王永芳，許玉芳，程艷波，李琳楠，曾培培，李偉霞，張成云

（鄭州市第一人民醫(yī)院，1.兒科，3.檢驗科，河南 鄭州 450004；2.河南省人民醫(yī)院兒科，河南 鄭州 450003）

近年來，難治性肺炎支原體肺炎（RMPP）發(fā)病率有上升趨勢，其病情進展快，重者可合并閉塞性細(xì)支氣管炎、壞死性肺炎等，并造成不同程度的肺外系統(tǒng)的損害，嚴(yán)重威脅患兒生命[1-2]。對RMPP 及早發(fā)現(xiàn)并盡早規(guī)范治療，有利于避免或減輕并發(fā)癥，改善RMPP 的預(yù)后。目前認(rèn)為，RMPP 的發(fā)病過程與免疫因素密切相關(guān)[3-4]。研究顯示TLR4/NF-κB信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路參與RMPP 的發(fā)生、發(fā)展[5-7]。本研究探討血清中TLR4、NF-κB 對RMPP 的預(yù)測價值，為臨床早期診治提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2020年6月—2022年7月鄭州市第一人民醫(yī)院兒科、河南省人民醫(yī)院兒科二病區(qū)收治的確診為MPP 的患兒69 例。其中普通MPP（MPP 組）36例，男19 例，女17 例，年齡（5.51±3.12）歲；RMPP（RMPP 組）33 例，男21 例，女12 例，年齡（5.74±3.14）歲。兩組性別、年齡、入院時病程及入院前治療情況等一般資料比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。本研究病例監(jiān)護人均知情同意并簽署同意書，并通過鄭州市第一人民醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號：2019-018。

1.2 納入、排除標(biāo)準(zhǔn)

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 所有病例入院時病程均在7 d 內(nèi)。符合MPP、RMPP 診斷標(biāo)準(zhǔn)[3]。MPP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)：有發(fā)熱、咳嗽等肺炎表現(xiàn)及影像學(xué)肺炎改變，單次檢測血清Mp-IgM 滴度≥1∶160。RMPP 的診斷標(biāo)準(zhǔn)：在確診MPP的前提下，經(jīng)大環(huán)內(nèi)酯類抗菌藥物正規(guī)治療7 d 及以上，仍持續(xù)發(fā)熱，臨床征象及肺部影像學(xué)加重者。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 合并其他病原體感染者，合并其他呼吸系統(tǒng)疾病和/或其他系統(tǒng)原發(fā)疾病者，免疫功能低下者等。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)本采集及保存 入院后12 h 內(nèi)采外周靜脈血3 mL。標(biāo)本血均在3 h 內(nèi)于3 000 r/min 離心20 min，取上清液置于-80 ℃冰箱保存待檢測。

1.3.2 標(biāo)本檢測 采用酶聯(lián)免疫吸附法[試劑盒購自上海酶聯(lián)生物有限公司，批號：E20220217-10223A（TLR4）；E20220217-15430A（NF-κB）]檢測血清TLR4、NF-κB 水平，具體操作嚴(yán)格按說明書進行。主要步驟如下：將標(biāo)準(zhǔn)品稀釋后加樣，待測樣品孔中先加樣品稀釋液40 μL，然后再加待測樣品10 μL（樣品最終稀釋度為5 倍）。每孔加入酶標(biāo)試劑100 μL。封板置37 ℃溫育60 min。棄液，甩干，每孔加滿稀釋后的洗滌液，靜置30 s 后棄去，重復(fù)5 次，拍干。加入顯色劑A、B各50 μL，混勻，37 ℃避光顯色15 min。每孔加終止液終止反應(yīng)。450 nm波長依序測量各孔的吸光度；經(jīng)過標(biāo)準(zhǔn)曲線換算計算出濃度值。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理

應(yīng)用SPSS 26.0 統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析。正態(tài)分布計量資料用（）表示，并進行方差齊性檢驗，兩組間比較使用t檢驗。計數(shù)資料采用卡方檢驗。采用相關(guān)分析法分析相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性。采用ROC 曲線及AUC（95%CI）評估檢測指標(biāo)的診斷價值。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組患兒一般資料比較

RMPP 組與MPP 組兩組患兒性別、年齡、入院時病程、入院前治療情況（僅抗病毒治療，僅抗細(xì)菌治療，抗病毒+抗細(xì)菌治療，應(yīng)用大環(huán)內(nèi)酯類藥物等）比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），見表1。

表1 兩組患兒一般資料比較(±s)Table 1 Comparison of general data between the two groups

表1 兩組患兒一般資料比較(±s)Table 1 Comparison of general data between the two groups

組別RMPP組MPP組t/χ2值P值性別（男/女，例）21/12 19/17 0.465＞0.05年齡/歲5.74±3.14 5.51±3.12-0.302＞0.05入院時病程/d 4.88±0.992 4.47±0.972 1.720＞0.05

2.2 兩組患兒血清中TLR4、NF-κB水平比較

比較兩組患兒血清中TLR4、NF-κB 水平，RMPP 組高于MPP 組（t＝6.382、9.850，P＜0.05），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 兩組患兒血清TLR4、NF-κB表達水平比較Table 2 Comparison of expression levels of TLR4 and NF-κB between the two groups(±s)

表2 兩組患兒血清TLR4、NF-κB表達水平比較Table 2 Comparison of expression levels of TLR4 and NF-κB between the two groups(±s)

組別RMPP組MPP組t值P值例數(shù)33 36 TLR4/（ng·mL-1）10.43±2.55 6.76±2.22 6.382＜0.05 NF-κB/（pg·mL-1）732.73±119.53 455.73±114.04 9.850＜0.05

2.3 TLR4、NF-κB水平與RMPP的相關(guān)性分析

用Pearson 相關(guān)分析法分析TLR4 與NF-κB 水平呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)r=0.610，P＜0.05。見圖1。用Spearman 相關(guān)性分析法分析，TLR4、NF-κB 與RMPP 呈正相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是0.642、0.791，均P＜0.05。

圖1 TLR4與NF-κB水平散點圖Figure 1 Scatter plot of TLR4 and NF-κB levels

2.4 血清中TLR4、NF-κB對RMPP的診斷價值

進一步探討TLR4、NF-κB 水平對RMPP診斷價值，繪制了ROC 曲線，用Youden 法確定具有診斷RMPP 的最大敏感度和特異度的臨界值。當(dāng)TLR4水平為8.36 ng/mL 時，AUC 為0.871（95%CI：0.792～0.951），其預(yù)測敏感度為84.8%，特異度為72.2%。當(dāng)NF-κB 水平為572.12 pg/mL 時，AUC 為0.957（95%CI：0.916～0.998），其預(yù)測RMPP 的敏感度為97.0%，特異度為83.3%。TLR4、NF-κB 兩者聯(lián)合檢測，預(yù)測RMPP的敏感度為90.9%，特異度為94.4%。見圖2，表3。

圖2 TLR4、NF-κB及兩者聯(lián)合預(yù)測RMPP的ROC曲線Figure 2 ROC curve of TLR4、NF-κB and their combined results for RMPP prediction

表3 TLR4、NF-κB及兩者聯(lián)合預(yù)測RMPP分析Table 3 Analyses of TLR4、NF-κB and their combined results for RMPP prediction

2.5 發(fā)展為RMPP的多因素logistic回歸分析

對兩指標(biāo)進行多因素logistic 回歸分析結(jié)果顯示：血清TLR4＞8.36 ng/mL（OR=1.918，95%CI：1.058～3.479，P=0.032）及NF-κB＞572.12 pg/mL（OR=1.028，95%CI：1.008～1.046，P=0.004）是發(fā)展為RMPP的獨立危險因素。見表4。

表4 RMPP發(fā)生的相關(guān)因素logistic回歸分析Table 4 Logistic regression analyses of factors related to RMPP

3 討論

RMPP 可合并嚴(yán)重肺內(nèi)外并發(fā)癥，嚴(yán)重影響患兒生命質(zhì)量。在實際臨床中，對RMPP 進行早期診斷并及時規(guī)范治療，對改善預(yù)后極為重要[8]。在RMPP的發(fā)生發(fā)展過程中，免疫機制起著關(guān)鍵作用，表現(xiàn)出強烈的細(xì)胞炎癥反應(yīng)及免疫應(yīng)答[3，9]。支原體（mycoplasma pneumoniae，MP）細(xì)胞膜表面富含脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白等，是TLR4 的配體，可跨細(xì)胞膜傳遞信號，觸發(fā)大量炎癥因子釋放[10-11]。MP 感染機體，被TLR4 識別，并激活TLR4/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，誘導(dǎo)TNF-α、IL-6、IL-8 等多種細(xì)胞因子過度表達，造成呼吸道上皮損傷，同時引起不同程度的自身免疫性損害[12-14]。研究[15-17]已證實，TLR4、NF-κB與MP感染肺內(nèi)外并發(fā)癥的發(fā)生密切相關(guān)。

本研究顯示，RMPP患兒外周血中TLR4、NF-κB表達水平高于普通MPP組（t=6.382、9.850），差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05），與相關(guān)研究[5]結(jié)果一致。此結(jié)果提示TLR4、NF-κB水平與支原體肺炎嚴(yán)重程度可能存在一定相關(guān)性，并參與RMPP發(fā)生、進展。多因素logistic 回歸分析結(jié)果顯示：血清TLR4＞8.36 ng/mL、NF-κB＞572.12 pg/mL 時，TLR4、NF-κB 是發(fā)展為RMPP 的獨立危險因素。TLR4 識別MP 細(xì)胞膜表面脂質(zhì)相關(guān)膜蛋白后，激活下游信號分子，如髓樣化蛋白等，使相關(guān)的蛋白激酶磷酸化，進而活化NF-κB 進入細(xì)胞核調(diào)控相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄[13-14，18]。TLR4/NF-κB 信號通路在促進炎癥反應(yīng)及導(dǎo)致炎癥級聯(lián)放大中起關(guān)鍵作用[19]。近年來，有研究通過調(diào)控TLR4/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來改善MP 感染所致的炎癥級聯(lián)反應(yīng)及組織損傷[20-21]。因此，本研究選擇RMPP 患兒血清TLR4、NF-κB 水平為研究切入點，以期尋找更有價值的RMPP 早期預(yù)測指標(biāo)。本研究對數(shù)據(jù)進行相關(guān)性分析顯示，TLR4、NF-κB 與RMPP 呈一定的相關(guān)性（rs=0.642、0.791，均P＜0.05），提示TLR4、NF-κB 對RMPP 早期有一定預(yù)測作用。進而，運用ROC 曲線分析顯示，TLR4 值為8.36 ng/mL 時，診斷出RMPP 的敏感度是84.8%，特異度72.2%；當(dāng)NF-κB 值為572.12 pg/mL 時，診斷出RMPP 的敏感度是97.0%，特異度83.3%。TLR4（AUC=0.871）及NF-κB（AUC=0.957）對RMPP 有一定預(yù)測價值。且本研究結(jié)果顯示：TLR4、NF-κB 聯(lián)合檢測（AUC=0.973）對RMPP 的預(yù)測敏感度為90.9%，特異度94.4%。

近年來，通過干預(yù)TLR4/NF-κB 信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來改善和治療相關(guān)疾病已成為研究熱點[20-22]。RMPP 患兒早期血清中TLR4、NF-κB 表達水平明顯升高，血清TLR4、NF-κB對RMPP有一定預(yù)測價值，且兩者聯(lián)合檢測診斷價值明顯提升，可用于指導(dǎo)臨床。TR4、NF-κB 檢測成本不高，較宜在臨床推廣。今后研究期望通過調(diào)控TLR4/NF-κB 信號通路證實其能阻止RMPP 的發(fā)生發(fā)展，使之成為RMPP 臨床治療的新靶點。

綜上所述，RMPP 早期患兒血清中TLR4、NF-κB 表達水平增高，對RMPP 的診斷有一定預(yù)測價值，且為其獨立危險因素。本研究結(jié)果為臨床早期診治RMPP提供了依據(jù)。