李思宇，孟媛媛，王帝，李璐，趙寧曉，王一飛

（1.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院血管腺體胃腸外科，河北 張家口 075000；2.中國人民解放軍空軍特色醫(yī)學(xué)中心普外科，北京 100080；3.河北北方學(xué)院附屬第一醫(yī)院感染性疾病科，河北 張家口 075000；4.河北醫(yī)科大學(xué)第四醫(yī)院胃腸外科，河北 石家莊 050000）

胰腺癌是一種惡性程度高、疾病進(jìn)展快的惡性腫瘤疾病。近年來，胰腺癌的發(fā)病率和病死率逐年增加，但治療胰腺癌的手段有限且療效欠佳[1]。越來越多的研究顯示，局部麻醉劑可能抑制腫瘤細(xì)胞，而在治療癌癥方面發(fā)揮有益作用[2-3]。丁哌卡因，也稱布比卡因，是外科、產(chǎn)科局部或區(qū)域麻醉及術(shù)后鎮(zhèn)痛的常用麻醉藥物[4]。近期研究發(fā)現(xiàn)，丁哌卡因?qū)Χ喾N腫瘤具有抑制作用[5-6]。Bundscherer等[7]研究顯示，高濃度丁哌卡因?qū)σ认侔┘?xì)胞PaTu 8988t、PANC-1 具有抗增殖的作用。但丁哌卡因抑制胰腺癌的相關(guān)作用機(jī)制尚未完全闡明。本研究主要觀察丁哌卡因?qū)σ认侔㏄ANC-1 細(xì)胞的影響，并探討其作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料

胰腺癌PANC-1 細(xì)胞購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；丁哌卡因購自江西青峰藥業(yè)有限公司，國藥準(zhǔn)字H20090253；CCK8 試劑盒購自日本同仁；一步法TUNEL細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒、線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒（JC-1）購自上海碧云天生物科技有限公司；超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）、谷胱甘肽（GSH）生化試劑盒、DCF-DA 熒光探針購自南京建成生物公司；Trizol 試劑購自美國Sigma 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、熒光定量PCR 試劑盒購自日本TAKARA 公司；細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子（p21）、凋亡抑制蛋白（Survivin）、核增殖抗原（Ki67）、B 淋巴細(xì)胞瘤-2 基因（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶3（Caspase3）、切割后Caspase 3（cleaved cas 3）、原癌基因（c-Myc）抗體購自美國Abcam。

1.2 主要儀器

bx51 型熒光顯微鏡購自日本奧林巴斯公司，F(xiàn)ACS CAlibur 型流式細(xì)胞儀購自美國BD 公司，CFX96型熒光定量PCR儀購自美國BioRad公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)與分組

PANC-1 細(xì)胞置于含有10%（φ）胎牛血清的DMEM 高糖培養(yǎng)基，5%（φ）CO2、37 ℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞融合至80%～90%時(shí)，添加0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，取生長(zhǎng)狀況良好的細(xì)胞分為4 組：不使用丁哌卡因處理的細(xì)胞為對(duì)照組，以1.25、2.5、5 mmol/L 丁哌卡因[8]處理的細(xì)胞為丁哌卡因組。

1.4 CCK8檢測(cè)細(xì)胞增殖能力

將細(xì)胞調(diào)整至4×107/L 接種于96 孔板，培養(yǎng)24 h，分別加入含有0.07、0.15、0.3、0.6、1.25、2.5、5、10、20、40、80 mmol/L 丁哌卡因的培養(yǎng)基處理24 h，另添加不含丁哌卡因的培養(yǎng)基處理的細(xì)胞為對(duì)照組，每孔加入含有10% CCK8 試劑的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)1 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)各孔吸光度值（A），計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率[（對(duì)照組A 值-丁哌卡因組A 值）/對(duì)照組A值×100%]。

1.5 TUNEL染色觀察細(xì)胞凋亡

取各組細(xì)胞置于6 孔板，加入固定液固定10 min，PBS 清洗2 遍后加入免疫染色強(qiáng)力通透液，室溫孵育5 min，PBS 清洗1 遍，滴加TUNEL 檢測(cè)液，37 ℃下避光孵育60 min，PBS 清洗3 遍，滴加抗熒光淬滅封片液，熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞凋亡，計(jì)算細(xì)胞凋亡率（凋亡細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%），激發(fā)波長(zhǎng)450～500 nm，發(fā)射波長(zhǎng)515～565 nm。

1.6 生化試劑盒檢測(cè)氧化應(yīng)激指標(biāo)

收集各組細(xì)胞上清液，參照試劑盒說明書操作，檢測(cè)細(xì)胞上清液中SOD、MDA 和GSH 的含量。

1.7 熒光探針檢測(cè)活性氧（ROS）含量

取各組細(xì)胞置于6 孔板，加入10 μmol/L DCFDA 探針，孵育30 min，PBS 清洗2 遍后，熒光顯微鏡下觀察，激發(fā)波長(zhǎng)50 nm 下，DCF-DA 探針可與細(xì)胞中ROS結(jié)合發(fā)出綠色熒光。

1.8 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)線粒體膜電位

取各組細(xì)胞置于6孔板，加入JC-1工作液，繼續(xù)培養(yǎng)30 min，再加入反應(yīng)緩沖液清洗2次，以JC-1染色緩沖液重懸細(xì)胞，于流式細(xì)胞儀檢測(cè)JC-1 單體（綠色）百分比。

1.9 實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)生長(zhǎng)標(biāo)記物水平

添加Trizol試劑裂解細(xì)胞，提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA鏈，再進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR擴(kuò)增。p21上游引物序列：5′-CACAACCTCCGTCATGT GCT-3′，下游引物序列：5′-GCCGTTTTCGACCCTGAGAG-3′；Survivin 上游引物序列：5′-TTGGCAGGTGCCTG TTGAAT-3′，下游引物序列：5′-AGCCAGTCCCCC ACAGCAT-3′；Ki67 上游引物序列：5′-AAACCC CACCAAGTAAAACA-3′，下游引物序列：5′-CCA AGGCAAGCTCAGGAC-3′。擴(kuò)增條件為：95 ℃預(yù)變性5 min，95 ℃變性30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，共40 個(gè)循環(huán)。以GAPDH 為內(nèi)參，運(yùn)用2-△△Ct公式，計(jì)算p21、Survivin、Ki67 mRNA 的相對(duì)水平。

1.10 蛋白印跡檢測(cè)蛋白表達(dá)

添加RIPA 試劑提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 試劑進(jìn)行蛋白定量，混入上樣緩沖液置于沸水中變性10 min；配制10%聚丙烯酰胺凝膠，點(diǎn)樣后電泳分離蛋白，再切割目的蛋白凝膠進(jìn)行電轉(zhuǎn)，取出PVDF 膜置于5%脫脂牛奶中，室溫封閉2 h，加入一抗（1∶1 000），4 ℃下孵育過夜，再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗（1∶5 000），37 ℃孵育1 h，最后添加ECL化學(xué)發(fā)光劑顯影。

1.11 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

各實(shí)驗(yàn)重復(fù)5 次，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，采用統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS17.0 分析處理，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞增殖的影響

CCK-8 實(shí)驗(yàn)檢測(cè)顯示，丁哌卡因處理后對(duì)PANC-1 細(xì)胞增殖均產(chǎn)生了抑制作用，且隨著丁哌卡因濃度的增加，抑制作用更明顯（P＜0.05），見圖1。選取1.25、2.5、5 mmol/L丁哌卡因?yàn)楹罄m(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。

圖1 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞增殖的影響Figure 1 Effect of bupivacaine on PANC-1 cell proliferation(±s,n=5)

2.2 丁哌卡因?qū)ANC-1 細(xì)胞中生長(zhǎng)標(biāo)記物表達(dá)的影響

如圖2，實(shí)時(shí)熒光定量PCR 和蛋白印跡檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，2.5、5 mmol/L 丁哌卡因組p21 mRNA 及蛋白表達(dá)增加，Survivin、Ki67 mRNA 及蛋白表達(dá)減少（P＜0.05）。

圖2 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞中生長(zhǎng)標(biāo)記物表達(dá)的影響Figure 2 Effect of bupivacaine on the expressions of growth markers in PANC-1 cells(±s,n=5)

2.3 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞凋亡的影響

如圖3，TUNEL 染色觀察顯示，呈亮藍(lán)色染色的細(xì)胞為凋亡的PANC-1 細(xì)胞，對(duì)照組、1.25、2.5、5 mmol/L 丁哌卡因組細(xì)胞凋亡率分別為（2.37±0.68）%、（12.83±3.82）%、（19.74±4.13）%、（25.53±3.65）%，與對(duì)照組比較，2.5、5 mmol/L丁哌卡因組細(xì)胞凋亡率明顯增加（P＜0.05）。

圖3 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞凋亡的影響（TUNEL染色，100×）Figure 3 Effect of bupivacaine on PANC-1 cell apoptosis(TUNEL staining,100×)

2.4 丁哌卡因?qū)ANC-1 細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

生化試劑盒檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，2.5、5 mmol/L丁哌卡因組細(xì)胞上清液中MDA 含量明顯增加，SOD和GSH含量明顯減少（P＜0.05），見表1。

表1 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 1 Effect of bupivacaine on oxidative stress indexes in the supernatant of PANC-1 cells(±s,n=5)

表1 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞上清液中氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響Table 1 Effect of bupivacaine on oxidative stress indexes in the supernatant of PANC-1 cells(±s,n=5)

與對(duì)照組比較：*P＜0.05。

組別對(duì)照組丁哌卡因組c/（mmol·L-1）0 1.25 2.5 5 c（MDA）/（mmol·mL-1）2.21±0.19 2.26±0.38 3.48±0.26*4.22±0.37*SOD/（U·mL-1）4.38±0.43 4.34±0.62 3.65±0.44*2.83±0.36*GSH-px/（U·mL-1）47.32±7.56 48.21±9.47 37.25±6.54*29.74±5.38*

2.5 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞中ROS含量的影響

如圖4，熒光探針檢測(cè)顯示，對(duì)照組、1.25、2.5、5 mmol/L 丁哌卡因組ROS 含量分別為（0.62±0.18）%、（0.87±0.21）%、（11.53±2.62）%、（21.86±4.53）%，與對(duì)照組比較，2.5、5 mmol/L丁哌卡因組細(xì)胞中ROS含量明顯增加（P＜0.05）。

圖4 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞中ROS含量的影響（DCF-DA探針，100×）Figure 4 Effect of bupivacaine on ROS level in PANC-1 cells(DCF-DA probe,100×)

2.6 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響

如圖5，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示，對(duì)照組、1.25、2.5 、5 mmol/L 丁哌卡因組JC-1 單體百分比分別為（2.64±0.68）% 、（3.11±0.82）% 、（9.73±2.21）% 、（22.37±3.69）%，與對(duì)照組比較，2.5、5 mmol/L 丁哌卡因組細(xì)胞中JC-1 單體百分比明顯增加（P＜0.05）。

圖5 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞線粒體膜電位的影響Figure 5 Effect of bupivacaine on mitochondrial membrane potential in PANC-1 cells

2.7 丁哌卡因?qū)ANC-1 細(xì)胞中細(xì)胞凋亡標(biāo)記物表達(dá)的影響

如圖6，蛋白印跡檢測(cè)顯示，與對(duì)照組比較，2.5、5 mmol/L 丁哌卡因組細(xì)胞中Bax/Bcl-2、cleaved cas 3/cas 3 水平明顯增加，c-Myc 蛋白表達(dá)明顯減少（P＜0.05）。

圖6 丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞凋亡標(biāo)記物表達(dá)的影響Figure 6 Effect of bupivacaine on the expressions of apoptosis markers in PANC-1 cells（±s，n=5）

3 討論

局部麻醉劑主要通過抑制神經(jīng)元細(xì)胞膜鈉內(nèi)流，引起信號(hào)傳導(dǎo)受阻，發(fā)揮麻醉作用[9]。研究表明，局部麻醉劑可誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡和壞死，對(duì)多種類型細(xì)胞產(chǎn)生毒性作用，但其相關(guān)機(jī)制尚不完全清楚[10]。丁哌卡因是一種酰胺類長(zhǎng)效局部麻醉藥物，具有作用時(shí)間長(zhǎng)、麻醉效果確切等優(yōu)點(diǎn)。Chapman 等[11]研究發(fā)現(xiàn)，丁哌卡因體外對(duì)軟骨腫瘤細(xì)胞具有明顯的細(xì)胞毒性，并具有劑量和時(shí)間依賴性。Ru 等[12]觀察局麻藥物對(duì)乳腺癌細(xì)胞株MDA-MB-231、MCF7 的影響發(fā)現(xiàn)，高濃度丁哌卡因可明顯抑制乳腺癌細(xì)胞的存活和遷移。細(xì)胞的異常增殖和凋亡是胰腺癌發(fā)生發(fā)展的首要條件，通過藥物抑制胰腺癌細(xì)胞的存活將可改善胰腺癌患者預(yù)后[13]。目前，丁哌卡因?qū)σ认侔┘?xì)胞增殖和凋亡的具體影響機(jī)制還未知。

細(xì)胞周期依賴性激酶抑制因子p21是腫瘤抑制因子，其表達(dá)增加可抑制細(xì)胞增殖[14]。Survivin 屬于凋亡抑制蛋白家族，可直接抑制caspase 3、7 的活性，阻斷凋亡信號(hào)通路，還可使腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞DNA 合成后期和有絲分裂期，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖[15]。Ki67 是細(xì)胞內(nèi)重要的增殖信號(hào)，其在細(xì)胞DNA 靜息期出現(xiàn)，DNA 合成期逐漸升高，有絲分裂期升至高峰，但有絲分裂結(jié)束后迅速降解，是反映細(xì)胞增殖活性的敏感指標(biāo)[16]。本研究結(jié)果顯示，2.5、5 mmol/L 丁哌卡因作用于PANC-1 細(xì)胞后，PANC-1 細(xì)胞增殖能力明顯降低，細(xì)胞凋亡率升高，p21 表達(dá)增加，Survivin、Ki67 表達(dá)減少，提示一定濃度丁哌卡因可抑制胰腺癌細(xì)胞PANC-1 的增殖，并誘導(dǎo)凋亡，可能是治療胰腺癌的潛在藥物。

腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生大量的ROS 可能是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的主要原因。一方面，ROS 的產(chǎn)生會(huì)消耗細(xì)胞內(nèi)抗氧化因子（SOD、GSH），導(dǎo)致氧化與抗氧化失衡，產(chǎn)生大量具有細(xì)胞毒性的氧化終產(chǎn)物MDA；另一方面，過量的ROS 可直接損傷細(xì)胞DNA 和線粒體，最終造成細(xì)胞損傷[17]。本研究中，胰腺癌細(xì)胞經(jīng)不同濃度丁哌卡因處理后，細(xì)胞ROS 含量和上清液MDA含量增加，SOD和GSH含量則減少，提示丁哌卡因可能通過影響胰腺癌細(xì)胞氧化應(yīng)激系統(tǒng)發(fā)揮作用，這與Cai等[18]研究結(jié)果相符。

局部麻醉劑具有高度脂溶性，可進(jìn)入線粒體影響其能量代謝。細(xì)胞凋亡早期，線粒體膜電位會(huì)降低，JC -1 以單體形式存在于線粒體中，其單體含量與線粒體膜電位呈負(fù)相關(guān)[19]。本研究結(jié)果顯示，丁哌卡因可增加胰腺癌細(xì)胞中JC-1單體含量，提示丁哌卡因可能通過降低線粒體膜電位，從而促進(jìn)胰腺癌細(xì)胞的凋亡。Bcl-2 家族是參與細(xì)胞凋亡的重要蛋白，當(dāng)Bcl-2 激活后，可引起線粒體外膜孔道的形成，促使細(xì)胞色素C 轉(zhuǎn)移至胞質(zhì)，級(jí)聯(lián)式活化caspase 3，執(zhí)行凋亡程序[20]。原癌基因c-Myc 蛋白產(chǎn)物位于細(xì)胞核，可控制DNA 轉(zhuǎn)錄，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖[21]。本研究結(jié)果還顯示，丁哌卡因可上調(diào)Bax/Bcl-2、cleaved cas 3/cas 3 水平，下調(diào)c-Myc 表達(dá)，進(jìn)一步驗(yàn)證了丁哌卡因?qū)ANC-1細(xì)胞促凋亡的作用。

綜上所述，高濃度丁哌卡因可誘導(dǎo)胰腺癌PANC-1 細(xì)胞增殖抑制和凋亡，提高細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激水平。但本研究?jī)H在細(xì)胞水平展示丁哌卡因?qū)σ认侔┑囊种谱饔眉俺醪椒肿訖C(jī)制，且效用濃度高于一般抗癌藥物的體外實(shí)驗(yàn)濃度，未來將對(duì)此展開研究，為臨床用藥提供理論依據(jù)。