)霉菌的抑制作用[10]；此外，Benito等[11]的研究發(fā)現(xiàn)，M.guilliermondii發(fā)酵能夠增加吡喃花色苷類物質(zhì)的形成，這些物質(zhì)具有增強(qiáng)干紅葡萄酒顏色穩(wěn)定性的作用。也有研究表明，M.guilliermondii能分泌多種胞外水解酶，如菊粉酶、α-淀粉酶、α-鼠李糖苷酶和脂肪酶[7]；Aplin等[12]通過(guò)順序接種M.guilliermondii（P40D002）可降低葡萄酒的乙醇含量，并產(chǎn)生高濃度的乙酸乙酯等香氣物質(zhì)。Yan Wei等[13]也報(bào)道了M.guilliermondii能夠產(chǎn)生高濃度2-苯乙醇，對(duì)增強(qiáng)玫瑰香氣具有積極影響。本實(shí)驗(yàn)室前期工作中優(yōu)選出1 株高產(chǎn)β-葡萄糖苷酶的M.guilliermondii菌株NM218，該酶的產(chǎn)生與菌株細(xì)胞生長(zhǎng)同步進(jìn)行，通過(guò)釀酒學(xué)特性研究也證實(shí)該菌株具有較高的葡萄酒環(huán)境耐受性和低酸條件下的高酶活力性質(zhì)[14]，與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵，可以增加酯類和萜烯類等揮發(fā)性物質(zhì)，增強(qiáng)葡萄酒香氣的復(fù)雜性[15]，在霞多麗干白葡萄酒陳釀過(guò)程中添加M.guilliermondii的β-葡萄糖苷酶制劑可增加萜烯類、C13-降異戊二烯類、高級(jí)醇類、酯類、脂肪酸類物質(zhì)，豐富了葡萄酒的香氣復(fù)雜性[16]。

目前關(guān)于非S.cerevisiae與S.cerevisiae混菌發(fā)酵的研究大部分是在實(shí)驗(yàn)室微釀條件下的結(jié)果，中試規(guī)模下的應(yīng)用研究鮮有報(bào)道，而中試實(shí)驗(yàn)是將實(shí)驗(yàn)室成果與產(chǎn)業(yè)化應(yīng)用連接的重要橋梁。因此，本研究目的是將NM218與商業(yè)S.cerevisiae以順序接種的模式進(jìn)行中試發(fā)酵，并對(duì)發(fā)酵過(guò)程中酵母生長(zhǎng)狀況、葡萄酒釀酒學(xué)特性和感官特征進(jìn)行分析，以期明晰M.guilliermondii的應(yīng)用潛力，為M.guilliermondii的工業(yè)化應(yīng)用提供一定數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌劑與原料

菌株NM218由甘肅省葡萄與葡萄酒工程學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室篩選于自然發(fā)酵的葡萄醪中，并經(jīng)過(guò)26S rDNA D1/D2測(cè)序，確定其為M.guilliermondii（序列相似度99.51%），現(xiàn)保藏于中國(guó)普通微生物菌種保藏管理中心（CGMCC NO：23155）；菌株NM218活性干粉菌劑由本實(shí)驗(yàn)室參考張馨文等[17]的方法經(jīng)過(guò)高密度培養(yǎng)，添加復(fù)合凍干保護(hù)劑等方法制備于冰箱冷藏備用。商業(yè)S.cerevisiae活性干粉制劑FX10、商業(yè)乳酸菌活性干粉制劑（Oenococcus oeni）Lactoenos 450 Preac購(gòu)自法國(guó)Laffort公司。

2021年10月采摘于寧夏博納伯馥酒莊的赤霞珠（Cabrnet Sauvignon），糖質(zhì)量濃度250 g/L（以還原糖計(jì)），可滴定酸6.45 g/L（以酒石酸計(jì)），pH 3.89。

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

WL（Wallerstein Laboratory）營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基北京奧博星生物技術(shù)有限公司。

氯化鈉（分析純，99%）、無(wú)水乙醇（分析純） 天津市光復(fù)科技有限公司；果膠酶（食品級(jí)） 法國(guó)Laffort公司；2-辛醇（色譜純，99%）等標(biāo)準(zhǔn)品 Sigma-Aldrich（上海）貿(mào)易有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

TU-1080紫外-可見分光光度計(jì) 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；WINESCAN S20 FLEX多功能葡萄酒分析儀 福斯華（北京）科貿(mào)有限公司；H2050R高速冷凍離心機(jī) 長(zhǎng)沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 發(fā)酵中試實(shí)驗(yàn)

赤霞珠葡萄果實(shí)在分揀臺(tái)人工摘除爛果及二次果等，送入除梗破碎機(jī)除梗破碎后按70%的量輸入2 t不銹鋼控溫罐，加入40 mg/L果膠酶，分次加入SO2至質(zhì)量濃度達(dá)到50 mg/L，打循環(huán)至均勻后在低溫（10 ℃）下浸漬24 h，隨后恢復(fù)室溫后進(jìn)行酵母接種發(fā)酵，實(shí)驗(yàn)如下：

供試酵母活性干粉均采用200 mg/L的接種量進(jìn)行，先溫水活化后接種于50 L葡萄醪中擴(kuò)培24 h后進(jìn)行接種實(shí)驗(yàn)。以先接種NM218，48 h后再接種FX10為處理組；只接種FX10為對(duì)照組，25～27 ℃控溫發(fā)酵。參考馮丹萍等[18]的方法，當(dāng)相對(duì)密度在1.058左右時(shí)視為發(fā)酵中期，相對(duì)密度在1.015左右視為發(fā)酵末期，相對(duì)密度降至0.993～0.996時(shí)視為AF結(jié)束。發(fā)酵期間，分別在接種NM218后12 、48 h、發(fā)酵中期、發(fā)酵末期取樣監(jiān)測(cè)酵母生長(zhǎng)狀況。AF結(jié)束后酒樣轉(zhuǎn)罐分離，加入1 g/t的乳酸菌干粉活化液?jiǎn)?dòng)蘋果酸-乳酸發(fā)酵，18～20 ℃控溫發(fā)酵，蘋果酸-乳酸發(fā)酵結(jié)束后酒樣轉(zhuǎn)罐分離，在15 ℃條件下陳釀貯藏。其中，AF結(jié)束與陳釀5 個(gè)月（5M）分別進(jìn)行取樣，對(duì)照組酒樣分別記為AF-CK和5M-CK；處理組酒樣分別記為AF-NM和5M-NM；每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3 次。

1.3.2 酵母生長(zhǎng)動(dòng)態(tài)監(jiān)測(cè)

參考本實(shí)驗(yàn)室Gao Pingping等[15]的方法，采用平板計(jì)數(shù)法。酒樣梯度稀釋后涂布在WL培養(yǎng)基上，28 ℃培養(yǎng)72 h后進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。根據(jù)M.guilliermondii在WL培養(yǎng)基上菌落特征為圓形乳白色而S.cerevisiae為白色帶淺綠色，中間凸起的形態(tài)差異分別進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。

1.3.3 常規(guī)理化指標(biāo)測(cè)定

利用多功能葡萄酒分析儀，測(cè)定乙醇、總酸、揮發(fā)酸、殘?zhí)?、甘油等?/p>

多功能葡萄酒分析儀條件：用25% H3PO4溶液調(diào)零液；酒樣進(jìn)液量為30 mL；樣品溫度25 ℃；XY自動(dòng)進(jìn)樣系統(tǒng)分析時(shí)間持續(xù)30 s。

1.3.4 顏色指標(biāo)測(cè)定

1.3.4.1 CIELab顏色參數(shù)測(cè)定

參照SN/T 4675.25—2016《出口葡萄酒顏色的測(cè)定CIE 1976（L*a*b*）色空間法》[19]進(jìn)行測(cè)定。檢測(cè)條件：酒樣經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾，2 mm光程石英比色皿，用紫外-分光光度計(jì)連續(xù)掃描380～780 nm譜段，間隔5 nm，每酒樣重復(fù)3 次，蒸餾水為空白。將380～780 nm波長(zhǎng)處吸光度矯正到1 cm光程后，CIELab顏色參數(shù)計(jì)算如下：

式中：X、Y和Z為樣品三刺激值；X0、Y0和Z0為D65標(biāo)準(zhǔn)白光三刺激值，取值為94.825、100.00、107.381。

1.3.4.2 總花色苷含量測(cè)定

參考蘭圓圓等[20]的方法，計(jì)算如式（6）所示：

總花色苷質(zhì)量濃度/（mg/L）=（A1-A2）×875 （6）

式中：A1、A2分別為用HCl溶液、NaHSO3溶液處理的酒樣在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.4.3 單體花色苷比例、離子化指數(shù)測(cè)定

參考趙宇等[21]的方法，計(jì)算如式（7）、（8）所示：

式中：A1、A2、A3分別為未經(jīng)過(guò)處理、SO2溶液處理、乙醛溶液處理的酒樣在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

式中：A1、A2、A3、A4分別為未加NaHSO3溶液酒樣、加入NaHSO3溶液酒樣、未加HCl溶液酒樣、加入HCl溶液酒樣在520 nm波長(zhǎng)處的吸光度。

1.3.5 揮發(fā)性香氣化合物測(cè)定

參考Gao Pingping等[15]的方法，采用頂空固相微萃取-氣相色譜-質(zhì)譜（headspace-solid phase microextractiongas chromatography-mass spectrometry，HS-SPME-GCMS）聯(lián)用儀進(jìn)行測(cè)定。

SPME條件：取8 mL酒樣于裝有2.5 g NaCl、10 μL內(nèi)標(biāo)物2-辛醇（820.7 mg/L）的頂空瓶中，加磁力攪拌轉(zhuǎn)子密封，置于磁力攪拌器上，40 ℃水浴平衡30 min后頂空萃取30 min。

GC-MS條件：TG-WAX色譜柱（60 m×0.25 mm，0.5 μm）；升溫程序?yàn)?0 ℃保持5 min，以3.5 ℃/min升至180 ℃，保持15 min；載氣（He）流速1 mL/min；不分流進(jìn)樣；電子電離源；電子能量70 eV；進(jìn)樣口溫度240 ℃、傳輸線溫度180 ℃、離子源溫度250 ℃；質(zhì)量掃描范圍m/z50～350。

定性定量分析：GC-MS分析所得的樣品質(zhì)譜圖經(jīng)計(jì)算機(jī)在NIST、Wiley數(shù)據(jù)庫(kù)檢索比對(duì)，結(jié)合譜圖分析進(jìn)行定性。各成分的含量以2-辛醇為內(nèi)標(biāo)物進(jìn)行半定量分析。香氣物質(zhì)含量和氣味活性值（odor activity value，OAV）按式（9）、（10）計(jì)算：

式中：X為香氣物質(zhì)質(zhì)量濃度/（μg/L）；A1為測(cè)得香氣物質(zhì)的峰面積；f為內(nèi)標(biāo)物校正因子，f=1；C為內(nèi)標(biāo)物質(zhì)量濃度/（μg/L）；A為內(nèi)標(biāo)物峰面積。

1.3.6 感官評(píng)價(jià)

參考趙美等[22]的方法，略作修改，品評(píng)小組由10 位葡萄酒專業(yè)人員組成，使用10 分結(jié)構(gòu)化數(shù)值尺度量化，分別從外觀（色澤、澄清度）、香氣（花香、果香、異味）、口感（酸度、酸甜平衡感、余味）和整體評(píng)分這4 個(gè)方面對(duì)各酒樣進(jìn)行品評(píng)。感官評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見表1。

1.4 數(shù)據(jù)處理

通過(guò)Microsoft Office Excel 2019進(jìn)行數(shù)據(jù)整理和統(tǒng)計(jì)；利用IBM SPSS Statistics 26軟件對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析；應(yīng)用Origin 2021軟件繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 AF過(guò)程中的相對(duì)密度變化

采取比重法對(duì)發(fā)酵進(jìn)程進(jìn)行監(jiān)測(cè)，發(fā)酵溫度控制在25～27 ℃左右，發(fā)酵進(jìn)程見圖1，對(duì)照組在發(fā)酵第1～6天時(shí)相對(duì)密度下降最快，說(shuō)明這一階段發(fā)酵速率較高；第7天相對(duì)密度下降趨勢(shì)減緩，發(fā)酵速率開始減緩，直至第18天發(fā)酵結(jié)束。處理組在1～7 d發(fā)酵速度較快，隨后發(fā)酵減緩，與對(duì)照組相比，發(fā)酵時(shí)間延長(zhǎng)了2～3 d。

圖1 AF過(guò)程中相對(duì)密度變化Fig.1 Changes in specific gravity during alcoholic fermentation

2.2 發(fā)酵過(guò)程酵母生物量分析

由表2可知，對(duì)照組中S.cerevisiae在整個(gè)AF過(guò)程中生物量呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，在發(fā)酵中期以前始終保持107CFU/mL數(shù)量級(jí)。處理組中，S.cerevisiae、M.guilliermondii生物量同樣呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢(shì)，其中，M.guilliermondii生物量在接種48 h后達(dá)到最大（8×107CFU/mL），至發(fā)酵中期時(shí)，S.cerevisiae的生物量（107CFU/mL）已遠(yuǎn)大于M.guilliermondii（105CFU/mL），發(fā)酵末期未檢測(cè)到M.g u i l l i e r m o n d i i的存在，而S.cerevisiae的生物量保持在105CFU/mL水平。

表2 兩種接種方式下不同發(fā)酵時(shí)期酵母生物量Table 2 Yeast biomass during different fermentation periods under two inoculation modes 107 CFU/mL

2.3 常規(guī)理化指標(biāo)分析

由表3可知，供試酒樣基本理化指標(biāo)均符合GB/T 15037—2006《葡萄酒》的要求。兩款酒樣殘?zhí)琴|(zhì)量濃度均低于4 g/L，表明酒樣均能徹底發(fā)酵；乙醇體積分?jǐn)?shù)范圍為13.95%～14.44%，處理組乙醇含量顯著低于對(duì)照組，說(shuō)明M.guilliermondii的參與能夠降低乙醇體積分?jǐn)?shù)；酒樣中揮發(fā)酸質(zhì)量濃度均不高于0.78 g/L，說(shuō)明酒樣發(fā)酵過(guò)程無(wú)異常情況；AF-NM與5M-NM處理組酒樣總酸含量均低于對(duì)照組酒樣，但差異不顯著，隨著陳釀的進(jìn)行，5M-CK與5M-NM酒樣總酸含量均顯著降低；AF-NM與5M-NM處理組酒樣甘油含量均顯著低于對(duì)照酒樣，說(shuō)明M.guilliermondii并不是高產(chǎn)甘油的非S.cerevisiae。

表3 AF結(jié)束與陳釀5 個(gè)月后基本理化指標(biāo)Table 3 Basic physicochemical indexes of wines at the end of alcoholic fermentation and after aging for five months

2.4 顏色指標(biāo)分析

由表4可以看出，基于CIELab顏色空間的5 個(gè)參數(shù)數(shù)據(jù)結(jié)果均表現(xiàn)為處理組酒樣顯著高于同一時(shí)期對(duì)照組酒樣。L*代表酒樣的明暗程度，L*越大，酒樣顏色越亮。AF結(jié)束時(shí)，AF-NM酒樣的L*值顯著高于AF-CK酒樣211.47%，陳釀5 個(gè)月后依然高于對(duì)照酒樣180.80%；雖然陳釀5 個(gè)月后各酒樣L*值均呈上升趨勢(shì)，但5M-CK酒樣比AF-CK的L*值僅增高了24.33%，而5M-NM酒樣比AF-NM的L*值增高了37.91%，說(shuō)明菌株NM218的參與發(fā)酵對(duì)顏色明亮度影響顯著。a*值代表酒樣紅綠色程度，a*值越高說(shuō)明酒體顏色中紅色分量越大，可以看出，AF結(jié)束時(shí)和陳釀5 個(gè)月后，處理組酒樣比同一時(shí)期對(duì)照酒樣的a*值分別增加了42.35%、47.01%，說(shuō)明菌株NM218參與發(fā)酵可能能夠增強(qiáng)某種紅色成分的物質(zhì)。b*值代表酒樣黃藍(lán)色程度，b*值越高說(shuō)明酒體顏色中黃色分量越大，通常干紅葡萄酒陳釀時(shí)間越長(zhǎng)，b*值也逐漸增高，而本實(shí)驗(yàn)中，AF結(jié)束時(shí)和陳釀5 個(gè)月后，處理組酒樣比同一時(shí)期對(duì)照酒樣的b*值分別增加了174.53%、205.68%，說(shuō)明菌株NM218在AF過(guò)程即顯著增加了酒體黃色成分的分量。由此也相應(yīng)地使處理組酒樣的C*ab值（色彩飽和度）和h*ab（色調(diào)）增高。色差（ΔE*ab）與L*、a*和b*值貢獻(xiàn)程度有關(guān)，表征酒樣間總體差異程度。以AF-CK為參比酒樣，5M-CK表現(xiàn)為ΔE*ab大于4，AF-NM與5M-NM均表現(xiàn)為ΔE*ab大于22，說(shuō)明菌株NM218參與發(fā)酵對(duì)色差影響顯著。AF結(jié)束時(shí)，處理組AF-NM總花色苷含量和單體花色苷比例顯著低于對(duì)照（AFCK）酒樣，尤其總花色苷含量降低了49.08%。陳釀5 個(gè)月后，各酒樣總花色苷含量也都略有下降，在5 個(gè)月的陳釀過(guò)程中，5M-NM較AF-NM降低了1.80%，這個(gè)降低幅度與對(duì)照酒樣即5M-CK較AF-CK的降低幅度差異不大，說(shuō)明菌株NM218在AF過(guò)程中能夠顯著降低花色苷含量。離子化指數(shù)反映葡萄酒中對(duì)顏色起貢獻(xiàn)的花色苷比例[21]，從表4可以看出，處理組酒樣的離子化指數(shù)均顯著高于同一時(shí)期對(duì)照酒樣，數(shù)據(jù)結(jié)果與L*值、b*值相對(duì)應(yīng)，說(shuō)明菌株NM218顯著增加了酒中對(duì)顏色起貢獻(xiàn)的花色苷比例。

表4 酒樣相關(guān)顏色指標(biāo)Table 4 Color parameters of wine samples

2.5 香氣化合物分析

葡萄酒的風(fēng)味是由不同揮發(fā)性香氣化合物共同作用的結(jié)果。實(shí)驗(yàn)通過(guò)HS-SPME-GC-MS法分析酒樣香氣物質(zhì)，共檢測(cè)出64 種揮發(fā)性香氣化合物，包括醇類18 種、酯類31 種、萜烯類7 種、酸類2 種、醛酮及其他類6 種，各個(gè)酒樣的揮發(fā)性化合物種類及含量均有差異（圖2、表5）。

圖2 不同香氣物質(zhì)種類含量Fig.2 Contents of different classes of aroma substances in wine samples

表5 香氣化合物成分分析Table 5 Composition of aroma compounds in wine samples

高級(jí)醇類物質(zhì)是酵母氨基酸代謝的次級(jí)產(chǎn)物之一，是葡萄酒中的主要香氣物質(zhì)，高級(jí)醇低于300 mg/L時(shí)可以增加葡萄酒香氣的復(fù)雜性，賦予葡萄酒怡人的花香和水果香，但當(dāng)高于400 mg/L時(shí)會(huì)給葡萄酒帶來(lái)刺鼻的氣味[23]。適量的醇類物質(zhì)可使葡萄酒的香氣更為復(fù)雜、濃郁，如2,3-丁二醇具有橡膠、奶油、水果味；正辛醇賦予葡萄酒茉莉、檸檬、柑橘等多種風(fēng)味。這些醇類物質(zhì)對(duì)葡萄酒整體感官質(zhì)量有一定的優(yōu)化作用[24]。兩款酒樣共檢測(cè)出18 種醇類物質(zhì)，總質(zhì)量濃度為16 444.37（AF-NM）～23 056.98 μg/L（5M-CK），均低于3 0 0 m g/L。異戊醇（＞4 7.4 7%）和2-苯乙醇（＞47.39%）在醇類物質(zhì)中占比最大，OAV均大于1，賦予葡萄酒香蕉、蜂蜜、玫瑰、丁香花等氣味。

酯類物質(zhì)是葡萄酒香氣中的重要組成部分，主要在葡萄酒發(fā)酵和陳釀過(guò)程中產(chǎn)生，可以賦予葡萄酒愉悅的花香和果香，對(duì)葡萄酒香氣的形成起著至關(guān)重要的作用[23]。兩款酒樣共檢測(cè)出31 種酯類物質(zhì)，酯類物質(zhì)的總質(zhì)量濃度為11 244.49（AF-CK）～15 224.347 μg/L（5M-NM）。辛酸乙酯在酯類物質(zhì)中占比最大，其次為丁二酸二乙酯、己酸乙酯和癸酸乙酯等。AF-NM酒樣中，丁酸乙酯（97%）、乙酸異戊酯（123%）、己酸乙酯（59%）、庚酸乙酯（621%）、辛酸甲酯（43%）、辛酸乙酯（37%）、己酸異戊酯（77%）、反-4-癸烯酸乙酯（238%）、乙酸苯乙酯（61%）和3-苯丙酸乙酯（140%）含量均顯著高于AF-CK。5M-NM中辛酸乙酯（35.45%）、乙酸異戊酯（10%）、庚酸乙酯（151%）、丁二酸二乙酯（63%）、反-4-癸烯酸乙酯（351%）和肉豆蔻酸乙酯（83%）含量均高于5M-CK。值得注意的是，丁酸異戊酯和辛酸異戊酯僅在處理組中檢出。

脂肪酸是酵母在脂肪酸代謝過(guò)程中形成的，當(dāng)接近其閾值時(shí)，葡萄酒會(huì)產(chǎn)生果味、奶酪味、黃油味。但濃度過(guò)高會(huì)使葡萄酒具有“汗味”、“脂肪味”、“腐臭味”等不良風(fēng)味[25]。實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出正己酸、辛酸兩種脂肪酸，其中，對(duì)照組與處理組酒樣經(jīng)陳釀后總酸均顯著高于AF結(jié)束的酒樣。值得注意的是，辛酸只在對(duì)照組中檢出。

萜烯類物質(zhì)閾值較低，賦予葡萄酒濃郁的香氣。實(shí)驗(yàn)共檢測(cè)出芳樟醇、香茅醇、橙花醇、反式-橙花叔醇、大馬士酮、香葉基丙酮、α-萜品醇7 種萜烯類物質(zhì)。其中，5M-CK較AF-CK、5M-NM較AF-NM大馬士酮含量顯著增加，分別增加了120%、171.43%。處理組與對(duì)照組在同一時(shí)期萜烯類物質(zhì)總含量沒有顯著性差異，但經(jīng)陳釀后分別增加了170.14%、115.01%。還檢測(cè)到6 種酮醛及其他類化合物，總質(zhì)量濃度為290.83～577.48 μg/L，包括醇酮類5 種、其他類化合物1 種，盡管這些物質(zhì)含量較低，但對(duì)酒體香氣復(fù)雜性有一定的積極貢獻(xiàn)。

2.6 主要香氣化合物的熱圖分析

OAV為香氣物質(zhì)的含量與氣味閾值的比值，是評(píng)價(jià)單一香氣化合物對(duì)葡萄酒整體香氣貢獻(xiàn)程度的指標(biāo)[26]。為確定供試酒樣的香氣差異，對(duì)OAV＞0.1的香氣物質(zhì)進(jìn)行熱圖聚類分析。由圖3可知，AF-CK酒樣中芳樟醇、月桂酸乙酯、辛酸甲酯、1-壬醇等含量較高，賦予葡萄酒濃郁的菠蘿、梨、柑橘等香氣；AF-NM酒樣中月桂酸乙酯、乙酸苯乙酯、辛酸甲酯、己酸乙酯等香氣物質(zhì)含量較高，賦予葡萄酒復(fù)雜濃郁的香蕉、草莓、蘋果、柑橘等水果香；5M-CK酒樣中大馬士酮、壬醛、3-甲基丁酸乙酯、2-苯乙醇、癸酸乙酯等香氣物質(zhì)含量較高，能夠?yàn)槠咸丫茙?lái)復(fù)雜濃郁的玫瑰、橙子、黑莓、香蕉、丁香花等氣味；5M-NM酒樣中大馬士酮、乙酸苯乙酯、香茅醇、2-甲基丁酸乙酯、2-甲基丙酸乙酯、正辛醇等香氣物質(zhì)含量較高，能夠?yàn)槠咸丫茙?lái)濃郁的玫瑰、青檸檬、蘋果等香氣。熱圖分析表明，NM-218與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵能夠增加部分酯類、萜烯類物質(zhì)的含量，提升赤霞珠干紅葡萄酒中的花香、果香，提高香氣復(fù)雜性。

圖3 酒樣主要香氣成分熱圖Fig.3 Heatmap of the major aroma compounds of wine samples

2.7 感官分析

為更好地評(píng)估供試菌株對(duì)葡萄酒感官質(zhì)量的影響，進(jìn)行感官評(píng)價(jià)（圖4）。外觀方面，處理組酒樣與對(duì)照組酒樣在AF結(jié)束、陳釀5 個(gè)月均呈紫紅色，但處理組酒樣較同一時(shí)期對(duì)照組酒樣紫紅色較淺；香氣方面，AF結(jié)束與陳釀5 個(gè)月酒樣均無(wú)明顯異味，處理組酒樣花香、果香顯著優(yōu)于對(duì)照組；口感方面，處理組酒樣AF結(jié)束時(shí)酸度較低、余味較強(qiáng)，經(jīng)陳釀后處理組余味、酸甜平衡感較強(qiáng)；處理組酒樣在陳釀5 個(gè)月后整體評(píng)分方面也獲得了較高的分?jǐn)?shù)，酒樣酒體協(xié)調(diào)、香氣濃郁。

圖4 感官分析雷達(dá)圖Fig.4 Radar plot of sensory analysis

3 討 論

近年來(lái)，消費(fèi)市場(chǎng)對(duì)不同類型和風(fēng)格葡萄酒的需求不斷增長(zhǎng)，而S.cerevisiae與本土非S.cerevisiae混合發(fā)酵作為一種調(diào)控葡萄酒香氣特性的新工藝，成為了研究和應(yīng)用的熱點(diǎn)之一。NM218菌株是本實(shí)驗(yàn)室優(yōu)選出的1 株本土菌株，前期研究表明[14]，菌株NM218能夠在350 g/L葡萄糖、250 mg/L SO2、pH 2.5和9%乙醇條件下表現(xiàn)出較好的耐受性，在反應(yīng)溫度40 ℃、pH 4.0條件下，β-葡萄糖苷酶活力可達(dá)49.5 mU/mL，具有應(yīng)用于混菌發(fā)酵的潛力。Gao Pingping等[15]結(jié)果表明，NM218菌株與S.cerevisiae順序接種于葡萄醪液中，48 h后M.guilliermondii生物量達(dá)到106～107CFU/mL，能夠改善葡萄酒的風(fēng)味特征。因此，為保證實(shí)驗(yàn)中NM218在葡萄酒發(fā)酵過(guò)程具有較高的生物量與β-葡萄糖苷酶活力，NM218以48 h后接種S.cerevisiae的接種策略進(jìn)行混菌發(fā)酵。

色澤是評(píng)價(jià)葡萄酒風(fēng)味質(zhì)量的重要指標(biāo)，而花色苷是其顏色的物質(zhì)基礎(chǔ)，對(duì)紅葡萄酒顏色起決定作用[27]。Han Fuliang等[28]采用主成分回歸分析法研究了赤霞珠葡萄酒中花色苷與顏色的關(guān)系，發(fā)現(xiàn)參與分析的花色苷可以解釋葡萄酒紅色的64.56%～81.57%。本研究中，處理組AF-NM酒樣總花色苷質(zhì)量濃度（291.08 mg/L）顯著低于對(duì)照組AF-CK酒樣（571.67 mg/L），這可能歸因于M.guilliermondiiNM218高β-葡萄糖苷酶活力[29]。然而，AF-NM酒樣的a*值（45.61）卻高于AF-CK（32.04），AF-NM酒樣離子化指數(shù)與AF-CK酒樣相比顯著增高，說(shuō)明處理組酒樣對(duì)顏色起貢獻(xiàn)的花色苷比例較高，所以處理組a*值高于對(duì)照組的原因可能是M.guilliermondii能夠使酒樣中產(chǎn)生對(duì)紅色分量貢獻(xiàn)較大的花色苷類物質(zhì)，從而導(dǎo)致a*值較高，具體原因尚不清楚，這一點(diǎn)后期還需繼續(xù)研究以明確酒樣中不同成分對(duì)顏色的影響。本研究AF-NM酒樣b*值（24.90）顯著高于AF-CK（9.07），陳釀5 個(gè)月后趨勢(shì)不變。這一結(jié)果可能與吡喃類花色苷的含量有關(guān)，Benito等[11]研究表明，M.guilliermondii發(fā)酵能夠增加吡喃花色苷類物質(zhì)的形成，而吡喃類花色苷對(duì)橘黃色貢獻(xiàn)較大[25]。從顏色參數(shù)可以看出，處理組酒樣陳釀5 個(gè)月的花色苷總量低于對(duì)照組，紅色指標(biāo)和黃色都明顯增加，這一結(jié)果還需繼續(xù)在陳釀期進(jìn)行跟蹤檢測(cè)以探明原因。同時(shí)也說(shuō)明，針對(duì)高β-葡萄糖苷酶活力的M.guilliermondii菌種在干紅葡萄酒的應(yīng)用中，可以考慮適當(dāng)延長(zhǎng)浸漬時(shí)間，讓花色苷等呈色物質(zhì)更好的浸入葡萄酒[30]；其次，也可以考慮針對(duì)桃紅葡萄酒或干白葡萄酒的釀造進(jìn)行應(yīng)用研究。

香氣是葡萄酒感官評(píng)價(jià)的重要指標(biāo)，也是影響葡萄酒感官質(zhì)量的重要因素。陳譽(yù)文等[5]研究表明，畢赤酵母屬與S.cerevisiae混合發(fā)酵可以有效提高冰酒的香氣復(fù)雜性和豐富度，可釀造出具有本土特色的優(yōu)質(zhì)葡萄酒。本研究中，NM218與S.cerevisiae順序接種發(fā)酵能夠增加乙酸異戊酯、辛酸異戊酯、丁酸乙酯、己酸乙酯、香茅醇等部分酯類、萜烯類物質(zhì)的含量，提升赤霞珠干紅葡萄酒中的花香、果香，提高香氣復(fù)雜性，這與Gao Pingping等[15]研究結(jié)果一致。值得注意的是，丁酸異戊酯與辛酸異戊酯僅在處理組中檢出，這可能與NM218菌株的某種釀酒特性有關(guān)，具體機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。

4 結(jié) 論

本土M.guilliermondii菌株NM218與商業(yè)S.cerevisiaeFX10以間隔48 h順序接種進(jìn)行赤霞珠干紅葡萄酒中試釀造，在AF過(guò)程中，M.guilliermondii細(xì)胞活菌數(shù)在AF中期逐漸降低為105CFU/mL，到發(fā)酵末期完全消亡，而S.cerevisiae自接種后到發(fā)酵末期一直存在于發(fā)酵體系；所得酒樣基本理化指標(biāo)均符合GB/T 15037—2006的要求；順序接種能提高酒體CIELab顏色參數(shù)、離子化指數(shù)，降低總花色苷含量與單體花色苷比例，使酒樣顏色亮度、紅色色調(diào)、黃色色調(diào)與色彩飽和性與對(duì)照酒樣存在顯著差異；此外，順序接種發(fā)酵能夠增加酒樣中丁酸乙酯、乙酸異戊酯、己酸乙酯、辛酸甲酯、辛酸乙酯、乙酸苯乙酯、香茅醇等酯類、萜烯類物質(zhì)的含量，且有2 種獨(dú)有香氣，賦予赤霞珠干紅葡萄酒濃郁的花香、果香，提高香氣復(fù)雜性，在一定程度可以提升葡萄酒的感官品質(zhì)。綜上結(jié)果表明，NM218與FX10順序接種發(fā)酵可以增強(qiáng)干紅葡萄酒香氣品質(zhì)和感官愉悅感。