吳占文，王 帥，康 婕，李 濤，李紅娜，蔡 杰，張 昊，楊艷歌,*，袁 飛,*

（1.中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院，國(guó)家市場(chǎng)監(jiān)管重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室（食品質(zhì)量與安全），北京 100176；2.黑龍江八一農(nóng)墾大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院，黑龍江 大慶 163000；3.陜西省產(chǎn)品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)研究院，陜西 西安 710048）

以食物和水作為傳播基質(zhì)的諾如病毒（norovirus，NoV）是世界范圍內(nèi)導(dǎo)致急性胃腸炎爆發(fā)及散發(fā)的主要病原體[1]。這是由于NoV具有極強(qiáng)的感染性，1 個(gè)NoV顆粒引發(fā)的感染率可達(dá)50%，通常只要10 個(gè)病毒顆粒就可以使人致病，超過(guò)了已報(bào)道的任何一種食源性病毒[2-5]。據(jù)世界衛(wèi)生組織（World Health Organization，WHO）報(bào)道，NoV每年可造成6.85億腹瀉病例，21.25萬(wàn) 人死亡[6-9]，其中99%發(fā)生于發(fā)展中國(guó)家[10-12]。由于WHO已開(kāi)展大規(guī)模輪狀病毒疫苗接種，使NoV成為了當(dāng)前兒童急性胃腸炎的主要病因[13-14]。例如秘魯?shù)囊豁?xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)?shù)?6%的嬰兒成長(zhǎng)至2 歲時(shí)，都會(huì)經(jīng)歷5 次以上的NoV感染[15]，這無(wú)疑為當(dāng)?shù)厥称钒踩珯z測(cè)行業(yè)敲響了警鐘。近幾年我國(guó)兒童急性胃腸炎病例爆發(fā)的頻率不斷增加[16-17]，NoV的防治也變得尤為重要。但遺憾的是，目前仍未研發(fā)出有效的NoV疫苗[18]。因此，如何快速檢測(cè)食物與飲用水中的NoV，并由此阻斷NoV的傳播，仍然是研究人員不斷探索的問(wèn)題。

NoV傳播與食品污染密切相關(guān)，尤其是海洋中的貝類生物，海產(chǎn)貝類因其底棲和濾食性特性，可在海洋環(huán)境中不斷對(duì)NoV進(jìn)行富集[19-20]。有研究表明，以牡蠣為代表的貝類生物體內(nèi)存在著與NoV結(jié)合的特定受體[21]，這使NoV一旦進(jìn)入其體內(nèi)，很難通過(guò)自身代謝與凈化作用排出體外，導(dǎo)致一些貝類生物體內(nèi)的病毒濃度比周圍環(huán)境高幾十甚至幾千倍[22-23]。而人們有時(shí)會(huì)直接生食貝類生物，這無(wú)疑大大增加了NoV感染的風(fēng)險(xiǎn)[24-25]。因此，加強(qiáng)貝類生物中NoV快速檢測(cè)方法的研究，對(duì)于保障食品安全與民眾健康具有重要意義[26]。

逆轉(zhuǎn)錄-酶促重組等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)（r e v e r s e transcription-enzymatic recombinase amplification，RTERA）是近些年新研發(fā)的一種等溫核酸擴(kuò)增技術(shù)[27]，RT-ERA可以在37～42 ℃恒溫條件下，將微量RNA的特異性區(qū)段在數(shù)分鐘內(nèi)擴(kuò)增數(shù)十億倍，具有優(yōu)秀的應(yīng)用前景。與逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）相比，無(wú)論在檢測(cè)時(shí)間還是儀器限制方面都具有顯著的優(yōu)勢(shì)。而MS2噬菌體與NoV大小結(jié)構(gòu)相似，且兩者均為單鏈RNA病毒，可以作為過(guò)程控制模式病毒添加到貝類生物樣品中[28]?；诖耍狙芯恳訫S2噬菌體作為過(guò)程控制病毒，建立NoV雙重?zé)晒釸T-ERA快速檢測(cè)方法，并實(shí)現(xiàn)了對(duì)MS2、GI和GII NoV RNA的便攜式、可視化、無(wú)熱循環(huán)的快速檢測(cè)，檢測(cè)時(shí)間僅需10 min，靈敏度可達(dá)102個(gè)拷貝，方案詳見(jiàn)圖1（使用Figdraw繪制）。

圖1 NoV檢測(cè)方案Fig.1 Scheme of NoV detection

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

MS2噬菌體標(biāo)準(zhǔn)樣品由中國(guó)食品藥品檢定研究院惠贈(zèng)，GI和GII諾如病毒糞便樣本由中國(guó)檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院衛(wèi)生檢驗(yàn)與檢疫研究所提供，輪狀病毒與甲型肝炎病毒RNA樣品由中國(guó)海關(guān)科學(xué)技術(shù)研究中心惠贈(zèng)。貝類市售樣品采集于北京、天津、遼寧大連水產(chǎn)市場(chǎng)。

RT-熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法） 蘇州先達(dá)基因科技有限公司；HiScriptII One Step qRT-PCR Probe Kit、T7 High Yield RNA Transcription Kit、FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2 諾唯贊生物科技有限公司；MS2過(guò)程控制試劑盒（RT-PCR探針?lè)?50 ℃）美正生物科技有限公司；PureLink? RNA Mini Kit、UltraPureTM無(wú)DNase/RNase蒸餾水 美國(guó)Invitrogen公司；E.Z.N.A.?Viral RNA Kit 北京冬歌博業(yè)生物科技有限公司；Qiagen RNeasy Mini Kit 凱杰企業(yè)管理（上海）有限公司；蛋白酶K 德國(guó)默克公司；NdeI/XhoI限制性內(nèi)切酶NEB（北京）有限公司；GI和GII NoV靶基因合成 北京六合華大基因科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ABI 7500實(shí)時(shí)熒光PCR儀 美國(guó)Applied Biosystems公司；Pico17離心機(jī) 美國(guó)Thermo Scientific 公司；迷你qPCR儀 上海翊輝生物科技有限公司；智能化超微量核酸檢測(cè)儀 日本島津公司；移液器、混勻儀 德國(guó)Eppendorf公司；生物安全柜 美國(guó)NuAire公司。

1.3 方法

1.3.1 RNA標(biāo)準(zhǔn)品的構(gòu)建與鑒定

分別選取GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中GI NoV——諾瓦克病毒（Norwalk virus）（GenBank: M87661.2）和GII NoV——Lordsdale病毒（GenBank: X86557.1）位于ORF1-ORF2連接區(qū)域處的基因序列，并在序列的5’端加入酶切位點(diǎn)NdeI，3’端加入酶切位點(diǎn)XhoI，委托北京六合華大基因科技有限公司進(jìn)行人工合成，并將合成片段克隆到含有T7啟動(dòng)子的pET28-a＋載體中。挑選單克隆進(jìn)行質(zhì)粒提取，采用測(cè)序的方法對(duì)陽(yáng)性質(zhì)粒進(jìn)行鑒定。將測(cè)序結(jié)果均符合預(yù)期的質(zhì)粒分別命名為pET-NoV GI與pET-NoV GII。

使用酶切的方法對(duì)質(zhì)粒進(jìn)行線性化處理，酶切體系：陽(yáng)性質(zhì)粒20 μL、XhoI 1 μL、10×NEBuffer 5 μL、焦碳酸二乙酯（diethyl pyrocarbonate，DEPC）處理過(guò)的無(wú)菌ddH2O 24 μL；酶切條件：37 ℃，15 min。產(chǎn)物采用1%膠進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳鑒定，確定質(zhì)粒是否酶切成功。用T7 High Yield RNA Transcription Kit對(duì)2 種線性質(zhì)粒樣品進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄，并對(duì)轉(zhuǎn)錄成功的RNA產(chǎn)物采用DNase處理。下一步使用FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2對(duì)RNA產(chǎn)物純化，-80 ℃冰箱貯存。

重復(fù)測(cè)定5 次病毒參考樣品的核酸濃度，取平均值，根據(jù)單鏈核糖核酸拷貝濃度計(jì)算公式，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)品pET-NoV GI與pET-NoV GII核酸拷貝濃度[29]。

1.3.2 引物探針設(shè)計(jì)與篩選

以MS2噬菌體（GenBank: JF719743.1）Replicase區(qū)域基因序列為靶序列，通過(guò)NCBI在線工具進(jìn)行序列分析和比對(duì)，根據(jù)ERA引物和探針的設(shè)計(jì)原理，在特異性區(qū)域設(shè)計(jì)MS2噬菌體特異性ERA引物和探針（表1），并進(jìn)行擴(kuò)增效率分析。并以GI和GII NoV、輪狀病毒、甲型肝炎病毒4 種病毒RNA作為陰性對(duì)照、ddH2O為空白對(duì)照進(jìn)行RT-ERA擴(kuò)增，分析其特異性，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。篩選的引物探針組合詳見(jiàn)表2，其中GI與GII NoV引物探針為實(shí)驗(yàn)室前期實(shí)驗(yàn)篩選，所有引物和探針均在北京六合華大基因科技有限公司合成。

表1 MS2噬菌體RT-ERA引物及探針Table 1 Primers and probes used for RT-ERA of MS2 phage

表2 GI、GII NoV與MS2噬菌體RT-ERA引物及探針序列Table 2 Primer and probe sequences used for RT-ERA of GI, GII NoV and MS2 phage

1.3.3 雙重?zé)晒釸T-ERA檢測(cè)體系構(gòu)建

分別將GI、GII NoV與MS2噬菌體ERA引物和探針（濃度均為10 μmol/L）等體積混合，參照RT-熒光型核酸擴(kuò)增試劑盒（ERA法）說(shuō)明書(shū)制備每份樣本的預(yù)混液（GI NoV＋MS2或GII NoV＋MS2）：溶解劑20 μL，正向引物（GI/GII NoV＋MS2）各2.1 μL，反向引物（GI/GII NoV＋MS2）各2.1 μL，熒光探針（GI/GII NoV＋MS2）各0.6 μL，RNA模板（濃度為106拷貝/μL）5 μL，DEPC處理過(guò)的無(wú)菌ddH2O 13.4 μL。取48 μL上述預(yù)混液轉(zhuǎn)移至酶粉PCR管中溶解，振蕩混勻并短暫離心。在管蓋上加入2 μL的激活劑，小心蓋好管蓋，瞬時(shí)離心使激活劑進(jìn)入預(yù)混液中，振蕩混勻并再次瞬時(shí)離心，放入迷你qPCR儀中反應(yīng)。

反應(yīng)程序?yàn)椋?2 ℃、1 s；42 ℃、20 s，40 個(gè)循環(huán)。在第2反應(yīng)階段收集FAM/HEX/ROX熒光信號(hào)，其中FAM熒光（藍(lán)色）通道檢測(cè)對(duì)象為GI NoV，HEX熒光（綠色）通道檢測(cè)對(duì)象為GII NoV，ROX熒光（橙色）通道檢測(cè)對(duì)象為MS2過(guò)程控制病毒，同時(shí)以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.4 雙重?zé)晒釸T-ERA擴(kuò)增體系優(yōu)化

1.3.4.1 引物體系優(yōu)化

將上述體系中的正反向GI NoV＋MS2或GII NoV＋MS2混合引物（濃度均為10 μmol/L）體積分別調(diào)整至2.1、3.1、4.1、5.1 μL，其他組分不變，并相應(yīng)減少ddH2O含量，使反應(yīng)體系總體積保持不變，進(jìn)行RT-ERA反應(yīng)。

1.3.4.2 探針體系優(yōu)化

采用1.3.4.1節(jié)確定的最佳引物體積，將該體系中的熒光探針（濃度均為10 μmol/L）體積分別調(diào)整至0.8、1.0、1.2、1.4、1.6、1.8 μL，其他保持組分不變，并相應(yīng)減少ddH2O含量，使反應(yīng)體系總體積保持不變，進(jìn)行RTERA反應(yīng)。

1.3.5 雙重?zé)晒釸T-ERA擴(kuò)增程序優(yōu)化

為滿足快速檢測(cè)需求，在1.3.4節(jié)確定的最佳反應(yīng)體系的基礎(chǔ)上對(duì)反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，即反應(yīng)程序第2階段控制在42 ℃條件下，擴(kuò)增程序分別調(diào)整為：15 s、40 個(gè)循環(huán)；10 s、40 個(gè)循環(huán)；5 s、40 個(gè)循環(huán)；5 s、35 個(gè)循環(huán)，分別放入迷你qPCR儀中反應(yīng)，在第2反應(yīng)階段收集FAM/HEX/ROX熒光信號(hào)，同時(shí)以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，根據(jù)熒光擴(kuò)增曲線結(jié)果確定最短反應(yīng)時(shí)間，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.6 雙重?zé)晒釸T-ERA擴(kuò)增靈敏度實(shí)驗(yàn)

將GI NoV＋MS2和GII NoV＋MS2混合RNA分別進(jìn)行10 倍梯度稀釋，使GI和GII NoV的濃度分別為106、105、104、103、102拷貝/μL，采用1.3.4節(jié)中建立的熒光型RT-ERA快速檢測(cè)程序?qū)Y選出的最佳引物探針體積進(jìn)行靈敏度分析，同時(shí)以無(wú)菌ddH2O為空白對(duì)照，每個(gè)反應(yīng)設(shè)置2 個(gè)平行，并重復(fù)實(shí)驗(yàn)3 次。

1.3.7 真實(shí)樣品中NoV RNA提取方法確定與提取效率分析

為提高貝類樣品NoV RNA的提取效果，研究比較FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit V2、PureLinkTMRNA Mini Kit、E.Z.N.A.?Viral RNA Kit、Qiagen RNeasy Mini Kit 4 種提取試劑盒對(duì)病毒RNA的提取效率。按照GB 4789.42—2016《食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 諾如病毒檢驗(yàn)》[30]的規(guī)定，可通過(guò)對(duì)MS2過(guò)程控制病毒RNA的提取效率表示NoV RNA的提取效率，將10 μL MS2過(guò)程控制病毒添加到2.0 g貝類樣品的消化腺中，計(jì)算4 種提取試劑盒對(duì)病毒RNA的提取效率。

首先采用MS2過(guò)程控制試劑盒制備MS2過(guò)程控制病毒RNA，并對(duì)所得RNA按照1∶3的比例使用標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)稀釋液進(jìn)行梯度稀釋，共稀釋5 個(gè)濃度，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR擴(kuò)增。以未稀釋和梯度稀釋的過(guò)程控制病毒的濃度為X軸（設(shè)過(guò)程控制病毒原液濃度為參照，記為1（即提取效率為100%）），以其Ct值為Y軸，繪制過(guò)程控制標(biāo)準(zhǔn)曲線。實(shí)際樣本檢測(cè)時(shí)MS2的Ct值在標(biāo)準(zhǔn)曲線上對(duì)應(yīng)的濃度為C，則MS2過(guò)程控制病毒提取效率如下：

4 種提取試劑盒提取的RNA均使用50 μL的DEPC處理過(guò)的無(wú)菌ddH2O進(jìn)行洗脫，采用智能化超微量核酸檢測(cè)儀測(cè)定濃度，-80 ℃保存?zhèn)溆?。將不同試劑盒提取的樣品RNA作為擴(kuò)增模板，參照MS2過(guò)程控制試劑盒說(shuō)明書(shū)，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光RT-qPCR擴(kuò)增，分析提取效率選出最適合貝類樣品RNA提取的試劑盒。根據(jù)GB 4789.42—2016[30]，NoV提取效率/%=經(jīng)病毒提取等步驟后的過(guò)程控制病毒RNA濃度×100，即Ct值對(duì)應(yīng)濃度×100%。

1.3.8 雙重?zé)晒釸T-ERA真實(shí)樣品檢測(cè)

真實(shí)樣本共計(jì)29 份，其中2 份含NoV的糞便樣本作為方法確證的陽(yáng)性樣本，27 份市售貝類作為方法適用性驗(yàn)證的市售樣品。貝類樣品參照GB 4789.42—2016[30]中NoV檢測(cè)方法進(jìn)行前處理，并采用1.3.7節(jié)確定的最適RNA提取的試劑盒進(jìn)行提取和提取效率分析。最后以GB 4789.42—2016為參比方法，采用本研究建立的雙重?zé)晒釸T-ERA方法與GB 4789.42—2016規(guī)定的熒光定量RT-qPCR方法[30]同時(shí)對(duì)29 份樣品進(jìn)行GI、GII NoV檢測(cè)，并對(duì)2 種方法的符合性進(jìn)行比較，確定本研究方法的適用性和可行性。

2 結(jié)果與分析

2.1 GI與GII NoV RNA參考樣品的制備

重組質(zhì)粒pET-NoV GI全長(zhǎng)5 788 bp，質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖2A。重組質(zhì)粒pET-NoV GII全長(zhǎng)5 640 bp，質(zhì)粒構(gòu)建示意圖見(jiàn)圖2B。測(cè)序結(jié)果表明人工合成片段正確克隆到pET28-a＋載體中，證實(shí)重組質(zhì)粒構(gòu)建成功。使用XhoI酶對(duì)pET-NoV GI與pET-NoV GII進(jìn)行線性化處理，電泳檢測(cè)條帶大小與預(yù)期一致（圖3）。體外轉(zhuǎn)錄后，測(cè)定RNA平均質(zhì)量濃度分別為5.73 μg/mL與5.5 μg/mL，經(jīng)計(jì)算，GI NoV參考樣品拷貝數(shù)為1.326×109拷貝/μL，GII NoV參考樣品拷貝數(shù)為1.289×109拷貝/μL。采用GB 4789.42—2016熒光定量RT-qPCR方法[30]對(duì)RNA標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行GI和GII靶標(biāo)成分的檢測(cè)，可以獲得良好的S型擴(kuò)增曲線（圖4），證實(shí)成功獲取了GI與GII NoV RNA，可作為RNA參考樣品進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

圖2 重組質(zhì)粒pET-NoV GI（A）與pET-NoV GII（B）構(gòu)建示意圖Fig.2 Schematic diagram of pET-NoV GI (A) and pET-NoV GII (B) recombinant plasmids

圖3 pET-NoV GI（A）與pET-NoV GII（B）重組質(zhì)粒酶切電泳圖Fig.3 Electrophoresis of pET-NoV GI (A) and pET-NoV GII (B)recombinant plasmids

圖4 GI和GII靶標(biāo)基因RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果Fig.4 RT-qPCR for GI and GII target genes

2.2 NoV雙重?zé)晒釸T-ERA檢測(cè)方法的建立

首先篩選了MS2噬菌體ERA檢測(cè)引物探針，篩選到一組MS2引物探針的擴(kuò)增效果良好，特異性良好（圖5A）。然后將其與前期實(shí)驗(yàn)室篩選的GI、GII NoV ERA引物探針?lè)謩e組合，對(duì)GI、GII NoV RNA與MS2噬菌體RNA混合模板進(jìn)行擴(kuò)增，結(jié)果顯示，GI、GII NoV均可以與MS2噬菌體組合進(jìn)行雙重RT-ERA熒光反應(yīng)（圖5B、C），但擴(kuò)增效率稍低，因此需要對(duì)反應(yīng)體系進(jìn)行優(yōu)化。

2.3 雙重?zé)晒釸T-ERA擴(kuò)增體系引物探針優(yōu)化結(jié)果

為提高建立的雙重?zé)晒釸T-ERA法的擴(kuò)增效率，本研究分別對(duì)體系中引物和探針的濃度進(jìn)行了優(yōu)化。其中引物優(yōu)化結(jié)果分別如圖6A、B所示，可以看出隨著引物濃度的增加熒光強(qiáng)度均呈逐漸增強(qiáng)趨勢(shì)，當(dāng)引物量提高到4.1 μL時(shí)，熒光強(qiáng)度最高，GI、GII NoV的擴(kuò)增曲線與MS2噬菌體以及陰性對(duì)照能明顯區(qū)分。

以4.1 μL作為最佳引物量進(jìn)行探針濃度優(yōu)化，結(jié)果分別如圖6C、D所示，同樣地，擴(kuò)增曲線熒光強(qiáng)度也隨著探針濃度的增加不斷增強(qiáng)，但當(dāng)探針量達(dá)到1.6 μL時(shí)，濃度的增加對(duì)曲線的擴(kuò)增效果影響不大，說(shuō)明已達(dá)到反應(yīng)體系的閾值。因此，綜合擴(kuò)增效率與成本考慮，將1.8 μL作為最佳探針添加量。通過(guò)優(yōu)化，確定雙重?zé)晒釸T-ERA擴(kuò)增體系中引物及探針的最佳用量分別為4.1 μL與1.8 μL。

2.4 雙重?zé)晒釸T-ERA反應(yīng)程序優(yōu)化結(jié)果

為實(shí)現(xiàn)快速檢測(cè)，本研究進(jìn)一步對(duì)反應(yīng)程序進(jìn)行優(yōu)化，結(jié)果如圖7所示，可以看出當(dāng)?shù)?步反應(yīng)程序?yàn)?5 s、40 個(gè)循環(huán)時(shí)擴(kuò)增效率最好（圖7A），此時(shí)檢測(cè)時(shí)間為17 min 10 s，相對(duì)于原始擴(kuò)增程序的20 min 30 s，可以節(jié)省3 min 20 s。隨著擴(kuò)增時(shí)間的縮短，擴(kuò)增效率雖有逐漸下降趨勢(shì)（圖7），但仍具有良好的擴(kuò)增曲線，可以滿足檢測(cè)需求。其中當(dāng)?shù)?步反應(yīng)程序?yàn)? s、35 個(gè)循環(huán)時(shí)，檢測(cè)時(shí)間僅需9 min 6 s（圖7D），相對(duì)于原始擴(kuò)增程序可以節(jié)省11 min 24 s。

圖7 雙重?zé)晒釸T-ERA反應(yīng)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果Fig.7 Optimization of dual RT-ERA reaction time

2.5 雙重?zé)晒釸T-ERA檢測(cè)靈敏度分析

將10 倍梯度稀釋的GI NoV＋MS2和GII NoV＋MS2混合RNA進(jìn)行雙重?zé)晒釸T-ERA檢測(cè)靈敏度分析。如圖8所示，建立的方法對(duì)GI與GII NoV檢出限均為102拷貝/μL，具有較高的靈敏度，可以滿足檢測(cè)需求。

圖8 雙重?zé)晒釸T-ERA靈敏度分析結(jié)果Fig.8 Sensitivity of dual RT-ERA

2.6 真實(shí)樣品檢測(cè)結(jié)果

如圖9A所示，MS2過(guò)程控制病毒RNA濃度與樣品Ct值線性關(guān)系良好（R2=0.983 3），符合GB 4789.42—2016[30]規(guī)定。圖9B為4 種試劑盒對(duì)真實(shí)樣品中MS2 RNA的擴(kuò)增效果，根據(jù)提取效率公式，PureLinkTMRNA Mini Kit對(duì)貝類樣品中MS2過(guò)程控制病毒RNA的提取效率最高，約1.94%，因此后續(xù)均采用此試劑盒進(jìn)行貝類樣品RNA提取。

圖9 不同試劑盒對(duì)貝類樣品RNA的提取效率Fig.9 Extraction efficiency of RNA in shellfish samples by different kits

應(yīng)用本研究建立的雙重?zé)晒釸T-ERA方法與參比方法GB 4789.42—2016中的熒光RT-qPCR方法對(duì)29 份真實(shí)樣品進(jìn)行檢測(cè)，結(jié)果顯示（表3），2 份真實(shí)糞便樣本可以正確檢出，說(shuō)明本研究建立的雙重?zé)晒釸T-ERA快檢方法對(duì)真實(shí)樣本檢測(cè)的準(zhǔn)確性。27 份貝類樣品有3 份檢出GII NoV，未檢出GI NoV，結(jié)果與GB 4789.42—2016一致，證實(shí)了本研究建立的方法在貝類樣品中檢測(cè)的適用性。

表3 真實(shí)樣品檢測(cè)結(jié)果Table 3 Results of detection of real samples by RT-PCR and dual TR-ERA

3 討 論

近年來(lái)，由NoV感染引起的急性胃腸炎爆發(fā)事件已屢見(jiàn)不鮮，這可能與全國(guó)范圍的NoV急性胃腸炎暴發(fā)監(jiān)測(cè)工作起步較晚，大多數(shù)地區(qū)不具備完整的檢測(cè)體系或缺乏相應(yīng)的檢測(cè)能力有關(guān)[31]。本研究建立的雙重?zé)晒釸TERA檢測(cè)方法，檢測(cè)速度快、操作簡(jiǎn)單、易于推廣。且可以在一個(gè)反應(yīng)單元中同時(shí)檢測(cè)出2 種病毒，可降低檢測(cè)成本，同時(shí)也能節(jié)約檢測(cè)時(shí)間。此外還通過(guò)T7 RNA聚合酶體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得了高純度的RNA，研制了pET-NoV GI與pET-NoV GII兩種RNA標(biāo)準(zhǔn)參考樣品，可以作為檢測(cè)體系中的陽(yáng)性對(duì)照品，解決了因NoV無(wú)法體外培養(yǎng)導(dǎo)致的陽(yáng)性樣品缺乏，檢測(cè)無(wú)法進(jìn)行的瓶頸問(wèn)題。從而為提升我國(guó)NoV早期篩查和風(fēng)險(xiǎn)防控水平，預(yù)防NoV中毒事件，保障人民身體健康提供重要的技術(shù)支撐。

本研究采用的RT-ERA技術(shù)是通過(guò)模擬生物體遺傳物質(zhì)自身擴(kuò)增復(fù)制的原理，利用抗體制藥領(lǐng)域先進(jìn)的Molecular Design、Directed Evolution、Affinity Maturation等技術(shù)手段，將來(lái)源于細(xì)菌、病毒和噬菌體的特定工具酶進(jìn)行改造突變并篩選其功能，以此建立的最優(yōu)反應(yīng)體系。與傳統(tǒng)的恒溫?cái)U(kuò)增技術(shù)LAMP相比，ERA技術(shù)無(wú)需設(shè)計(jì)多對(duì)引物，反應(yīng)溫度更低，且擴(kuò)增產(chǎn)物可直接用于克隆測(cè)序，在靈敏度和特異性上也有了一定的提高。與目前的檢測(cè)“金標(biāo)準(zhǔn)”PCR技術(shù)相比，RT-ERA技術(shù)可擺脫大型儀器的束縛，且在特異性、靈敏度良好的基礎(chǔ)上表現(xiàn)出更短的檢測(cè)時(shí)長(zhǎng)。另外，RT-ERA技術(shù)的優(yōu)勢(shì)不僅體現(xiàn)在其檢測(cè)時(shí)間與恒溫特性上，還在于其具備現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)的潛力，結(jié)果讀取方式多種多樣，如：1）與側(cè)向流動(dòng)試紙條聯(lián)合，2）與顯色劑結(jié)合，3）使用熒光PCR儀，均可達(dá)到可視化檢測(cè)的目的。項(xiàng)目組前期與公司合作開(kāi)發(fā)了迷你qPCR儀，機(jī)身質(zhì)量為1.38 kg，尺寸為247 mm×188 mm×133 mm可同時(shí)對(duì)4 種熒光通道進(jìn)行信號(hào)采集，且升降溫速度快（8～10 ℃/s），無(wú)運(yùn)動(dòng)光學(xué)部件，移動(dòng)運(yùn)輸無(wú)需矯正，自帶人機(jī)交互和外接人機(jī)交互設(shè)計(jì)，并具有遠(yuǎn)程可控組件，可自動(dòng)出具檢測(cè)結(jié)果或遠(yuǎn)程出具結(jié)果，具有遠(yuǎn)程數(shù)據(jù)傳輸功能。本研究將研制的NoV RNA標(biāo)準(zhǔn)參考樣品，建立NoV雙重?zé)晒釸T-PCR技術(shù)，與迷你qPCR儀結(jié)合，以期為NoV病毒現(xiàn)場(chǎng)可視化多重快速檢測(cè)和監(jiān)測(cè)提供了技術(shù)與裝備，對(duì)切斷NoV傳播，筑牢食品“防護(hù)墻”，控制NoV爆發(fā)，保障人民健康具有重要意義。

4 結(jié) 論

本研究首先通過(guò)將NoV靶序列構(gòu)建到含T7啟動(dòng)子的載體中，通過(guò)體外轉(zhuǎn)錄的方式獲得了高純度的RNA，研制了pET-NoV GI與pET-NoV GII RNA標(biāo)準(zhǔn)參考樣品。然后以MS2噬菌體作為過(guò)程控制病毒，建立了一種高效快速的GI與GII NoV雙重?zé)晒釸T-ERA檢測(cè)方法，最低可以檢測(cè)出102個(gè)拷貝數(shù)量級(jí)的NoV核酸樣品，檢測(cè)時(shí)間最短可以縮減至10 min左右。最后將建立的方法應(yīng)用于真實(shí)樣品中，通過(guò)國(guó)標(biāo)規(guī)定的熒光RT-qPCR比較，證實(shí)了本研究方法在真實(shí)樣品中檢測(cè)的準(zhǔn)確性和適用性。同時(shí)依托合作開(kāi)發(fā)的迷你qPCR儀，為NoV監(jiān)測(cè)檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)執(zhí)法提供強(qiáng)有力的科技支撐。