李素梅，陳偉韜，畢曉黎，胥愛麗，肖觀林，江潔怡，張靖年，李養(yǎng)學(xué)

[廣東省第二中醫(yī)院（廣東省中醫(yī)藥工程技術(shù)研究院）/廣東省中醫(yī)藥研究開發(fā)重點實驗室，廣東 廣州 510095]

大承氣湯源自漢代張仲景的《傷寒論》，由大黃、芒硝、厚樸、枳實4味中藥組成，為瀉下法代表方劑[1-2]，具有峻下熱結(jié)的作用，主要用于治療陽明腑實證、熱結(jié)旁流證、里熱實證。大黃有通腑泄熱之功為君藥，芒硝潤燥軟堅為臣藥，厚樸、枳實行氣、消積除脹，二者同為佐藥[3]，四藥合用，瀉下兼行氣，共同發(fā)揮攻下瀉熱，行氣導(dǎo)滯的作用[4]。大承氣湯起初主要用于治療大便不通，目前臨床上主要用于消化系統(tǒng)疾病[5]—腸梗阻、急性胰腺炎、各種腹部手術(shù)所致胃腸功能障礙；呼吸系統(tǒng)疾病[5]—急性肺損傷、急性呼吸窘迫綜合征、肺心病伴心衰；泌尿系統(tǒng)疾病[5]—慢性腎衰、尿道結(jié)石、尿毒癥；心腦血管疾病[4]—改善心腦血管患者意識、改善神經(jīng)功能缺損等；此外還用于有機磷中毒、鉛中毒、食物中毒等各種中毒病癥的搶救。大承氣湯現(xiàn)代應(yīng)用廣泛[3]，涉及內(nèi)外婦兒等多科疾病。

現(xiàn)代藥理研究表明，大承氣湯具有瀉下、抗菌、抗內(nèi)毒素、解毒、解熱、調(diào)節(jié)胃腸功能、降低細(xì)胞炎因子、調(diào)節(jié)免疫功能等作用[2]。大黃主要含蒽醌、蒽酮、二苯乙烯、鞣質(zhì)類等化學(xué)成分，其中蒽醌類和蒽酮類是大黃發(fā)揮瀉下作用的主要活性成分[6-7]。厚樸含有木脂素類、生物堿類、揮發(fā)油、黃酮等多種成分，其中厚樸酚與和厚樸酚含量較高，是厚樸的重要質(zhì)量控制指標(biāo)[8-9]。枳實含有黃酮、生物堿、揮發(fā)油等化學(xué)成分，黃酮類為其主要成分，其中以柚皮苷、新橙皮苷含量最高[10-11]。芒硝主要成分為含水硫酸鈉[12]。以上成分構(gòu)成大承氣湯發(fā)揮藥理作用的主要物質(zhì)基礎(chǔ)，也是常用的質(zhì)量控制指標(biāo)[13]。

在大承氣湯有關(guān)化學(xué)成分或質(zhì)量控制研究方面，曾元兒等[14]采用HPLC 法研究了大承氣湯中大黃蒽醌類的量變規(guī)律，發(fā)現(xiàn)傳統(tǒng)煎法能有效提高大承氣湯主要有效成分的溶存量；陸杰等[15]采用UPLC-LTQ-Orbitrap-MS分析大承氣湯化學(xué)成分，鑒定出了73個化合物，主要有蒽醌類、木脂素類、黃酮類等；魏惠珍等[16]建立了大承氣湯HPLC 指紋圖譜分析方法，共標(biāo)出12 個共有峰，并標(biāo)定了其中9 種成分；曹俊嶺等[17]采用HPLC 法測定大承氣湯傳統(tǒng)湯劑與配方顆粒中蘆薈大黃素、厚樸酚及和厚樸酚的含量；寧秋菊等[18]采用HPLC 法同時測定了大承氣湯中10 種活性成分；大承氣湯分煎、合煎化學(xué)成分指紋圖譜對比研究方面尚未見報道。

中藥配方顆粒使用引發(fā)的中藥單煎與合煎等效性問題，主要表現(xiàn)為化學(xué)成分、藥效和臨床療效方面，其中化學(xué)成分是發(fā)揮作用的物質(zhì)基礎(chǔ)，且化學(xué)成分的研究可快速發(fā)現(xiàn)單煎與合煎的差異，并可探討存在差異的原因[19]。本研究采用超高效液相色譜技術(shù)，建立大承氣湯單煎、合煎液UPLC對比指紋圖譜，在物質(zhì)基礎(chǔ)層面探討分煎、合煎存在的差異性，以期為大承氣湯配方顆粒的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究提供參考。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

雙杰JJ500 電子天平（江蘇常熟）；KQ-700D 超聲提取器（江蘇昆山）；梅特勒XS205DU 分析天平（瑞士）；安捷倫1290超高效液相色譜儀（美國）。

1.2 試藥

沒食子酸、兒茶素、橙皮苷、大黃素（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95.3%）對照品批號分別為0831-9501、877-200001、110721-201316、110756-201512，于中國食品藥品檢定研究院采購；大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）、大黃酚-8-O-葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：95%）、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）對照品批號分別為D-048-181101、D-068-180914、D-052-181213，于成都瑞芬思生物科技有限公司采購；蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）批號為PRF9050721，于成都普瑞法科技開發(fā)有限公司采購；大黃素-8-O-葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）、大黃酚-1-O-葡萄糖苷（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）、番瀉苷A（質(zhì)量分?jǐn)?shù)：98%）對照品批號分別為AF8121001、AF8122103、AF7081503，于成都埃法生物科技有限公司采購。大黃（產(chǎn)地：甘肅）、芒硝（產(chǎn)地：湖南）、厚樸（產(chǎn)地：四川）、枳實（產(chǎn)地：四川）飲片批號見表1，購于廣州金芝中藥飲片有限公司，經(jīng)廣東省第二中醫(yī)院劉法錦教授鑒定。流動相用甲醇為Merck色譜純試劑，流動相用水是屈臣氏蒸餾水，磷酸、甲醇等為分析純試劑。

2 方法與結(jié)果

2.1 樣品的制備

2.1.1 合煎液的制備按大承氣湯處方比例稱取大黃12.00 g，厚樸15.00 g，枳實12.00 g，芒硝9.00 g，加入10 倍量水，浸泡30 min，加熱使之沸騰后，文火慢煎30 min，放冷，濾過，加入500 mL 量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得大承氣湯合煎液。制備了10批合煎液，分別記為HJS1～S10。

2.1.2 單煎液的制備 分別稱取大黃12.00 g，厚樸15.00 g，枳實12.00 g，芒硝9.00 g，分別加入10 倍量水，浸泡30 min，加熱使之沸騰后，文火慢煎30 min，放冷，濾過，合并各單煎液，加入500 mL 量瓶，加水稀釋至刻度，搖勻，即得大承氣湯單煎液。制備了10批單煎液，分別記為DJS1～S10。

2.1.3 供試品溶液的制備 精密取煎液5 mL，置具塞錐形瓶中，再精密加入5 mL 甲醇，稱重，超聲提取10 min，放冷，用50%甲醇補足減失的質(zhì)量，提取液通過0.22 μm 的微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.1.4 對照品溶液的制備 取沒食子酸對照品、兒茶素對照品、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷對照品、橙皮苷對照品、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷對照品、番瀉苷A 對照品、大黃酚-1-O-葡萄糖苷對照品、大黃酚-8-O-葡萄糖苷對照品、大黃素-8-O-葡萄糖苷對照品、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷對照品、大黃素對照品適量，精密稱定，分別加甲醇制成每1 mL 含沒食子酸28.00 μg、兒茶素20.00 μg、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷19.60 μg、橙皮苷22.87 μg、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷26.26 μg、番瀉苷A 40.4 μg、大黃酚-1-O-葡萄糖苷24.30 μg、大黃酚-8-O-葡萄糖苷19.00 μg、大黃素-8-O-葡萄糖苷19.99 μg、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷22.74 μg、大黃素17.60 μg的溶液，即得。

2.2 色譜條件

以Waters ACQUITYHSS T3 柱為色譜柱（150 mm×2.1 mm，1.8 μm）；以甲醇流動相A，以0.1%磷酸水溶液為流動相B，按表2 的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫；檢測波長為225 nm，柱溫為30 ℃；流速為0.25 mL/min，進(jìn)樣量為2μL。

表2 流動相梯度Table 2 Gradient of mobile phase

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 專屬性試驗 精密吸取50%甲醇空白溶液及供試品溶液各2 μL，按“2.2”項下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜圖，見圖1，結(jié)果表明，所建方法能準(zhǔn)確測定指紋圖譜中所有共有峰，不受空白溶劑干擾。

圖1 專屬性試驗UPLC色譜圖Figure 1 UPLC chromatograms of specific test

2.3.2 精密度試驗 取大承氣湯合煎液（S9），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件重復(fù)進(jìn)樣6 次測定，每次2 μL，以蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（6 號峰）為參照峰，計算各共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算RSD值，結(jié)果各共有指紋峰相對保留時間的RSD 為0.07%～0.33%，相對峰面積的RSD 為0.94%～2.33%，表明儀器精密度較好。

2.3.3 穩(wěn)定性試驗 取大承氣湯合煎液（S9），按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件分別在0、2.5、5、7.5、10、12.5、15、17.5、20 h進(jìn)樣2μL，測定，以蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（6 號峰）為參照峰，計算各共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算RSD 值，結(jié)果各共有指紋峰相對保留時間的RSD 為0.10%～0.46%，相對峰面積的RSD 為1.11%～3.56%，表明供試品溶液在20 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗 取大承氣湯合煎液（S9），按“2.1.3”項下方法平行制備6 份供試品溶液，再按“2.2”項下色譜條件分別進(jìn)樣2μL，測定，以蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷（6 號峰）為參照峰，計算各共有指紋峰的相對保留時間及相對峰面積，并計算RSD值，結(jié)果各共有指紋峰相對保留時間的RSD 為0.09%～0.33%，相對峰面積的RSD為0.58%～2.87%，表明該方法重復(fù)性良好。

2.4 指紋圖譜的建立

2.4.1 參照峰的選擇 蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷為大黃中主要活性成分之一，在大承氣湯指紋圖譜中，蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷出峰時間適中，分離度良好，故選擇大黃素-8-O-葡萄糖苷為參照峰。

2.4.2 指紋圖譜相似度評價及共有峰確定 取“2.1.1”“2.1.2”項下制備的合煎液、單煎液，按“2.1.3”項下方法制備供試品溶液，并按“2.2”項下色譜條件依次進(jìn)樣測定分析，記錄指紋圖譜、保留時間和峰面積等信息，將10 批大承氣湯合煎、單煎樣品的指紋圖譜導(dǎo)入《中藥色譜指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)》2012 年版，設(shè)置合煎1 為參照圖譜，用多點校正后進(jìn)行Mark 峰匹配（時間窗為0.1 min），采用中位數(shù)法生成對照指紋圖譜，確定了19 個共有峰，20批大承氣湯單煎、合煎液共有峰匹配圖見圖2；運用相似度評價軟件進(jìn)行分析，10 批大承氣湯單煎液、合煎液相似度均在0.90 以上，見表3；表明大承氣湯單煎液與合煎液共有峰的種類、數(shù)目差別不大，化學(xué)成分無明顯差異。10 批單煎液指紋圖譜相對保留時間的RSD為0.07%～0.40%之間，因不同批次飲片含量存在差異，相對峰面積RSD 波動較大，在3.52%～36.95%之間；10 批合煎液指紋圖譜相對保留時間的RSD 在0.10%～0.56%之間、相對峰面積RSD在5.22%～46.04%之間。通過與對照品比對，確認(rèn)1號峰為沒食子酸，2號峰為兒茶素，6號峰為蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷，8 號峰為橙皮苷，9 號峰為大黃酸-8-O-β-D-葡萄糖苷，11號峰為番瀉苷A，13號峰為大黃酚-1-O-葡萄糖苷，14號峰為大黃酚-8-O-葡萄糖苷，15 號峰為大黃素-8-O-葡萄糖苷，18 號峰為大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷，19號峰為大黃素，見圖3。

圖2 大承氣湯單煎液、合煎液指紋圖譜匹配圖Figure 2 Fingerprints of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

圖3 大承氣湯合煎、單煎液UPLC對照指紋圖譜Figure 3 Reference fingerprints of mixed decoction and single decoction of Dachengqi Decoction

表3 20批大承氣湯單煎液與合煎液指紋圖譜相似度結(jié)果Table 3 Results of similarity analysis of 20 batches of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

2.5 化學(xué)計量學(xué)分析

2.5.1 主成分分析（PCA） 為評價大承氣湯單煎液與合煎液的差異以及存在差異的化學(xué)成分，將20批樣品的19個共有指紋峰峰面積標(biāo)準(zhǔn)化后作為變量，使用SPSS18.0 統(tǒng)計軟件對20 批次大承氣煎液樣品進(jìn)行主成分分析，主成分特征值、累積貢獻(xiàn)率見表4，PCA從19個變量中提取了4個特征值大于1的主成分，累積方差貢獻(xiàn)率為88.656%，表明前4 個成分可概括大承氣湯分煎液、合煎液指紋圖譜樣品的大部分化學(xué)信息。由碎石圖（圖4）可見，特征值大于1的部分曲線陡峭，小于1的部分趨于平緩，表明提取的4個主成分合理。主成分載荷距陣見表5，推測多種成分會對大承氣湯單煎液與合煎液差異性產(chǎn)生影響，色譜峰12、2、14、13、17、6、3、18、4、16、5 在主成分1 中權(quán)重較大；主成分2 主要反映了峰15、9、11、19、10的信息；峰8、1在主成分3中貢獻(xiàn)值較大。

圖4 PCA碎石圖Figure 4 The scree plot of PCA

表4 大承氣湯單煎液與合煎液主成分分析特征值及累積方差貢獻(xiàn)率Table 4 The PCA eigen value and cumulative variance contribution rate of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

表5 大承氣湯單煎液與合煎液主成分分析載荷距陣Table 5 Loading matrix of PCA of single decoction and mixed decoction of Dachengqi Decoction

2.5.2 OPLS-DA 為了較好地分析大承氣湯單煎液與合煎液之間的差異，將20 批樣品19 個共有峰峰面積導(dǎo)入SIMCA 14.1 軟件進(jìn)行OPLS-DA 分析，由得分圖（圖5）可見，20 批次樣品（大承氣湯單煎液與合煎液）顯著分為2類。各變量投影重要度（VIP）大小排序見圖6，可見各色譜峰影響程度大小依次為峰8＞峰19＞峰4＞峰16＞峰1＞峰17＞峰12＞峰5＞峰15＞峰6＞峰2＞峰14＞峰11＞峰9＞峰18＞峰13＞峰3＞峰7＞峰10，其中峰8（橙皮苷）、峰19（大黃素）、峰4、峰16、峰1（沒食子酸）的VIP 值大于1，為區(qū)分大承氣湯單煎液與合煎液的標(biāo)志性成分，對分類結(jié)果影響顯著，提示這幾個成分對區(qū)分大承氣湯單煎液與合煎液貢獻(xiàn)較大。

圖5 OPLS-DA得分圖Figure 5 Score chart of OPLS-DA

圖6 VIP圖Figure 6 VIP plot

3 討論

研究過程中，通過PDA 檢測器對供試品進(jìn)行全波長掃描，根據(jù)色譜峰的峰數(shù)、豐度、基線漂移等情況，確定了檢測波長為225 nm；為確保色譜圖能總體反映大承氣湯的化學(xué)信息，實驗過程中分別考察了甲醇-水、甲醇-磷酸溶液、乙腈-磷酸溶液等溶劑系統(tǒng)對色譜峰的影響，結(jié)果以甲醇-0.1%磷酸溶液為流動相，梯度洗脫，色譜峰信息較為豐富、分離較好且基線平穩(wěn)；對不同柱溫（25、30、35 ℃）、流速（0.2、0.25、0.3 mL/min）、色譜柱進(jìn)行考察，根據(jù)色譜峰分離度、分析時間、柱壓等情況確定了最終的分析柱溫、流速、色譜柱。供試品溶液的制備考察了含甲醇量（50%、70%）、提取方式（超聲、加熱回流）、提取時間（10、20、30 min）的提取效果，根據(jù)色譜峰峰數(shù)，色譜峰總面積大小等確定供試品溶液的制備方法。

本研究建立了大承氣湯分煎液與合煎液的UPLC指紋圖譜，標(biāo)識了19個共有峰，并指認(rèn)出其中沒食子酸、兒茶素、蘆薈大黃素-8-O-葡萄糖苷、橙皮苷、大黃酸-8-O-β-D葡萄糖苷、番瀉苷A、大黃酚-1-O-葡萄糖苷、大黃酚-8-O-葡萄糖苷、大黃素-8-O-葡萄糖苷、大黃素甲醚-8-O-葡萄糖苷、大黃素11 個成分。通過中藥指紋圖譜相似度軟件評價，大承氣湯單煎液與合煎液相似度均在0.90 以上，另外通過單煎液與合煎液對照指紋圖譜比對，色譜峰數(shù)未有明顯增加或者減少，表明單煎液與合煎液整體化學(xué)成分一致性較好。為評價大承氣湯單煎液與合煎液差異性，本研究采用PCA 和OPLS-DA 進(jìn)行分析。PCA 分析出4 種主成分分別反映了19 個共有色譜峰的信息；OPLS-DA分析可將單煎液與合煎液區(qū)分成2 類，結(jié)合VIP 值＞1，峰8（橙皮苷）、峰19（大黃素）、峰4、峰16、峰1（沒食子酸），表明該5 種成分為大承氣湯單煎液與合煎液中存在的主要差異性成分。5 種差異性成分中，峰4、峰16、峰19（大黃素）單煎液中煎出量比合煎液高，峰1（沒食子酸）、峰8（橙皮苷）合煎液煎出量比單煎液高，提示大承氣湯復(fù)方中各化學(xué)成分間可能會因相互作用產(chǎn)生協(xié)同或拮抗效應(yīng)，進(jìn)而對化學(xué)成分的溶出有一定影響，后續(xù)在對大承氣湯配方顆粒的制備及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究方面將重點關(guān)注差異性成分，并進(jìn)一步開展化學(xué)成分與藥效相關(guān)性方面的研究。

4 結(jié)語

本研究建立了大承氣湯單煎液與合煎液UPLC指紋圖譜，并采用相似度評價軟件及化學(xué)計量學(xué)對兩者指紋圖譜整體信息進(jìn)行分析，評價單煎液與合煎液存在的差異性，為指導(dǎo)大承氣湯中藥復(fù)方配方顆粒的制備工藝及質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的提高研究提供參考。