莫偉，班夢夢，張丹雁，范紫穎，楊麗

（1.廣州采芝林藥業(yè)有限公司，廣東 廣州 510360；2.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；3.廣東黃埔衛(wèi)生職業(yè)技術(shù)學(xué)校，廣東 廣州 510700）

陽春砂來源于姜科植物陽春砂Amomum villosumLour.的干燥成熟果實(shí)，為四大南藥之一，具有化濕開胃、溫脾止瀉、理氣安胎等功效[1]。陽春砂以廣東陽春為道地產(chǎn)區(qū)，引種于云南、廣西等地，老撾、越南、緬甸亦有引種。

目前，市售陽春砂以云南文山、云南版納、老撾和越南引種為主流商品[2]，隨著進(jìn)口陽春砂不斷流入國內(nèi)市場，本課題組調(diào)研發(fā)現(xiàn)在老撾引種陽春砂中兩種均被云南當(dāng)?shù)厮庌r(nóng)稱為“嫁接品種”的老撾巴雙砂和老撾巴色砂，2種均為姜科豆蔻屬植物，種源不明，因分別產(chǎn)自老撾巴雙、巴色地區(qū)而得名，為新一輪兩個常見陽春砂高仿偽品，被單獨(dú)冒充或分別摻入文山引種陽春砂和版納引種陽春砂中出售，其外觀性狀分別與兩個云南陽春砂商品相似，非專業(yè)人士難以辨別[3]。前期本課題組報(bào)道了版納陽春砂與巴色砂的性狀、揮發(fā)油成分等特征鑒別[4]，但文山引種陽春砂與老撾巴雙砂（以下簡稱巴雙砂）未見報(bào)道，為準(zhǔn)確有效地鑒別和區(qū)分陽春砂正偽品，規(guī)范陽春砂在市場的流通，本文采用傳統(tǒng)經(jīng)驗(yàn)鑒別、顯微鑒別及理化鑒別法對云南文山陽春砂與巴雙砂的性狀、橫切面及粉末顯微、揮發(fā)油成分特征進(jìn)行對比分析和鑒定，以期為陽春砂真?zhèn)舞b別提供科學(xué)參考依據(jù)。

1 材料、儀器及試劑

1.1 材料

文山陽春砂樣品收集于云南省文山州馬關(guān)縣馬白鎮(zhèn)南山幸福社區(qū)引種的陽春砂，巴雙砂樣品收集于老撾產(chǎn)區(qū)，又稱“老撾巴雙砂”。經(jīng)廣州中醫(yī)藥大學(xué)張丹雁教授鑒定陽春砂為姜科豆蔻屬植物陽春砂（Amomum villosumLour.）的干燥成熟果實(shí)，巴雙砂為陽春砂同屬偽品，種源不明。樣品保存于廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定實(shí)驗(yàn)室。

1.2 儀器

SX70HS 長焦照相機(jī)（佳能）；DFT-150 粉碎機(jī)（溫州頂歷醫(yī)療器械有限公司）；B302 生物顯微鏡（重慶奧特光學(xué)儀器有限公司）；STP120 組織脫水機(jī)、HistoStar組織包埋機(jī)[賽默飛世爾科技（中國）有限公司]；JB-L5 凍臺（武漢俊杰電子有限公司）；HM 340E 輪轉(zhuǎn)式切片機(jī)[賽默飛世爾（上海）儀器有限公司]；DS-1500A 電子天平（佛山市順德區(qū)拓普域電子有限公司）；FA1004N 萬分之一分析天平（上海菁海儀器有限公司）；TC-15 恒溫電熱套（海寧市華星儀器廠）；Agilent7693自動進(jìn)樣器、7890B氣相色譜儀、Agilent5977質(zhì)譜儀（美國安捷倫公司）。

1.3 試劑

50%FAA 固定液（批號20210206，福州飛凈生物科技有限公司）；無水乙醇（批號20210720，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；二甲苯（批號20200620，天津市致遠(yuǎn)化學(xué)試劑有限公司）；水合氯醛（批號20190301，天津市大茂化學(xué)試劑廠）；丙三醇（批號20190708，天津市廣成化學(xué)試劑有限公司）；以上試劑均為分析純。

2 方法

2.1 性狀鑒定法

通過傳統(tǒng)性狀鑒別方法對文山陽春砂和巴雙砂外觀形狀、顏色、表面毛刺、種子團(tuán)、種子形狀、氣味等特征進(jìn)行對比鑒別。

2.2 顯微鑒定法

2.2.1 橫切面顯微[5]采用常規(guī)石蠟切片法制備文山陽春砂和巴雙砂種子橫切面顯微裝片，鏡檢，拍攝顯微特征。

2.2.2 粉末顯微 文山陽春砂和巴雙砂種子粉碎后過五號篩，制片并置于顯微鏡下觀察，拍攝顯微特征。

2.3 揮發(fā)性成分分析

2.3.1 揮發(fā)油提取 取樣品粉末約15 g，精密稱定后置于500 mL圓底燒瓶中，加入300 mL蒸餾水，參照《中國藥典》2020 年版四部通則“2204”中揮發(fā)油提取測定法（甲法）提取，加熱保持微沸約4 h，至揮發(fā)油量不再增加時停止加熱，靜置冷卻至室溫，讀取揮發(fā)油含量，計(jì)算揮發(fā)油提取率。

2.3.2 供試品的制備 精密吸取“2.3.1”項(xiàng)所得揮發(fā)油20 μL，石油醚定容至2 mL，混合均勻后過0.22 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3.3 GC-MS 條件 色譜條件：HP-5ms UI 型毛細(xì)管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；進(jìn)樣口溫度：250 ℃；程序升溫：初始溫度50 ℃，然后以5 ℃/min升至230 ℃，保持14 min。載氣：高純度氦氣；流速：1 mL/min；分流比100∶1；進(jìn)樣量：1 μL。

質(zhì)譜條件：離子源230 ℃，接口280 ℃；掃描范圍：m/z50～550；溶劑延遲3 min。

2.3.4 樣品測定及數(shù)據(jù)處理 取供試品溶液進(jìn)樣分析，通過與NIST14 質(zhì)譜數(shù)據(jù)庫進(jìn)行對照，計(jì)算機(jī)自動檢索并進(jìn)行文獻(xiàn)比對，對各色譜峰進(jìn)行鑒定，采用色譜峰面積歸一化法計(jì)算樣品揮發(fā)油中各成分的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)。

3 結(jié)果

3.1 性狀鑒別

文山陽春砂類圓球或卵圓形，淺黃棕色、棕色或紫棕色；表面毛刺粗短且稀疏，刺基寬扁而粗，具不明顯鈍三棱，果實(shí)頂端鈍，花被基凸起明顯；果皮稍厚，鼓起，內(nèi)表面淺棕、淺黃棕或黃白色；種子團(tuán)三瓣，隔膜外延，種子多面體狀長形，20～54粒；種子氣芳香，味微苦澀、微辛涼，成熟度高者味甜，辛涼感弱。

巴雙砂卵形，棕褐或黑褐色；表面毛刺稀疏，細(xì)縱棱多而明顯，果實(shí)頂端尖，有時略歪斜，花被基短且微突；果皮稍厚，略貼種子團(tuán)，內(nèi)表面淺黃棕或棕色；種子團(tuán)三瓣，隔膜外延，種子多面體狀三角形，40～75 粒；果殼稍具煙熏氣，種子味苦澀，香氣特異似山姜果。見圖1。

圖1 文山陽春砂（A）和巴雙砂（B）的外觀性狀特征Figure 1 Character identification of A. villosum Lour. from Wenshan(A)and Bashuang sha(B)

3.2 顯微鑒別

3.2.1 橫切面顯微特征 文山陽春砂種子橫切面：假種皮薄壁細(xì)胞皺縮呈條形，或膨脹呈類圓形，常含方晶；種皮表皮細(xì)胞1列，斜徑向類方形，壁略厚，胞腔斜類方形；下皮細(xì)胞1 列，內(nèi)含黃棕色色素，偶見向種皮表皮細(xì)胞層乳狀凸起，凸起處種皮細(xì)胞小而不規(guī)則；油細(xì)胞1 列，橫向或徑向，長方形或類方形，長短不一，長至78 μm；色素層3～5列細(xì)胞，大小長短不一，不規(guī)則狀，淺黃棕色；內(nèi)種皮細(xì)胞1列，紅棕色，中間內(nèi)凹略成杯狀，內(nèi)壁極厚，外壁薄，胞腔極小，內(nèi)含細(xì)小硅質(zhì)塊；外胚乳細(xì)胞大，徑向延長的長條形，內(nèi)含淀粉粒、草酸鈣方晶等；內(nèi)胚乳細(xì)胞小，多角形，內(nèi)含糊粉粒。

巴雙砂種子橫切面：假種皮薄壁細(xì)胞皺縮呈條形，或膨脹呈類圓形，含方晶；種皮表皮細(xì)胞1列，斜徑向扭曲，側(cè)壁及內(nèi)壁均勻增厚，外壁極厚，達(dá)49 μm，層紋不明顯，胞腔小或不明顯，扭曲；下皮細(xì)胞1～2 列，極扁小，內(nèi)含黃棕色色素，偶見向種皮表皮細(xì)胞層乳狀凸起，凸起處種皮細(xì)胞小而不規(guī)則；油細(xì)胞1 列，橫向長方形或類方形，長至118 μm；色素層4～5 列細(xì)胞，不規(guī)則瘦長橢圓形，淺黃棕色；內(nèi)種皮細(xì)胞1 列，黃棕至紅棕色，中間內(nèi)凹略成杯狀，內(nèi)壁極厚，外壁薄，胞腔極小，內(nèi)含細(xì)小硅質(zhì)塊；外胚乳細(xì)胞大，徑向延長的長條形，內(nèi)含淀粉粒、草酸鈣方晶等；內(nèi)胚乳細(xì)胞小，多角形，內(nèi)含糊粉粒。見圖2。

圖2 文山陽春砂（A）和巴雙砂（B）種子的橫切面顯微特征Figure 2 Micrographs of seeds of A. villosum Lour. from Wenshan(A)and Bashuang sha(B)

3.2.2 粉末顯微特征 文山陽春砂粉末：假種皮無色或淡黃色，成團(tuán)散在，壁極薄，常皺縮呈不規(guī)則形狀，內(nèi)含方晶；種皮表皮細(xì)胞淡黃色，表面觀長條形，末端漸尖或鈍圓，常斷裂，斷面觀方形、類方形或多邊形，常與下皮細(xì)胞上下層垂直排列；下皮細(xì)胞黃棕色或紅棕色，表面觀呈類長方形或類長圓形略規(guī)則排列，斷面觀不規(guī)則細(xì)長條形；油細(xì)胞無色或淡黃色，表面觀呈類方形或類圓形，斷面觀類長方形，多破碎，有的胞腔內(nèi)可見油滴；色素塊紅棕色或深棕色，常破碎成不規(guī)則狀；內(nèi)種皮細(xì)胞黃棕色或棕色，邊緣不規(guī)則破碎，成片，表面觀呈多角形，壁厚，內(nèi)含硅質(zhì)塊，斷面觀少見，1 列，柵狀排列；外胚乳細(xì)胞呈類長方形，內(nèi)含大量細(xì)小淀粉粒聚集形成的淀粉團(tuán)，有的淀粉團(tuán)中可見細(xì)小散在的方晶；草酸鈣方晶存在于假種皮、外胚乳中。

巴雙砂粉末顯微特征與陽春砂粉末相似，難以準(zhǔn)確區(qū)別。見圖3。

圖3 文山陽春砂（A）和巴雙砂（B）的種子粉末顯微特征Figure 3 Microscopic characteristics of seed powder of A.villosum Lour.from Wenshan(A)and Bashuang sha(B)

3.3 揮發(fā)性成分分析

二者揮發(fā)性成分總離子流圖見圖4、圖5，主要成分見表1?？梢姸咧饕╊?、酯類、醇類等成分，主成分均為左旋乙酸冰片酯、左旋樟腦、右旋萜二烯、莰烯、（1S，2E，6E，10R）-3，7，11，11-四甲基雙環(huán)[8.1.0]十一碳-2，6-二烯、合成右旋龍腦等。其中τ-Muurolol（0.60%）、（-）-1，7-二甲基-7-（4-甲基-3-戊烯基）-三環(huán)[2.2.1.0（2，6）]庚烷（0.58%）等為文山陽春砂特有成分；Neointermedeol（5.26%）、[S-（R*，S*）]-3-（1，5-二甲基-4-己烯基）-6-亞甲基-環(huán)己烯（0.76%）、g-硒烯（0.72%）等為巴雙砂特有成分；此外，文山陽春砂左旋乙酸冰片酯含量明顯比巴雙砂高，左旋樟腦含量略低，而巴雙砂中1-石竹烯明顯比文山陽春砂高，可據(jù)此鑒別。

表1 文山陽春砂與巴雙砂揮發(fā)油的化學(xué)成分及相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)Table 1 Volatile components and relative contents of A.villosum Lour.from Wenshan and Bashuang sha

圖4 文山陽春砂總離子流圖Figure 4 TIC of A.villosum Lour.from Wenshan

圖5 巴雙砂總離子流圖Figure 5 TIC of Bashuang sha

4 討論

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，文山陽春砂在果實(shí)形狀、顏色、表面紋理及氣味等性狀特征與巴雙砂存在差異；顯微特征中，兩者橫切面種皮表皮細(xì)胞形狀和細(xì)胞壁差異最明顯，其次是種皮下皮細(xì)胞及色素細(xì)胞的列數(shù)等，兩者粉末顯微特征不明顯，故陽春砂正偽品顯微鑒定中橫切面特征鑒別更有意義；揮發(fā)油化學(xué)成分對比表明，兩者雖均含有乙酸冰片酯、左旋樟腦、右旋萜二烯、莰烯等共有成分，但文山陽春砂有效成分乙酸冰片酯含量明顯高于巴雙砂，且兩者各自均含特有成分。據(jù)此可有效鑒別文山陽春砂正偽品。

以上差異除與加工方式、生態(tài)環(huán)境不同有關(guān)外，還與兩者種源不同更為密切相關(guān)。云南地區(qū)過往多采用全程曬干方式加工陽春砂，果實(shí)色澤淺且質(zhì)地疏松不緊實(shí)，容易散團(tuán)散氣變質(zhì)，不易運(yùn)輸與保存，質(zhì)差。近10 年來，云南砂仁種植戶在政府和專家大力推廣陽春砂科學(xué)種植和加工技術(shù)指導(dǎo)下，采取延遲采收的方法提高砂仁成熟度。加工技術(shù)方面，云南文山州多采用自動化或半自動化電烘箱烘烤技術(shù)，有時全程電烘烤至干燥，有時電烘烤中間過程增加了堆悶發(fā)汗步驟再繼續(xù)烘干的操作，全程電烘烤者砂仁表面淺黃棕、黃棕色或紫紅色，電烘烤中途發(fā)汗者表面顏色加深，黃褐色、紫棕色或棕褐色，電烘烤加發(fā)汗的砂仁果殼更加緊實(shí)不易爆裂，種子緊縮不易散團(tuán)，更利于運(yùn)輸和存放，果實(shí)多數(shù)圓球形，有效成分轉(zhuǎn)化、香氣更加醇香，砂仁質(zhì)量提高，市場占有度逐年上升[2]。相比之下，老撾陽春砂及其偽品巴色砂和巴雙砂均采用柴火烘烤方法進(jìn)行干燥加工處理，故果實(shí)表面色澤深，常呈棕褐或黑褐色，同時果殼稍具煙熏氣。

本文對文山陽春砂與其常見偽品巴雙砂從性狀、橫切面及粉末顯微、揮發(fā)油成分等進(jìn)行對比分析鑒別，結(jié)果顯示二者在藥材性狀、橫切面顯微、揮發(fā)油成分均存在差異，特別是巴雙砂果殼表面毛絨稀少，縱棱清晰而多，口嘗香氣特異似山姜果，兩者揮發(fā)油雖然絕大多數(shù)成分相似，但各自均具獨(dú)有成分，據(jù)此可有效鑒別文山陽春砂及老撾巴雙砂。本研究為文山陽春砂真?zhèn)舞b別提供科學(xué)數(shù)據(jù)，對陽春砂進(jìn)一步正本清源、提高質(zhì)量、確保臨床安全用藥具有重要意義。