毛婉一，劉奕辰，徐青清，葛健文，陳 浩，錢 穎，季 鵬

(泰州學(xué)院 醫(yī)藥與化學(xué)化工學(xué)院，江蘇 泰州 225300)

皮膚，作為最廣泛的與外界接觸的人體器官，包裹于身體表面，直接暴露在外界環(huán)境中，容易受到刮傷、碰撞或是更嚴(yán)重的傷害，從而形成傷口。受到創(chuàng)傷后皮膚會先自行修復(fù)，但傷口較嚴(yán)重時則需要一些傷口愈合藥物的輔助，加快傷口愈合，避免傷口長期愈合不了而導(dǎo)致發(fā)炎等，引起更嚴(yán)重的創(chuàng)傷。傷口愈合的生理過程主要包含四個重疊在一起的階段，分別為：止血、炎癥、增殖和組織重塑[1]。這四個階段是一個連續(xù)的整體，使用有效的傷口愈合藥物，不僅能加速傷口愈合的速度，還能避免二次感染。理想的傷口愈合藥物具有極佳的保濕性、抗細(xì)菌感染性、生物相容性和促進(jìn)血管生成等優(yōu)異特點。

水凝膠是一種以水為分散介質(zhì)的凝膠，具有很強的親水性和三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)。三維聚合物鏈交聯(lián)網(wǎng)絡(luò)的存在，使水凝膠可以在保持完整結(jié)構(gòu)的同時迅速溶脹和吸收大量的水分[2]，為水分、藥物分子、營養(yǎng)物質(zhì)等的傳輸提供了理想的環(huán)境。隨著新生物技術(shù)時代的到來，水凝膠的發(fā)展也進(jìn)入了新的階段。水凝膠是傷口愈合藥物的理想載體，較高的含水量為傷口提供了極佳的愈合環(huán)境。

絲素蛋白(Silk fibroin，SF)作為目前已知的一種天然高分子材料，有著優(yōu)異的可加工性、生物相容性、可調(diào)節(jié)的生物降解性、提取成本低、安全性較高等特點，在紡織、服裝行業(yè)乃至醫(yī)用建材上都有著廣泛的應(yīng)用。SF由二硫鍵連接的重鏈和輕鏈組成，因其止血性能好、炎癥反應(yīng)低、氣體滲透性好等，被廣泛用作皮膚修復(fù)生物材料。致密的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)能有效防止細(xì)菌對傷口的感染，同時還能吸收傷口滲出液。良好的生物黏附性對傷口組織的再生、清創(chuàng)都有益。SF降解可控，極其有利于傷口細(xì)胞的修復(fù)，可有效降低材料耗損，且降解產(chǎn)物對皮膚組織的愈合作用顯著。此外，其柔韌性、緩釋性、透氣性以及透水性能都十分理想，能幫助細(xì)胞的黏附和增生，是一種極具發(fā)展前景的傷口愈合材料[3]。這些顯著的特點讓人們對于SF在傷口愈合方面的研究更加深入，同時開始探討SF與其他材料之間的聯(lián)系。利用SF制備高質(zhì)量的水凝膠是目前材料學(xué)科的一個熱門課題。

1 絲素蛋白水凝膠的交聯(lián)方法

1.1 物理交聯(lián)法制備

物理交聯(lián)法制備SF水凝膠是在溫和的條件下，通過改變特定的物理因素，誘導(dǎo)SF分子由無規(guī)卷曲結(jié)構(gòu)向β-折疊構(gòu)象轉(zhuǎn)變，隨后通過進(jìn)一步聚集形成具有三維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)的凝膠。這種方法的優(yōu)勢是制備方法簡單可控，而且不需要任何的化學(xué)交聯(lián)劑[4]。常見的物理方法有超聲波技術(shù)、電場作用、使用有機(jī)溶劑等[5]，能有效制備SF水凝膠。

1)超聲波技術(shù)

超聲波技術(shù)制備水凝膠屬于一種簡便的、無需添加的物理交聯(lián)。超聲處理通過改變疏水水化作用引發(fā)β片層的形成，從而加速負(fù)責(zé)凝膠穩(wěn)定的物理交聯(lián)，在超聲波的幫助下，加速SF的分子間作用以誘導(dǎo)SF的結(jié)構(gòu)變化，從而形成水凝膠[6]。透明質(zhì)酸(hyaluronic acid，HA)大分子鏈在超聲處理過程中不能形成物理交聯(lián)，不發(fā)生凝膠化，因此凝膠化是由SF物理交聯(lián)控制的。Hu等通過超聲波作用實現(xiàn)了將SF水溶液凝膠化，并用于在沒有化學(xué)交聯(lián)的情況下捕獲混合的、未交聯(lián)的HA[7]，研究表明，超聲功率輸出、超聲時間和SF濃度的因素會調(diào)節(jié)水凝膠狀態(tài)。超聲波法相對于其他物理交聯(lián)法更加快速有效。

2)電場作用

電場誘導(dǎo)SF凝膠化是將電極浸入含有SF并通有25 V直流電源的水溶液中，高電壓導(dǎo)致SF溶液的溫度迅速升高，在電場作用下只需幾秒就在正極形成可見的凝膠。最后，膠束聚集體通過分子鏈之間的物理糾纏形成SF水凝膠網(wǎng)絡(luò)[8]。Liu等通過低壓電場，在新鮮的SF水溶液中獲得了纖維電凝膠[9]。原本SF纖維水凝膠很難形成，然而，通過CaCl2-乙醇-H2O溶解法獲得的SF水溶液暴露在直流電中。在低壓電場下，溶液開始在正極上凝膠化。在施加低電壓的幾分鐘內(nèi)，溶液變得不透明，并且在正極周圍完全形成了電凝膠。經(jīng)過檢驗，制得的SF纖維電凝膠具有更高的壓縮應(yīng)力。研究發(fā)現(xiàn)只有在低電壓(3～24 V)、低質(zhì)量分?jǐn)?shù)(≤5.0%)和中性、堿性條件下，SF纖維電凝膠才容易形成。因此電場誘導(dǎo)絲蛋白水凝膠的形成對電壓、溶液濃度和酸堿條件有嚴(yán)格的要求。

3)有機(jī)溶劑

通過使用有機(jī)溶劑，同樣可以做到誘導(dǎo)SF凝膠化[10]。Naresh等使用甲醇誘導(dǎo)再生絲素蛋白(Regenerated silk fibroin，RSF)水凝膠的形成[11]，當(dāng)加入甲醇后，RSF-水-甲醇體系表現(xiàn)為聚合物-溶劑-非溶劑三元體系，甲醇參與與水的質(zhì)子交換，從而干擾水與RSF的相互作用，導(dǎo)致RSF脫溶，最終RSF從無序形態(tài)變?yōu)榱擞行虻慕Y(jié)晶形態(tài)。通過研究得出，乙醇、異丙醇、正丁醇等有機(jī)溶劑也有相似效果。其中，有機(jī)溶劑的多少是能否形成凝膠和成膠快慢的決定因素。

4)表面活性劑

表面活性劑如月桂酰肌氨酸鈉、十二烷基硫酸鈉和泊洛沙姆等可以與SF混合，以加速誘導(dǎo)SF溶液形成水凝膠。SF納米纖維由無規(guī)卷曲到β-片層形式構(gòu)象的轉(zhuǎn)變主要依賴于表面活性劑固有性質(zhì)，以及表面活性劑和SF分子在水溶液中的不同相互作用[12]。Wu等使用陰離子表面活性劑十二烷基硫酸鈉(SDS)作為膠凝劑來加速SF凝膠，在低濃度下，SF鏈之間相互的疏水作用在締合中發(fā)揮主導(dǎo)功能，誘導(dǎo)凝膠化，并使凝膠時間縮短[13]。相反，在較高濃度下，膠束聚集體之間的靜電排斥力逐漸占主導(dǎo)地位，凝膠化受到阻礙，甚至無法發(fā)生凝膠。此項研究表明，表面活性劑的濃度是SF凝膠能否凝膠、凝膠速度快慢的關(guān)鍵。

綜上所述，這些物理交聯(lián)法通過促進(jìn)SF分子之間的相互作用，加速β-片層結(jié)構(gòu)的形成，從而加快SF凝膠化，而且實驗方法簡單、凝膠速度快、不需要任何化學(xué)交聯(lián)劑輔助。不過物理交聯(lián)法也存在缺陷：制備的水凝膠穩(wěn)定性比較差，通常較脆且機(jī)械性能較差。

1.2 化學(xué)交聯(lián)法制備

利用化學(xué)交聯(lián)方法制備的SF水凝膠具有更高的物理穩(wěn)定性和機(jī)械性能。當(dāng)前應(yīng)用于SF水凝膠制備的主要方法有光交聯(lián)方法、使用酶進(jìn)行交聯(lián)制備等[14]。

1)光交聯(lián)法

光交聯(lián)法制備SF水凝膠的機(jī)理是由于光引發(fā)劑吸收能量后形成自由基，該自由基會進(jìn)攻預(yù)聚物的活性基團(tuán)，活性基團(tuán)受到進(jìn)攻后相互之間發(fā)生反應(yīng)，引發(fā)相關(guān)的聚合物鏈之間的交聯(lián)，從而形成SF水凝膠。通過該反應(yīng)機(jī)理可以發(fā)現(xiàn)光聚合制備需要有合適的光源，帶有活性基團(tuán)的預(yù)聚物以及光引發(fā)劑。對于光源的選擇，大體可以分為紫外光以及可見光。目前，紫外光作為光源進(jìn)行制備的報道很多。例如，Zhang等利用紫外光作為光源，制備了PEGDA/SF互穿網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)水凝膠，并通過改變SF在水凝膠中的含量，研究SF含量對于該水凝膠理化性質(zhì)的影響[15]。研究表明，該光交聯(lián)法制備的水凝膠具有較好的生物相容性和力學(xué)性能，能夠作為生物醫(yī)學(xué)組織材料應(yīng)用到相關(guān)醫(yī)學(xué)治療上。也有可見光作為光源的研究報道，如Whittaker等在可見光照射下，用釕作為催化劑，使SF分子上的酪氨酸被氧化并發(fā)生反應(yīng)，形成了二酪氨酸交聯(lián)[16]。此方法制備的水凝膠在發(fā)生凝膠化的過程中用時更短，并具有良好的生物相容性，但該方法涉及到金屬釕，制備的水凝膠存在潛在毒性，還需要進(jìn)一步完善相關(guān)研究?？梢姽獾奈：σ∮谧贤夤?，且效率更高，應(yīng)用可見光作為光聚合的光源條件將是研究的一個重要方向。同樣的，也有應(yīng)用其他光源(如LED藍(lán)光)作為能量來源的相關(guān)研究，并且證明可以克服RSF水凝膠生物活性、凝膠效率及凝膠強度三者難以兼具的問題[17]。應(yīng)用光交聯(lián)制備SF水凝膠能夠控制反應(yīng)進(jìn)行，對材料整體或部分進(jìn)行調(diào)控、在未來生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用上具有良好的前景。

2)酶

與上文提到的光交聯(lián)方法制備SF水凝膠相比，利用酶作為聚合物參與水凝膠的交聯(lián)制備有著更多的優(yōu)點。比如，酶參與會減少甚至不產(chǎn)生具有化學(xué)毒性的物質(zhì)[18]。酶化學(xué)提供了優(yōu)異的凝膠速率的微調(diào)方法，能更好地控制產(chǎn)生的水凝膠性質(zhì)，制得的SF水凝膠力學(xué)性能優(yōu)異，能夠作為生物材料應(yīng)用到相關(guān)醫(yī)學(xué)治療中[19-20]。其中，學(xué)者Chirila等在有過氧化氫存在下，用辣根過氧化物酶(Horseradish Peroxidase，HRP)誘導(dǎo)SF的自交聯(lián)，制備了相應(yīng)的SF水凝膠[21]，并且與物理交聯(lián)方法以及傳統(tǒng)化學(xué)交聯(lián)方法制得的水凝膠進(jìn)行了比較。從化學(xué)背景和合成方法、物理和光學(xué)性能、酶降解以及作為細(xì)胞粘附和增殖底物的相容性等方面進(jìn)行比較，得出：HRP誘導(dǎo)交聯(lián)能夠顯著縮短凝膠時間，增強水凝膠的彈性，并提高細(xì)胞相容性。制得的HRP/H2O2水凝膠將應(yīng)用于人體眼部的組織工程中[22-26]，提高該工程材料的機(jī)械強度，使得相關(guān)手術(shù)的難度降低、安全性有所提高。通過酶交聯(lián)制備的水凝膠在相關(guān)生物工程上展示巨大潛力，我們還需要發(fā)現(xiàn)更多的像HRP這樣的酶物質(zhì)，使其應(yīng)用到人類相關(guān)生產(chǎn)生活中。

2 復(fù)合型絲素蛋白的制備和傷口愈合作用

前文已經(jīng)提及了SF水凝膠作為傷口敷料的一些優(yōu)勢，其本身能夠吸收傷口的滲出物，保持潮濕的傷口環(huán)境，促進(jìn)抗菌和止血，同時，獨特的粘接性能使其能夠進(jìn)一步促進(jìn)傷口的愈合。但是用于傷口愈合的理想SF水凝膠應(yīng)該具有極佳的機(jī)械性能、生物相容性、抗細(xì)菌感染性、止血、低成本、安全性較高等[27]，單一的SF水凝膠顯然無法同時滿足如此多的要求。令人鼓舞的是，研究發(fā)現(xiàn)的復(fù)合型SF水凝膠的出現(xiàn)可有效解決。根據(jù)SF水凝膠原本的結(jié)構(gòu)和尺寸，與其他優(yōu)異的材料整合、重塑，合成的新型復(fù)合型SF水凝膠被賦予其它一種或多種特征和性能，彌補了傳統(tǒng)SF水凝膠在傷口愈合方面的一些不足，加強了功能性，使其更加優(yōu)異和高效。

2.1 加載FGF1的肝素化絲素蛋白水凝膠

酸性成纖維細(xì)胞生長因子(FGF1)是一種重要的血管生成因子，可以與內(nèi)皮細(xì)胞上的受體相結(jié)合，激活細(xì)胞內(nèi)的信號傳導(dǎo)，發(fā)揮相應(yīng)的作用，能夠影響細(xì)胞的分化和遷移等關(guān)鍵功能[28]。研究表明，F(xiàn)GF1可以促進(jìn)傷口處組織細(xì)胞的增殖分化，加速傷口的愈合，是臨床上改善糖尿病皮膚潰瘍、愈合傷口的理想傷口敷料[29]。肝素屬于高度硫酸化的多糖，可以作為一種抗凝劑，將其附加在醫(yī)學(xué)材料表面上能夠形成肝素化涂層，不僅使原本的材料表現(xiàn)出良好的抗凝特性，還能夠增強血液的相容性。但肝素化材料的不足之處在于，其對金黃色葡萄球菌生物膜的形成具有一定的促進(jìn)作用，即可促進(jìn)細(xì)菌的繁殖，所以可能會伴隨有血流感染，進(jìn)而危及生命[30]。He等嘗試將肝素共價固定在SF水凝膠表面，經(jīng)過一系列的沖洗和滅菌后浸泡在重組FGF1上，形成新型的復(fù)合型水凝膠傷口敷料。根據(jù)傷口愈合劃痕實驗和細(xì)胞增殖實驗，對其安全性和傷口愈合效率進(jìn)行實驗評估，發(fā)現(xiàn)其極可能成為理想的傷口敷料[31]。肝素附帶的細(xì)菌感染危機(jī)由于SF水凝膠本身所具有的抗菌作用得以解決，且SF水凝膠本身特殊的多孔結(jié)構(gòu)有利于細(xì)胞的再生長和生物活性分子的運輸。研究還發(fā)現(xiàn)，肝素化的SF水凝膠可以維持FGF1在傷口的濃度，刺激傷口的愈合。一系列實驗表明，負(fù)載了FGF1的肝素化SF水凝膠能夠改善傷口愈合的情況，加快傷口愈合的速度，為未來的臨床治療提供了研究思路。

2.2 姜黃素絲素蛋白水凝膠

姜黃素是從姜黃根莖中提取的多酚成分，具有抗氧化和抗菌作用。其獨特的化學(xué)結(jié)構(gòu)和藥理作用已經(jīng)在許多慢性疾病的治療中展露效果，如關(guān)節(jié)炎、炎癥、神經(jīng)性疾病等。更重要的是，其在臨床上已經(jīng)被證實具有治療癌癥的作用，在乳腺癌[32]、肺癌[33]等癌癥中已經(jīng)有了突破性進(jìn)展。它對于腫瘤細(xì)胞的增殖起著抑制作用，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的凋亡。有研究人員提出，將姜黃素的抗炎和抗菌等特性附加在SF水凝膠上制成新型的復(fù)合型SF水凝膠。Zeynep等人嘗試?yán)靡环N新型的方法制備SF水凝膠，該制備過程稱為電凝膠化制備法[34]。在低壓直流電作用下，水性重組SF先形成溶膠最后變成水凝膠，他們在這一過程中加入了姜黃素溶液，成功形成了負(fù)載姜黃素的SF水凝膠。經(jīng)過進(jìn)一步的處理，這種復(fù)合水凝膠還被制成了一種3D水凝膠支架。這種水凝膠支架是一種小孔和高孔隙率結(jié)構(gòu)，研究人員對其進(jìn)行了評估，發(fā)現(xiàn)：因為姜黃素的存在，細(xì)菌無法粘附在傷口部位，并且細(xì)菌生物膜的形成遭到抑制，極大的改善了傷口的愈合環(huán)境。制成的水凝膠支架具有高分子多孔的海綿性質(zhì)，對于血管生成細(xì)胞的浸潤作用、傷口血管的生成有著促進(jìn)效果[35]。這種新型的復(fù)合型水凝膠制成的支架極大的促進(jìn)了傷口愈合，生物相容性也很好，對正常細(xì)胞沒有副作用，有望成為理想的傷口愈合敷料。

2.3 CSMA/SFMA水凝膠

殼聚糖(Chitosan，CS)細(xì)胞親和性較差，但具有良好的止血作用與抗感染活性。SF是一種良好的增稠劑，能夠改善CS的細(xì)胞親和性，并增強其機(jī)械性能的穩(wěn)定性。研究發(fā)現(xiàn)，將甲基丙烯?；瘹ぞ厶?Chitosan Methacrylated，CSMA)與含抗生素的SF相結(jié)合制得的水凝膠，有加快傷口愈合效率的作用。He等在室溫下將CSMA溶解于去離子水中形成4%的CSMA溶液，將SFMA溶解于去離子水中形成20%的SFMA溶液[36]。將上述等量的兩份溶液混合后加入0.4%的苯基鋰(2，4，6-三甲基苯甲酰)亞磷酸鹽(LAP)在黑暗環(huán)境下攪拌至完全溶解，在紫外光下照射5 min直至形成水凝膠。最后，將形成的水凝膠浸入40 ℃下單寧酸中24 h，獲得單寧酸環(huán)境下增強的CSMA/SFMA水凝膠。就促進(jìn)傷口愈合的水凝膠敷料而言，物理穩(wěn)定性十分重要?？焖俳到鈺?dǎo)致水凝膠的機(jī)械性能降低，而緩慢降解則會導(dǎo)致水凝膠粘在傷口上，不易切除[37]。He等對CSMA/SFMA水凝膠進(jìn)行了一個月內(nèi)不同程度的降解性能評估，發(fā)現(xiàn)CSMA/SFMA水凝膠降解速率較低，表明該復(fù)合型SF水凝膠適用于傷口敷料[31]。隨后該實驗還通過對CSMA/SFMA水凝膠粘接性能、體外抗氧化性能、抗菌性能與細(xì)胞相容性等進(jìn)行多重性評價，結(jié)果均表明CSMA/SFMA水凝膠對于傷口愈合具有良好的促進(jìn)作用。

2.4 膽綠素/絲素蛋白水凝膠(BVSF)

膽綠素，血紅蛋白分解的副產(chǎn)物，是一種顏色呈深綠色的膽色素。近幾年來，膽綠素被證實具有抗炎特性、抗氧化性與較高的光熱效率[38]，能夠作為愈合傷口的生物活性藥物。膽紅素、膽綠素的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物，也具有抗炎、抗氧化性與光吸收特性。Qing等人將膽紅素與β-環(huán)糊精相結(jié)合制得復(fù)合型生物粘附性水凝膠，但由于膽紅素的疏水性，其應(yīng)用受到一定限制[39]。相較于疏水性的膽紅素，親水性的膽綠素更適合于水凝膠藥物的配制。根據(jù)Qing等人的制備方法[40]，將2%的SF溶解于去離子水中，再將膽綠素溶解于去離子水中制成不同濃度的溶液，在不斷攪拌下將膽綠素溶液滴加于SF溶液中，用異硫氰酸熒光素標(biāo)記好的溶液在 100 W 的超聲波下進(jìn)行凝膠化，制得膽綠素/SF水凝膠(BVSF)。在治療過程中發(fā)現(xiàn)，當(dāng)炎癥因子過多時，過度炎癥反應(yīng)將會抑制或延緩傷口愈合。通過對BVSF水凝膠的體內(nèi)研究與病理實驗表明，BVSF水凝膠能夠附著于傷口處發(fā)揮抗炎作用。經(jīng)過對BVSF水凝膠光熱特性與體外滯留時間等的相關(guān)結(jié)果研究，表明BVSF水凝膠具有刺激細(xì)胞增殖、加快傷口愈合的特性。

2.5 銀納米粒顆粒-蘆薈絲素蛋白復(fù)合水凝膠

銀納米顆粒(Silver nanoparticles，Ag-NPs)作為一種具有廣譜抗菌活性的替代品，應(yīng)用前景廣泛[41]。但由于銀離子具有不安全性，它的遞送導(dǎo)致細(xì)胞毒性及其對聚集的敏感性功效喪失，使得臨床轉(zhuǎn)化受到阻礙。然而，研究發(fā)現(xiàn)，Ag-NPs水凝膠具有卓越的抗菌作用和促進(jìn)傷口愈合特性，能夠減少傷口炎癥的產(chǎn)生。同時，蘆薈(Aloe vera，AV)作為一種藥用植物，一直被應(yīng)用于抗菌、抗病毒等[42]。許多研究表明，AV因其較為簡單的成分和藥理活性在促進(jìn)傷口愈合方面起著重要作用，已被用于預(yù)防和治療皮膚相關(guān)疾病[43]。使用傷口敷料是治療皮膚損害最有效的方法，可用SF以調(diào)節(jié)傷口愈合，但因其抗菌性和生物活性需要進(jìn)一步提高，Liu等用Ag-NPs和AV為改性劑，制備了銀納米顆粒-蘆薈-SF復(fù)合水凝膠(Ag-AV-SF水凝膠)[44]。該研究表明，Ag-AV-SF水凝膠具有良好的物理性質(zhì)、抗菌能力以及生物相容性，具有促進(jìn)細(xì)胞增殖、遷移和傷口愈合的作用。因此，該凝膠在改善臨床治療中的傷口愈合方面具有巨大的潛力。

3 總結(jié)與展望

SF水凝膠的發(fā)展不再局限于SF與水凝膠的簡單結(jié)合應(yīng)用，已經(jīng)轉(zhuǎn)變成由多種復(fù)合材料制成的新型復(fù)合型SF水凝膠。由原本有限的傳統(tǒng)功能轉(zhuǎn)變?yōu)榕c其他生物材料相結(jié)合而帶來的創(chuàng)新型特性，為傷口的安全穩(wěn)定、快速愈合帶來了更多的可能。傷口的愈合是一個動態(tài)而復(fù)雜的過程，目前臨床傷口愈合面臨的主要問題是慢性傷口的治療。慢性傷口停滯在愈合的炎癥階段，組織中生長因子的減少，衰老細(xì)胞的增加，高水平的促炎細(xì)胞因子等問題抑制傷口的快速愈合，這些依舊是目前傷口管理所面臨的艱巨挑戰(zhàn)，每年需要花費大量的醫(yī)療保健資源。未來，用于傷口愈合的SF水凝膠應(yīng)仍具有極佳的機(jī)械性能、抗細(xì)菌感染性、生物相容性、止血、低成本、易制備以及安全性較高等優(yōu)異特點，并在此基礎(chǔ)上持續(xù)加以改進(jìn)，以提高其治療傷口的效果，SF水凝膠的進(jìn)一步研究發(fā)展終需克服上述難題，在傳統(tǒng)SF水凝膠的基礎(chǔ)上開發(fā)出更多功能型SF水凝膠仍是重中之重。