李蘇亞，劉亞雄，羅卓雅，

（1.廣州中醫(yī)藥大學(xué)中藥學(xué)院，廣東 廣州 510006；2.廣東省藥品檢驗(yàn)所/國家藥品監(jiān)督管理局藥品快速檢驗(yàn)技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510663）

砂仁是姜科豆蔻屬陽春砂（Amomum villosumLour.）、綠殼砂（Amomum villosumLour.var.xanthioidesT.L.WuetSenjen）或海南砂（Amomum longiligulareT.L.Wu）的干燥成熟果實(shí)，是我國著名的“四大南藥”之一[1]。陽春砂主產(chǎn)于廣東，以廣東陽春為道地產(chǎn)區(qū)，目前市場上存在以次充好、以假亂真的現(xiàn)象，使用非道地陽春砂替代道地陽春砂，擾亂市場秩序[2-3]。因此，準(zhǔn)確、快速地鑒別道地與非道地陽春砂尤為重要。

目前，文獻(xiàn)報(bào)道的鑒別砂仁品種的方法有性狀鑒別法[2]、高效薄層色譜法（HPTLC）[4]、GC-MS法[5-6]、HPLC 法[7]、DNA 條形碼[8]、電子鼻技術(shù)[9]等。性狀鑒別法需要經(jīng)驗(yàn)輔助，易受主觀因素影響；HPTLC 和HPLC 法樣品前處理復(fù)雜，且分析周期較長；GC-MS 可以建立特征性指紋圖譜，靈敏度高且定性能力強(qiáng)，但儀器設(shè)備昂貴，檢測成本高；DNA條形碼技術(shù)具有高效、精確、易操作的優(yōu)點(diǎn)，但需要建立DNA 條形碼數(shù)據(jù)庫，成本過高；電子鼻技術(shù)具有快速便捷的優(yōu)點(diǎn)，但易受環(huán)境因素干擾，分辨率低。

氣相色譜-離子遷移譜（gas chromatography-ion mobility spectrometry,GC-IMS）是氣相色譜（GC）與離子遷移譜（IMS）的結(jié)合，主要用于揮發(fā)性和半揮發(fā)性有機(jī)化合物的痕量檢測。GC-IMS 主要由毛細(xì)管柱、電離源、遷移管、法拉第盤組成。復(fù)雜的化合物首先在氣相色譜的毛細(xì)管柱中得到分離，再以單個(gè)化合物進(jìn)入遷移管，最后化合物按照遷移速率由快到慢、通過漂移管所需時(shí)間由短到長的順序到達(dá)法拉第盤被接收，依次出峰，獲得具有保留時(shí)間、遷移時(shí)間和信號(hào)強(qiáng)度的三維譜圖（圖1）[10]。GC-IMS不需要真空泵，具有儀器使用成本低、便攜的優(yōu)點(diǎn)[11-12]，已經(jīng)廣泛應(yīng)用于中藥鑒別領(lǐng)域[13-17]，包括中藥道地藥材的鑒定[15]、區(qū)分收獲期和貯藏時(shí)間[16-17]和中藥炮制方法[18]等研究。

圖1 GC-IMS的原理圖Figure 1 Schematic diagram of GC-IMS

主成分分析（principal component analysis,PCA）作為一種探索性的方法，從數(shù)據(jù)矩陣中提取的信息由相互正交的主成分（PCs）來解釋，多用于研究數(shù)據(jù)結(jié)構(gòu)和搜索樣本的聚類，常與其他監(jiān)督方法結(jié)合使用，如線性辨別分析、K 鄰近算法（k-nearest neighbors algorithm,KNN）等[19]。

本文擬采用頂空-氣相色譜-離子遷移譜（headspacegas chromatography-ion mobility spectrometry,HS-GC-IMS）結(jié)合PCA 和KNN 法對(duì)道地與非道地陽春砂進(jìn)行檢測分析，以實(shí)現(xiàn)陽春砂的道地性鑒別。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

HS-GC-IMS 儀（德國G.A.S.公司）；MS204S 萬分之一電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）。

1.2 樣品

50 批陽春砂來自廣東陽春、廣西平樂縣和云南保山，經(jīng)廣東省藥品檢驗(yàn)所中藥室李華主任藥師鑒定為姜科豆蔻屬陽春砂（Amomum villosumLour.）的干燥成熟果實(shí)，樣品信息詳見表1。

表1 樣品信息Table 1 Sample information

2 方法

2.1 樣品前處理

精密稱取陽春砂藥材1.0 g 于20 mL 頂空進(jìn)樣瓶中，每個(gè)樣品平行測定2次。

2.2 分析條件

色譜柱：MXT-5弱極性色譜柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm，美國Restek 公司）和MXT-WAX 強(qiáng)極性色譜柱（15 m×0.53 mm，1.0 μm，美國Restek 公司）；柱溫：80 ℃；載氣/漂移氣：氮?dú)?；載氣流量：0～5 min，5～15 mL/min；5～10 min，15～45 mL/min；10～12 min，45～125 mL/min；12～20 min，125 mL/min；進(jìn)樣針溫度：85 ℃；進(jìn)樣體積：0.1 mL；頂空溫度：60 ℃；頂空孵育時(shí)間：10 min；遷移管長度98 mm；遷移管溫度：80 ℃；遷移氣體流量：150 mL/min；電離源：氚放射性電離源，平均輻射能量5.68 keV；采集方式：正離子模式。

2.3 數(shù)據(jù)處理

采用儀器配套的分析軟件LAV（laboratory analytical viewer）對(duì)陽春砂的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行分析；采用LAV 中的Reporter 插件對(duì)比樣品間的圖譜差異，并采用Gallery Plot 插件進(jìn)行陽春砂特征峰的指紋圖譜對(duì)比，對(duì)比樣品間的揮發(fā)性物質(zhì)的差異；運(yùn)用Int Dynamic Principal Components Analysis（Int Dynamic PCA）插件對(duì)陽春砂進(jìn)行主成分分析；采用Matlab R2022b 軟件對(duì)處理后的CSV 數(shù)據(jù)進(jìn)行PCA 降維，建立KNN 分類模型，分別選擇40批道地陽春砂和10 批非道地陽春砂中75%的樣品作為訓(xùn)練集，25%的樣品作為預(yù)測集，最近鄰居數(shù)量為3，計(jì)算識(shí)別準(zhǔn)確率。

3 結(jié)果與分析

3.1 色譜柱的選擇

分別考察MXT-5 弱極性色譜柱和MXT-WAX強(qiáng)極性色譜柱，2種色譜柱的典型圖譜分別見圖2和圖3?？梢?，2 種色譜柱均能檢測出陽春砂揮發(fā)性成分。

圖3 MXT-WAX色譜柱鑒別陽春砂的代表圖譜Figure 3 Representative graphs of identification of Amomum villosum using MXT-WAX column

采用MXT-5 弱極性色譜柱檢測獲得9 個(gè)陽春砂揮發(fā)性特征峰，其中道地陽春砂揮發(fā)性特征峰4個(gè)，非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰5個(gè)，其PCA圖如圖4A，PC-1與PC-2累計(jì)貢獻(xiàn)率為84%。

圖4 MXT-5色譜柱（A）和MXT-WAX色譜柱（B）分別鑒別50批陽春砂的主成分分析Figure 4 Identification of principal component analysis of 50 batches of Amomum villosum using MXT-5 column（A）and MXTWAX column（B）

采用MXT-WAX 強(qiáng)極性色譜柱檢測獲得13 個(gè)陽春砂揮發(fā)性特征峰，其中包括道地陽春砂揮發(fā)性特征峰3 個(gè)，非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰10 個(gè)，其PCA 圖如圖4B 所示，PC-1 與PC-2 累計(jì)貢獻(xiàn)率為88%。因此，采用MXT-WAX 強(qiáng)極性色譜柱能更好地區(qū)分道地與非道地陽春砂。

3.2 取樣量的優(yōu)化

分別稱取陽春砂1-1 和9-1 樣品各0.5、1.0、1.5 g，進(jìn)樣體積0.1 mL，于60 ℃孵育10 min，考察取樣量對(duì)揮發(fā)性特征峰的影響，結(jié)果見圖5?？梢?，道地和非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰的總響應(yīng)強(qiáng)度隨著取樣量的增加而增強(qiáng)，但強(qiáng)度過高時(shí)某些峰分離度減少，不利于特征峰建立，同時(shí)容易導(dǎo)致儀器污染。因此，選擇取樣量為1.0 g。

3.3 頂空溫度的優(yōu)化

分別稱取陽春砂1-1和9-1樣品各1.0 g，固定進(jìn)樣體積0.1 mL，分別于40、50、60、70、80 ℃孵育10 min，考察頂空溫度對(duì)揮發(fā)性特征峰的影響，結(jié)果見圖6。可見，頂空溫度在40～60 ℃范圍內(nèi)，道地和非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰的總響應(yīng)強(qiáng)度隨著溫度的升高而增強(qiáng)，然而隨著溫度的進(jìn)一步增加，其總響應(yīng)強(qiáng)度整體呈下降趨勢。因此，選擇頂空溫度為60 ℃。

圖6 頂空溫度的優(yōu)化Figure 6 Optimization of headspace temperature

3.4 進(jìn)樣體積的優(yōu)化

分別稱取陽春砂1-1 和9-1 樣品各1.0 g，于60 ℃孵育10 min，分別頂空進(jìn)樣0.1、0.2、0.5 mL，考察頂空進(jìn)樣體積對(duì)揮發(fā)性特征峰的影響，結(jié)果見圖7?？梢姡赖睾头堑赖仃柎荷疤卣鞣宓目傢憫?yīng)強(qiáng)度隨著進(jìn)樣體積的增加而降低；非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰5、6、7 和道地陽春砂揮發(fā)性特征峰3 的峰強(qiáng)度隨著頂空進(jìn)樣體積的增加而增強(qiáng)，而非道地陽春砂揮發(fā)性特征峰2、4、8、9、10 與道地陽春砂揮發(fā)性特征峰1、2 的峰強(qiáng)度隨著頂空進(jìn)樣體積的增加而降低，這可能與共流出物與目標(biāo)物競爭反應(yīng)物離子中的質(zhì)子有關(guān)[20]。因此，選擇頂空進(jìn)樣體積為0.1 mL。

圖7 進(jìn)樣體積的優(yōu)化Figure 7 Optimization of injection volume

3.5 HS-GC-IMS結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)對(duì)陽春砂的鑒別

采用MXT-WAX 強(qiáng)極性色譜柱檢測50 批陽春砂，使用GalleryPlot 插件生成陽春砂的揮發(fā)性特征峰指紋圖譜見圖8。通過揮發(fā)性特征峰可以大致辨別陽春砂的道地性，但仍具有一定的主觀性。因此，需要結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)進(jìn)一步分析。

以陽春砂特征峰對(duì)應(yīng)的峰強(qiáng)度為特征參數(shù)變量，使用主成分分析得到的第一、二主成分圖如圖4B 所示。由圖4B 可知，不同產(chǎn)地的陽春砂的GC-IMS 圖譜經(jīng)PCA 處理后，可以較好地區(qū)分道地陽春砂和非道地陽春砂；道地與非道地陽春砂樣品之間距離較遠(yuǎn)，PC-1與PC-2累計(jì)貢獻(xiàn)率88%，表明兩組陽春砂樣品之間差異較大，間接表明HS-GC-IMS對(duì)陽春砂道地性鑒別的可能性。

采用KNN 分類算法對(duì)經(jīng)PCA 降維后的數(shù)據(jù)進(jìn)行分類鑒別，分別選擇不同種類的陽春砂中75%的數(shù)據(jù)作為訓(xùn)練集，25%的數(shù)據(jù)作為預(yù)測集，建立分類模型。結(jié)果表明，訓(xùn)練集和預(yù)測集的識(shí)別準(zhǔn)確率為100%，表明道地陽春砂和非道地陽春砂之間存在明顯的差異性，KNN模型穩(wěn)健、可靠。

4 討論

氣味是中藥重要的性狀鑒別特征，能直接反映藥物整體內(nèi)在本質(zhì)，如何運(yùn)用現(xiàn)代化分析技術(shù)實(shí)現(xiàn)中藥氣味特征的客觀評(píng)價(jià)和數(shù)字化分析尤為重要[21]。HS-GC-IMS 直接頂空進(jìn)樣，保持陽春砂藥材的原有氣味，可快速檢測道地陽春砂和非道地陽春砂的揮發(fā)性物質(zhì)。根據(jù)揮發(fā)性特征峰的含量差異，通過PCA 可實(shí)現(xiàn)陽春砂的快速鑒別。經(jīng)PCA 降維處理后，建立的KNN 辨別模型，可以更有效地提高數(shù)據(jù)處理效率。

本研究建立了一種HS-GC-IMS 結(jié)合化學(xué)計(jì)量學(xué)的方法，用于區(qū)分道地與非道地陽春砂，該方法處理簡單、靈敏度高、結(jié)果準(zhǔn)確。采用MXT-WAX色譜柱對(duì)陽春砂的揮發(fā)性物質(zhì)進(jìn)行檢測，以它們的揮發(fā)性特征峰作為陽春砂道地性鑒別的特征參數(shù)，并使用化學(xué)計(jì)量學(xué)方法進(jìn)行分類鑒別，結(jié)果表明主成分分析PC-1 和PC-2 的累計(jì)貢獻(xiàn)率為88%，KNN 訓(xùn)練集和預(yù)測集的識(shí)別準(zhǔn)確率均為100%。本研究可為下一步陽春砂的道地性研究和質(zhì)量評(píng)價(jià)提供數(shù)據(jù)支撐，為中藥近源品種的鑒別提供參考方法。