吳朝文，謝小紅，黎清現(xiàn)，魏洪發(fā)，劉嬌

（深圳市龍華區(qū)中心醫(yī)院內(nèi)分泌科，廣東 深圳 518110）

自身免疫性甲狀腺炎（autoimmune thyroiditis,AIT）是一種典型的器官特異性自身免疫性疾病，主要以血清甲狀腺自身抗體水平升高和甲狀腺組織損傷為主要特點(diǎn)，甲狀腺組織存在不同程度的淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞浸潤并伴有甲狀腺細(xì)胞凋亡和濾泡結(jié)構(gòu)破壞，最終導(dǎo)致甲狀腺功能減退、臨床甲狀腺腫或甲狀腺組織纖維化[1]。據(jù)國外流行病學(xué)顯示，AIT 患病率占總?cè)巳旱?%～2%，可發(fā)生在任何年齡段，女性發(fā)病約為男性的10 倍[2]。近年來研究表明AIT 的發(fā)病與遺傳因素、環(huán)境因素、自身免疫、炎癥、氧化損傷、凋亡等因素密切相關(guān)[3]。在AIT 早期，目前缺乏有效的治療方法和藥物來阻止疾病的進(jìn)程，當(dāng)患者出現(xiàn)甲狀腺功能減退時(shí)，只能使用左旋甲狀腺素替代治療，存在停藥后易復(fù)發(fā)和對甲狀腺自身抗體水平改善作用較小等弊端[4]，因此尋找高效低毒的抗AIT新藥仍是目前研究的重點(diǎn)。

蘆薈為百合科植物庫拉素蘆薈Aloe barbadmsis Miller、好望角蘆薈Aloe ferox Miller或其他同屬近緣植物葉的汁液濃縮干燥物。作為一種常用傳統(tǒng)中藥，其藥用價(jià)值很高，最早被1963年版《中華人民共和國藥典》（第一部）收為藥用，并一直錄用至今。蘆薈具有瀉下通便、清肝瀉火、殺蟲療疳的功效[5]。近年來研究發(fā)現(xiàn)其主要有效成分-蘆薈多糖具有免疫調(diào)節(jié)、抗氧化、抗炎、抗凋亡、抗輻射、抗病毒、抗腫瘤等藥理作用[6]。蘆薈多糖可能通過免疫和炎癥調(diào)節(jié)功能改善AIT，這也是本研究需要驗(yàn)證的科學(xué)問題。

1 材料與方法

1.1 藥物與試劑

蘆薈多糖（成都超九八生物科技有限公司，批號(hào)：20220311）；完全弗氏佐劑、不完全弗氏佐劑、碘化鈉和PTg（Sigma 公司）；小鼠TPOAb 化學(xué)發(fā)光試劑盒和小鼠TGAb 化學(xué)發(fā)光試劑盒（上海撫生實(shí)業(yè)有限公司）；小鼠TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17 ELISA檢測試劑盒（上海江萊生物科技有限公司）；小鼠FOXP3、IL-17A、TGF-β1、FOXP3 和RORγt 單抗（中杉金橋公司）；小鼠FT3、FT4和TSH ELISA 檢測試劑盒（武漢華美生物工程有限公司）。

1.2 主要儀器

JY-ZY5 型WB 轉(zhuǎn)膜電泳儀（北京君意華鑫科技有限公司）；DGG-9070B電熱鼓風(fēng)干燥箱（上海森信實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；LG10-2.4A 型超速離心機(jī)（北京醫(yī)用離心機(jī)廠）；550 酶標(biāo)測定儀（日本Bio-red 公司）；FA1004型電子天平（上海天平儀器廠）。

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

SPF 級2 月齡雌性C57BL/6J 小鼠30 只，購于遼寧長生生物技術(shù)股份有限公司，生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（遼）2020-0001，實(shí)驗(yàn)經(jīng)廣東醫(yī)科大學(xué)動(dòng)物實(shí)驗(yàn)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，批準(zhǔn)號(hào)：GDMU-2022-000538。

1.4 方法

1.4.1 分組與給藥 小鼠于SPF 級環(huán)境適應(yīng)性喂養(yǎng)1 周后開展實(shí)驗(yàn)，并隨機(jī)分為正常組、模型組和蘆薈多糖組（LHDT），每組10 只。其中蘆薈多糖組灌胃給藥300 mg/（kg·d），其余兩組灌胃給予等量生理鹽水。藥物干預(yù)4 周取材。模型組以及LHDT 組通過皮下多點(diǎn)注射PTg+高碘水法建立小鼠AIT模型，模型的建立參照文獻(xiàn)[7]。

1.4.2 指標(biāo)檢測 給藥干預(yù)4周后，異氟烷麻醉小鼠，摘眼球取血，血液4 ℃靜置2 h。4 ℃下3 500 r/min離心10 min，隨后分離血清，ELISA法分別檢測各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb、TPOAb、TNF-α、IL-1β、IL-10、IL-17 水平。采血結(jié)束通過頸椎脫臼處死小鼠，小心分離并獲得甲狀腺，生理鹽水沖洗干凈，濾紙吸干，用10%（φ）中性甲醛溶液固定24 h，常規(guī)石蠟包埋切片、HE 染色以及封片，光鏡下觀察甲狀腺的組織病理學(xué)變化。用玻璃勻漿器于冰上制備10% 甲狀腺勻漿，4 ℃下3 500 r/min 離心10 min，分離上清，嚴(yán)格按照ELISA檢測說明書步驟檢測各組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10 和IL-17 水平。免疫熒光法檢測FOXP3 和IL-17A 水平：甲狀腺石蠟切片組織分別經(jīng)二甲苯、梯度乙醇和純化水水化后，0.5%TritonX-100 室溫通透20 min，封閉、孵育一抗FOXP3（1∶2 000）和IL-17A（1∶2 000）、洗片、孵育熒光標(biāo)記二抗（1∶200）、封片，共聚焦熒光顯微鏡下觀察拍照。Western blot 法檢測甲狀腺TGF-β1、FOXP3 和RORγt 蛋白表達(dá)水平：加入適量RIPA 裂解液裂解甲狀腺，4 ℃下10 000 r/min 離心10 min，分離上清，BCA 試劑盒檢測甲狀腺總蛋白濃度，分別進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、孵育一抗TGF-β1（1∶2 000）、FOXP3（1∶2 000）和RORγt（1∶2 000）過夜、洗膜、孵育二抗（1∶5 000）、洗膜、顯影，Image J 軟件分析條帶灰度值。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 22.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組小鼠甲狀腺病理形態(tài)學(xué)變化

正常組小鼠甲狀腺腺泡均勻分布且未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠甲狀腺大部分濾泡上皮變性壞死，見大量淋巴細(xì)胞浸潤。與模型組比較，蘆薈多糖組小鼠可明顯改善甲狀腺上述病理學(xué)變化。見圖1。

圖1 各組小鼠甲狀腺病理形態(tài)學(xué)觀察（HE染色，n=10，10×）Figure 1 Histopathological changes in the thyroid gland of mice in each group(HE staining,n=3,10×)

2.2 各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb 和TPOAb水平

與正常組比較，模型組小鼠血清FT3和FT4水平明顯降低，而TSH、TGAb 和TPOAb 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，LHDT 組小鼠血清FT3和FT4水平明顯升高，而TSH、TGAb 和TPOAb 水平明顯降低（P＜0.01）。見表1。

表1 各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb和TPOAb水平Table 1 Serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb in each group of mice(±s,n=10)

表1 各組小鼠血清FT3、FT4、TSH、TGAb和TPOAb水平Table 1 Serum levels of FT3,FT4,TSH,TGAb and TPOAb in each group of mice(±s,n=10)

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組LHDT組c（FT3）/（pmol·L-1）12.59±0.57 7.68±0.33**9.41±0.28##c（FT4）/（pmol·L-1）28.47±1.14 11.36±0.85**20.19±0.67##ρ（TSH）/（IU·mL-1）8.52±0.21 19.27±0.99**14.34±0.74##ρ（TGAb）/（pg·mL-1）102.27±4.62 856.27±75.46**326.36±59.21##ρ（TPOAb）/（pg·mL-1）80.38±5.47 556.26±72.134**226.54±58.41##

2.3 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17水平

與正常組比較，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17 水平明顯升高（P＜0.01）。與模型組比較，LHDT 組小鼠血清TNF-α、IL-1β和IL-17 水平明顯降低（P＜0.01），而IL-10 水平明顯升高（P＜0.01）。見表2。

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17水平Table 2 Serum levels of TNF-α，IL-1β，IL-10 and IL-17 in each group of mice (±s,n=10)ρ/（pg·mL-1）

表2 各組小鼠血清TNF-α、IL-1β、IL-10和IL-17水平Table 2 Serum levels of TNF-α，IL-1β，IL-10 and IL-17 in each group of mice (±s,n=10)ρ/（pg·mL-1）

與正常組比較：**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組LHDT組TNF-α 61.28±5.34 358.64±72.55**127.95±39.61##IL-1β 82.74±17.36 457.82±74.69**129.37±37.68##IL-10 89.61±2.38 101.52±9.29 156.48±15.88##IL-17 8.74±1.85 56.43±9.76**26.69±5.72##

2.4 ELISA 法檢測各組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10和IL-17水平

與正常組比較，模型組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10和IL-17水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，LHDT 組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt 和IL-17 水平明顯降低（P＜0.01），而FOXP3、TGF-β和IL-10 水平明顯升高（P＜0.01）。見表3。

表3 各組小鼠甲狀腺STAT3、RORγt、FOXP3、TGF-β、IL-10和IL-17水平Table 3 Levels of STAT3，RORγt，F(xiàn)OXP3，TGF-β，IL-10 and IL-17 in thyroid of mice in each group(±s,n=10)

與正常組比較：*P＜0.05，**P＜0.01；與模型組比較：##P＜0.01。

組別正常組模型組LHDT組STAT3/（pg·g-1）5 012.33±588.94 21 125.54±1 021.75**12 362.68±815.67##RORγt/（ng·g-1）52.64±6.28 326.53±61.89**124.62±39.87##FOXP3/（pg·g-1）3 254.24±125.12 4 325.76±605.35*5 123.52±401.65##TGF-β/（pg·g-1）8 268.39±426.62 11 325.58±804.41**14 123.66±409.65##IL-10/（pg·g-1）4 235.61±429.96 6 363.69±612.67**8 174.78±810.25##IL-17/（pg·g-1）255.48±26.32 729.85±64.74**426.25±62.22##

2.5 免疫熒光法檢測各組小鼠甲狀腺FOXP3 和IL-17A水平

與正常組比較，模型組小鼠甲狀腺IL-17A 水平明顯升高（P＜0.01）（圖2J-O 和T）。與模型組比較，LHDT 組小鼠甲狀腺FOXP3 水平明顯升高（P＜0.01），IL-17A 水平明顯降低（P＜0.01）（圖2D—I、M—R、S、T）。

2.6 Western blot 法檢測各組小鼠甲狀腺TGF-β1、FOXP3和RORγt表達(dá)水平

與正常組比較，模型組小鼠甲狀腺TGF-β1、FOXP3 和RORγt 水平明顯升高（P＜0.05）。與模型組比較，LHDT 組小鼠甲狀腺FOXP3 水平明顯升高（P＜0.01），而TGF-β1 和RORγt 水平明顯降低（P＜0.01）。見圖3。

3 討論

基于目前治療AIT尚無特效藥，而中藥具有副作用小以及作用靶點(diǎn)多等優(yōu)勢，可能是潛在的抗AIT新藥的重要來源。長期以來蘆薈一直被認(rèn)為是一種高效的免疫增強(qiáng)劑，其免疫調(diào)節(jié)作用已被廣泛報(bào)道，例如可改善淋巴細(xì)胞增殖、激活補(bǔ)體和抗炎作用[8-9]。而蘆薈多糖已被證實(shí)是蘆薈主要的免疫調(diào)節(jié)化合物[10]。TGAb和TPOAb水平的上調(diào)以及甲狀腺大量的淋巴細(xì)胞浸潤是AIT的重要診斷標(biāo)志物。FT3、FT4和TSH 是臨床上甲狀腺功能檢測的重要指標(biāo)。研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠甲狀腺大部分濾泡上皮變性壞死以及大量淋巴細(xì)胞浸潤，血清TSH、TGAb和TPOAb水平顯著升高，而FT3和FT4水平明顯降低，提示AIT小鼠模型建模成功。蘆薈多糖干預(yù)后可有效改善甲狀腺上述病理學(xué)變化和甲狀腺功能。

免疫因素在AIT 的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用[11]。在AIT期間，甲狀腺被T 細(xì)胞浸潤，T 細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫性損傷是其關(guān)鍵發(fā)病機(jī)制。在自身抗原的刺激下，Treg 細(xì)胞和其他T 細(xì)胞亞群在胸腺中發(fā)育。CD4+T 淋巴細(xì)胞在免疫中起著至關(guān)重要的作用。未成熟CD4+T 淋巴細(xì)胞被抗原提呈細(xì)胞、CD28 等共刺激分子激活，在IL-6 聯(lián)合IL-1β、IL-23和TGF-β誘導(dǎo)下分化為Th17 細(xì)胞[12-14]。CD4+T 細(xì)胞作用于靶細(xì)胞，促進(jìn)促炎細(xì)胞因子IL-17A 的分泌。RORγt 被認(rèn)為是發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子并誘導(dǎo)IL-17A 的分泌[15-16]。而Th17 細(xì)胞參與了AIT的發(fā)生發(fā)展已被證實(shí)[17]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組小鼠甲狀腺RORγt、TGF-β和IL-17A水平明顯升高，而蘆薈多糖可顯著降低RORγt、TGF-β和IL-17A水平，從而減輕AIT的炎癥進(jìn)程。Treg 細(xì)胞是CD4+T 細(xì)胞的一個(gè)亞型，Treg 細(xì)胞在維持免疫耐受起著關(guān)鍵作用。其免疫耐受功能的維持需要FOXP3 的調(diào)節(jié)。Treg細(xì)胞通過分泌TGF-β和IL-10 抑制機(jī)體免疫反應(yīng)，F(xiàn)OXP3 在TGF-β作用下誘導(dǎo)Treg 細(xì)胞的成熟，而RORγT 誘導(dǎo)Th17 細(xì)胞的成熟[18]。Treg 細(xì)胞和Th17細(xì)胞在慢性炎癥和自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用[19]。本研究發(fā)現(xiàn)模型組小鼠甲狀腺TGF-β1、FOXP3 和RORγt 蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)。給予蘆薈多糖可明顯上調(diào)FOXP3 蛋白表達(dá)水平，下調(diào)TGF-β1和RORγt水平。提示蘆薈多糖通過TGF-β1/FOXP3/RORγt 信號(hào)通路調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能改善AIT。

綜上所述，蘆薈多糖對AIT具有較好的保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能是通過調(diào)控TGF-β1/FOXP3/RORγt信號(hào)通路進(jìn)而影響機(jī)體免疫功能。