陳孟璋，何星垚，林漢森

（廣州廣藥益甘生物制品股份有限公司，廣東 廣州 511495）

慢性乙型肝炎（chronic Hepatitis B，CHB）是由乙型肝炎病毒（Hepatitis B virus，HBV）持續(xù)感染引起的肝臟慢性炎癥性疾病。據(jù)估計，當前我國一般人群乙肝表面抗原流行率為5%～6%，即7 000 萬例左右的慢性HBV 感染者，其中慢性乙型肝炎患者約為2 000～3 000 萬例[1]，說明慢性乙型肝炎仍然是嚴重影響我國人民健康的公共衛(wèi)生問題。

DNA 疫苗的研究始于20 世紀90 年代，被稱為第3 代疫苗技術(shù)，其特點是可在宿主細胞中表達出相應(yīng)抗原蛋白，誘導(dǎo)機體產(chǎn)生體液和細胞免疫應(yīng)答[2]，有望在CHB 治愈中發(fā)揮作用。治療性HBV DNA 疫苗是有自主知識產(chǎn)權(quán)、正在開展II 期臨床試驗、以治療CHB 為目標的DNA 疫苗[3]，它采用基因重組技術(shù)構(gòu)建HBV 包膜中蛋白（preS2+S）基因真核表達質(zhì)粒并轉(zhuǎn)入大腸桿菌中，通過工程菌發(fā)酵、裂解和純化工藝進行質(zhì)粒制備[4]。隨著核酸疫苗工藝的發(fā)展，在上述工藝過程中，質(zhì)?？截悢?shù)（plasmid copy number, PCN）作為一個重要控制參數(shù)越來越受到重視。PCN 是指每個細菌細胞中質(zhì)粒相對于基因組染色體的數(shù)量[5]，是質(zhì)粒本身的固有特性。較高的PCN 是細胞分裂后質(zhì)粒在子細胞中均衡分布的關(guān)鍵條件[6]，對基因工程菌發(fā)酵中質(zhì)粒的收獲量或重組蛋白的表達量有直接影響。因此，通過PCN 檢測篩選高PCN 的工程菌作為菌種建庫的來源顯得十分重要。此外，在菌種傳代穩(wěn)定性研究和發(fā)酵條件優(yōu)化時，都需要對PCN 進行考察。

經(jīng)典的PCN 檢測方法包括氯化銫-溴乙錠梯度離心法、凝膠電泳檢測法、高效液相色譜法和毛細管電泳法，點雜交和southern 雜交也可用于PCN 檢測，但上述方法普遍存在費時費力、靈敏度不高或重復(fù)性穩(wěn)定性較差的問題[7]。近年來，實時定量PCR（real-time quantitative PCR, qPCR）技術(shù)因具有靈敏度高、操作簡便、重復(fù)性較好等優(yōu)點，被越來越多地應(yīng)用于PCN 檢測。本研究使用qPCR 技術(shù)，采用絕對定量方法和相對定量方法分別測定治療性HBV DNA 疫苗工程菌PCN，同時，比較不同的總DNA 提取方法對測定結(jié)果的影響，為建立快速簡便的治療性HBV DNA 疫苗工程菌PCN 測定方法提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料

治療性HBV DNA 疫苗工程菌及其質(zhì)粒pS2.S為本公司保存；大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞、限制性內(nèi)切酶EcoR I和Xho I、高保真PCR 酶PrimeSTAR Max DNA Polymerase、連接酶T4 DNA Ligase、DL10 000 和DL5 000 DNA marker 及qPCR 預(yù)混試劑TB Green Premix Ex Taq II（Tli RNaseH Plus）等分子生物學(xué)試劑均為Takara 公司產(chǎn)品；細菌基因組DNA 提取試劑盒、質(zhì)粒小提中量試劑盒和通用型DNA 純化回收試劑盒均為天根生化科技（北京）有限公司產(chǎn)品；引物合成、基因序列測序均由生工生物工程（上海）股份有限公司完成。

1.2 主要儀器

CFX96 Touch 實時定量PCR 儀（美國BIO-RAD公司）；NanoDrop One 微量紫外-可見光分光光度計（美國Thermo Fisher 公司）；Tanon 3500R 全自動數(shù)碼凝膠圖像分析系統(tǒng)（上海天能生命科學(xué)有限公司）；PowerPac Basic 電泳儀（美國BIO-RAD 公司）；Thermal Cycler Block 5020 PCR 儀（美國Thermo Fisher 公司）；Centrifuge 5418 R 冷凍離心機（德國Eppendorf 公司）；DKZ-2 型電熱恒溫振蕩水槽（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；HZQ-X500C 恒溫振蕩培養(yǎng)箱（上海一恒科學(xué)儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 引物設(shè)計及合成 根據(jù)NCBI 數(shù)據(jù)庫發(fā)布的大腸桿菌基因組序列（NC_000913.3）以及pS2.S 質(zhì)粒的載體pcDNA3.1+序列（MN996867.1），選取基因組上單拷貝基因Thrb作為內(nèi)參基因，pcDNA3.1+載體上多克隆位點以外的序列（以下稱為Pd）作為目的基因，設(shè)計合成3 對引物（表1），其中，第1 對引物用于擴增Thrb基因全長序列，以構(gòu)建重組質(zhì)粒標準品；剩余2 對引物用于qPCR 擴增，預(yù)期片段長度均為116 bp。

1.3.2 質(zhì)粒與細菌總DNA 制備 質(zhì)粒提取使用質(zhì)粒小提中量試劑盒，按照相關(guān)說明和要求進行操作。細菌總DNA 的制備分為3 種方法，為了保證后續(xù)qPCR 實驗結(jié)果可比性，不同培養(yǎng)批次的工程菌培養(yǎng)液提取總DNA 前A600均調(diào)至1.0，且最后處理得到的樣品體積都定量為1 mL。第1 種方法是使用細菌基因組DNA 提取試劑盒，按照相關(guān)說明和要求，取1 mL 工程菌培養(yǎng)液進行提取操作，最后用1 mL 滅菌去離子水洗脫；第2 種方法是使用0.1%Triton X-100 處理[8]，具體為：取1 mL 工程菌培養(yǎng)液，12 000 r/min 離心5 min，小心吸去上清，使用1 mL 0.1% Triton X-100 重懸菌體，沸水浴處理10 min 后，馬上置于-20 ℃冷凍保存，使用前融化并12 000 r/min 離心5 min，取上清備用；第3 種方法為：取1 mL 工程菌培養(yǎng)液，沸水浴處理10 min后，馬上置于-20 ℃冷凍保存，使用前融化并離心，取上清備用。

1.3.3 重組質(zhì)粒構(gòu)建 以工程菌基因組為模板，使用引物CThrb-F 和CThrb-R 進行Thrb基因全長序列的PCR 擴增，反應(yīng)體系50 μL，反應(yīng)條件為：98 ℃30 s 預(yù)變性，98 ℃10 s、55 ℃5 s、72 ℃20 s，共30 個循環(huán)，最后72 ℃繼續(xù)延伸1 min。PCR 產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，再使用EcoR I和Xho I雙酶切，并清潔回收；pS2.S 質(zhì)粒同樣使用EcoR I和Xho I雙酶切，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后純化回收，得到pcDNA3.1+線性化載體；將線性化載體與雙酶切的ThrbPCR 片段進行連接并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，涂布到氨芐抗性平板上培養(yǎng)，挑選單克隆進行雙酶切和PCR 鑒定后送測序，鑒定正確后提取重組質(zhì)粒備用。該重組質(zhì)粒命名為pTB，用于qPCR 絕對定量的標準曲線制作。

1.3.4 實時定量PCR qPCR 在伯樂CFX96 實時定量PCR 儀上進行，反應(yīng)體系為20 μL，其中TB Green Premix Ex Taq II 10 μL，上下游引物各0.8 μL（終濃度0.4 μmol/L），DNA 模板0.4 μL，滅菌去離子水補至20 μL。每個反應(yīng)設(shè)置3 個重復(fù)樣品孔，反應(yīng)程序為：95 ℃預(yù)變性30 s；95 ℃變性5 s，60 ℃復(fù)性和延伸30 s 并讀板，共40 個循環(huán)。隨后進行熔解曲線分析以驗證引物特異性。

1.3.5 標準曲線建立 測定重組質(zhì)粒pTB 的濃度（ng/μL），根據(jù)下述公式[9]計算其拷貝數(shù)，然后10 倍稀釋為109、108、107、106、105拷貝/μL，作為建立標準曲線的模板。

反應(yīng)結(jié)束后，以測得的Ct值為縱坐標，以模板拷貝數(shù)的對數(shù)為橫坐標，進行線性回歸分析，分別制作內(nèi)參基因Thrb和目的基因Pd的標準曲線。擴增效率（E）與斜率（k）的關(guān)系如下公式：

1.3.6 絕對定量和相對定量計算質(zhì)粒拷貝數(shù) 絕對定量計算方法為：根據(jù)標準曲線線性回歸方程公式，分別計算待測樣品中內(nèi)參基因和目的基因的拷貝數(shù)。本研究中選取的內(nèi)參基因Thrb編碼高絲氨酸激酶，為大腸桿菌基因組染色體上的單拷貝基因，因此其數(shù)量即代表大腸桿菌基因組染色體的數(shù)量。根據(jù)PCN 定義，以目的基因拷貝數(shù)除以內(nèi)參基因拷貝數(shù)即得到PCN。

相對定量計算方法為：在進行相對定量計算之前，以不同稀釋度的樣品目的基因Ct值與內(nèi)參基因Ct值的差值ΔCt作為縱坐標，以拷貝數(shù)對數(shù)作為橫坐標進行繪圖，如線性回歸方程斜率趨近于0，即可按照ΔΔCt計算方法進行[10]，公式如下：

其中，E為目的基因擴增效率；ΔΔCt為待測樣品ΔCt與對照樣品ΔCt的差值；ΔCt為目的基因與內(nèi)參基因的Ct值之差。

1.3.7 統(tǒng)計學(xué)處理 實驗數(shù)據(jù)采用MiniTab 軟件進行統(tǒng)計分析，采用雙樣本t檢驗，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組質(zhì)粒構(gòu)建

以治療性雙質(zhì)粒HBV DNA 疫苗工程菌提取的總DNA 為模板，使用Thrb-F/Thrb-R 引物PCR 擴增得到Thrb基因全長序列，雙酶切后克隆至同樣雙酶切的pcDNA3.1+載體上，轉(zhuǎn)化DH5α，挑選單克隆進行PCR、雙酶切鑒定，結(jié)果如圖1，目的條帶大小約949 bp，與預(yù)期相符。進一步測序結(jié)果表明成功構(gòu)建了pTB 質(zhì)粒，作為后續(xù)qPCR 建立標準曲線使用的質(zhì)粒標準品。

圖1 pTB質(zhì)粒鑒定Figure 1 Identification of pTB

2.2 引物特異性確認

引物特異性通過熔解曲線分析以及PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳進行確認。引物QThrb-F/QThrb-R 和QPd-F/QPd-R 擴增得到的PCR 產(chǎn)物，經(jīng)熔解曲線分析均為單一峰型（圖2）。兩對引物擴增的目的片段大小均為116 bp，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳分析，目的條帶特異性好，無非特異性擴增（圖3）。

圖2 Thrb（a）和Pd（b）的qPCR產(chǎn)物熔解曲線分析Figure 2 Melting curve analysis of qPCR products of Thrb（a）and Pd（b）

圖3 qPCR產(chǎn)物電泳Figure 3 Electrophoresis of qPCR products

2.3 標準曲線建立

以pTB 質(zhì)粒作為模板，在109、108、107、106、105拷貝/μL 濃度范圍內(nèi)，分別以內(nèi)參基因Thrb和目的基因Pd的Ct值對模板起始拷貝數(shù)的對數(shù)制作標準曲線，如圖4，結(jié)果表明兩條曲線均具有較好的線性相關(guān)（R2＞0.99），斜率分別為0.998 8和0.999 5，根據(jù)公式計算出相對應(yīng)的擴增效率為99.31% 和100.32%，符合qPCR的要求。

圖4 Thrb（a）和Pd（b）的標準曲線建立Figure 4 Construction of the standard curves for Thrb（a）and Pd（b）

2.4 相對定量方法的確認

以“2.3”中所述樣品的目的基因與內(nèi)參基因Ct值的差值ΔCt作為縱坐標、以起始拷貝數(shù)對數(shù)作為橫坐標進行繪圖，結(jié)果如圖5，斜率為0.024 1，趨近于0，表明本研究中目的基因與內(nèi)參基因的擴增效率滿足用ΔΔCt計算方法的條件。

圖5 ΔΔCt計算的條件驗證Figure 5 Validation of the ΔΔCt calculation

2.5 質(zhì)?？截悢?shù)計算

按照絕對定量方法測定治療性HBV DNA 疫苗工程菌中pS2.S 質(zhì)粒的拷貝數(shù)，試劑盒提取法的結(jié)果為43.10±4.02，Triton X-100 煮沸法的結(jié)果為69.32±6.51，培養(yǎng)基煮沸法的結(jié)果為75.73±7.46（表2）。試劑盒提取法分別與Triton X-100 煮沸法、培養(yǎng)基煮沸法相比，結(jié)果差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Triton X-100 煮沸法與培養(yǎng)基煮沸法相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表2 絕對定量方法測定質(zhì)粒拷貝數(shù)Table 2 Determination of PCN by absolute quantification

按照相對定量方法測定治療性HBV DNA 疫苗工程菌中pS2.S 質(zhì)粒的拷貝數(shù)，試劑盒提取法的結(jié)果為42.92±3.98，Triton X-100 煮沸法的結(jié)果為68.58±6.42，培養(yǎng)基煮沸法的結(jié)果為76.15±7.50（表3）。試劑盒提取法分別與Triton X-100煮沸法、培養(yǎng)基煮沸法相比，結(jié)果差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01）；Triton X-100 煮沸法與培養(yǎng)基煮沸法相比，結(jié)果差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

表3 相對定量方法測定質(zhì)?？截悢?shù)Table 3 Determination of PCN by relative quantification

任意一種總DNA制備方法，比較其絕對定量和相對定量測定的PCN 結(jié)果，差異均無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。

3 討論

qPCR 通過實時監(jiān)測PCR 擴增反應(yīng)中每一個循環(huán)產(chǎn)生的熒光信號，實現(xiàn)對樣本中任意起始靶序列的定性和定量分析，在生物學(xué)、醫(yī)藥學(xué)的研究和檢測被廣泛應(yīng)用。qPCR 分為熒光染料法和探針法，本研究采用SYBR GREEN I 熒光染料法，優(yōu)點是操作簡便且成本較低。由于SYBR GREEN I 能夠在PCR 擴增時嵌入任何新合成的雙鏈DNA 分子中并發(fā)出熒光信號，引物二聚體的積累和非特異性擴增產(chǎn)物都會被檢測到[11]，導(dǎo)致檢測結(jié)果偏差，因此要求引物具有良好的特異性。研究中設(shè)計的qPCR 引物均經(jīng)過BLAST檢索，確認在樣本中不存在其他相似序列，并通過PCR 產(chǎn)物的瓊脂糖凝膠電泳和溶解曲線分析進一步確證其特異性。

本研究分別采用絕對定量和相對定量的方法對治療性HBV DNA 疫苗工程菌的PCN 進行測定。2 種方法各有優(yōu)缺點，前者需構(gòu)建標準品質(zhì)粒，且每次檢測時都需要建立標準曲線，操作相對繁瑣；后者不需建立標準曲線，但要求每次檢測兩對引物擴增效率相近。為滿足相對定量的要求，本研究選擇的兩對引物擴增片段均為116 bp，且Tm 值等參數(shù)均相近，并通過實驗驗證擴增效率相近。在此基礎(chǔ)上，兩種定量方法測定不同樣品制備方法得到的PCN 結(jié)果差異不大，經(jīng)檢驗差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），這與Lee 等[12]的研究結(jié)果一致，表明在合理設(shè)計的前提下，絕對定量和相對定量兩種方法均適用于治療性HBV DNA 疫苗工程菌PCN 檢測。

為了探索不同的樣品制備辦法對PCN 檢測的影響，本研究采用了3 種方法制備樣品。無論是絕對定量還是相對定量檢測，試劑盒提取的總DNA樣品的PCN 均明顯低于Triton X-100 煮沸法和培養(yǎng)基煮沸法，經(jīng)統(tǒng)計學(xué)分析差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.01），這可能與基因組DNA 提取試劑盒對于大片段DNA和小片段DNA純化收率不同有關(guān)。試劑盒純化的原理是DNA 片段在一定條件下選擇性吸附于硅基質(zhì)膜吸附柱上，不同的pH 值和鹽離子對DNA 片段的吸附能力不同[13]，付立霞等[14]就此類試劑盒純化基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 的效率進行比較，結(jié)果顯示基因組DNA 的回收率高于質(zhì)粒DNA，這可能是造成試劑盒提取法中PCN 偏低的原因。而兩種煮沸法處理步驟相對簡單，通過加熱和冷凍的物理方法破裂細胞，基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 均得到較好的釋放，因此檢測得到的PCN 更高，且更接近真實值。Triton X-100 煮沸法與培養(yǎng)基煮沸法相比，其PCN 差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05），但無論內(nèi)參基因還是目的基因，Triton X-100 煮沸法的Ct值均低于培養(yǎng)基煮沸法，表明其模板含量更高，這可能與樣品經(jīng)Triton X-100處理有關(guān)。Triton X-100作為一種溫和的表面活性劑，可以使細胞破裂，促進宿主蛋白變性沉淀，將核酸釋放到水相中，起到分離核酸的作用[15]。因此，Triton X-100煮沸法處理的樣品中細胞破裂效率更高，基因組DNA 和質(zhì)粒DNA 得到充分釋放，從而在后續(xù)qPCR 實驗中獲得更低的Ct值?？紤]到其成本低、效率高及操作快速便捷的優(yōu)勢，Triton X-100煮沸法更適合用于治療性HBV DNA 疫苗工程菌PCN 快速檢測的總DNA 模板制備。