蔣露 丁穎 季盼 繆琛 呂君文 陳旭陽 時姍姍 李霄

結(jié)直腸癌是消化系統(tǒng)常見的惡性腫瘤[1],高發(fā)病率與高死亡率是結(jié)直腸癌的重要特征[2]。在臨床治療用藥中,因個體化差異的存在,用藥療效因人而異。分子病理診斷方法的應(yīng)用,從基因?qū)用婵蔀榘┌Y病人個體化治療提供有效的指導(dǎo)[3]。尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶1A1 (uridine diphosphate glucuronide transferase 1A1,UGT1A1)是結(jié)直腸癌化療藥物伊立替康(irinotecan,CPT-11)的關(guān)鍵代謝酶,直接影響CPT-11治療的有效性和安全性。UGT1A1基因多態(tài)性的存在是影響該酶生物活性的重要因素[4]。相較于單一位點檢測,聯(lián)合位點檢測更能反映細胞毒作用[5]。本研究分別采用PCR-毛細管電泳法以及測序法對360例中國老年結(jié)直腸癌病人腫瘤石蠟樣本中的UGT1A1*28以及UGT1A1*6基因進行多態(tài)性分析,同時分析了性別、腫瘤類型、T分期以及原發(fā)腫瘤部位4種臨床因素對于兩種基因位點多態(tài)性分布的差異,以期為臨床化療用藥提供一定的指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 研究對象 收集2019～2021年就診于江蘇省人民醫(yī)院結(jié)直腸外科并進行手術(shù)切除的老年原發(fā)結(jié)直腸癌病人360例,年齡60～93歲,平均(76.0±3.8)歲,其中女113例,男247例。所有納入統(tǒng)計的樣本皆由病理確診,每例樣本所對應(yīng)的結(jié)直腸癌病人及其家屬均已簽署知情同意書。所有病人組織樣本均經(jīng)過固定脫水石蠟包埋處理,并在本院病理學(xué)部分子病理實驗室進行UGT1A1*28及UGT1A1*6基因檢測。

1.2 試劑與儀器UGT1A1*28基因型檢測試劑盒(批號:20210915)、UGT1A1*6基因多態(tài)性檢測試劑盒(批號:20210827)和基因組DNA提取試劑盒(批號:172023109)均來自上海源奇生物公司。VORTEX型渦旋震蕩儀(美國Scientific industrise公司),581 OR Prisma-J型高速離心機(德國Eppendorf公司),CY021088.BPri型PCR儀(美國Bio-RAD公司),3500Dx型基因分析儀(美國Thermo Fisher Scientific公司)均按說明書操作。

1.3 方法 石蠟組織切片樣本,脫蠟處理后進行組織富集,使用基因組DNA提取試劑盒提取樣本DNA。分別按照相應(yīng)的UGT1A1*28基因型及UGT1A1*6基因多態(tài)性檢測試劑盒的說明書操作步驟進行基因型及多態(tài)性檢測。

1.4 統(tǒng)計學(xué)處理 毛細管電泳和測序由配套軟件3500Dx Series Data Collection Software v3.1運行及 GeneMapper Software v6.0進行分析。采用SPSS 26.0軟件進行統(tǒng)計分析。計數(shù)資料采用頻數(shù)和百分比(n,%)表示,組間比較使用Fisher確切概率法,P<0.05為差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 老年結(jié)直腸癌病人UGT1A1*28及*6基因型分布UGT1A1*28基因型為TA 6/6、TA 6/7和TA 7/7者分別為270例(75.0%)、85例(23.6%)和5例(1.4%)。UGT1A1*6基因型為G/G、G/A和A/A者分別為241例(67.0%)、107例(29.7%),12例(3.3%)。

根據(jù)臨床特征分類,3種腫瘤類型中,除了浸潤型有1例UGT1A1*28基因型表現(xiàn)為野生型TA6/6,以及1例UGT1A1*6基因型表現(xiàn)為野生型G/G外,其余兩種潰瘍型與隆起型的UGT1A1*28以及*6基因型分布占比均分別為TA 6/6> TA 6/7> TA 7/7,G/G> G/A> A/A;5個不同腫瘤T分期中除了Tis期僅存在1例*28基因TA 7/7(100.0%)病人及1例*6基因G/G(100.0%)病人,T1～T4分期UGT1A1*28及*6基因型分布占比從多到少均分別為TA 6/6> TA 6/7> TA 7/7,G/G> G/A> A/A。在不同性別與原發(fā)腫瘤部位的病人中統(tǒng)計結(jié)果同樣符合該規(guī)律。2種基因型分布在不同臨床特征間比較,差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。見表1。

表1 不同臨床特征老年結(jié)直腸癌病人UGT1A1*28及*6基因型分布比較(n,%)

2.2UGT1A1*28與*6基因雙位點交叉統(tǒng)計分析 為了解UGT1A1基因更多的基因型分布特征,本研究對UGT1A1*28與*6基因進行了雙位點交叉統(tǒng)計分析。結(jié)果顯示,UGT1A1*28及*6均為野生型占比最多,其后依次為僅存在UGT1A1*6突變雜合子、僅存在UGT1A1*28雜合子、同時發(fā)生UGT1A1*28及*6雜合突變、僅存在UGT1A1*6突變純合子、僅存在UGT1A1*28突變純合子,不存在任一方發(fā)生純合突變,另一方發(fā)生雜合或純合突變的情況。見表2。

表2 UGT1A1*28與UGT1A1*6基因雙位點交叉統(tǒng)計分析(n,%)

2.3 不同臨床特征老年結(jié)直腸癌病人UGT1A1*28與*6基因型雙位點分布分析 將不同臨床特征與基因型分布的關(guān)系同樣進行雙位點交叉統(tǒng)計分析,結(jié)果顯示UGT1A1*28以及*6基因型雙位點分布在不同性別、腫瘤類型、T分期和腫瘤部位間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.05)。由于UGT1A1*28基因TA 7/7型樣本數(shù)很少,統(tǒng)計學(xué)參考價值較低,因此未列出。見表3。

表3 不同臨床特征老年病人UGT1A1*28基因多態(tài)性與UGT1A1*6基因雙位點分布分析(n,%)

3 討論

UGT1A1基因定位于染色體2q37,編碼蛋白分子量為60 kDa作用于葡萄糖醛酸化途徑的UGT1A1[6],該種酶可將藥物等親脂小分子物質(zhì)轉(zhuǎn)化分解為水溶性、可排泄的代謝產(chǎn)物[7]。CPT-11作為現(xiàn)今常用的結(jié)直腸癌化療藥物,能夠?qū)е铝＜毎狈εc遲發(fā)性腹瀉等不良反應(yīng)[8]。UGT1A1突變被證明與其細胞毒作用相關(guān)[9],且合并2種UGT1A1基因突變較之單一突變的毒性反應(yīng)更為顯著[10]。CPT-11吸收入血后在肝內(nèi)代謝為毒性更強的7-乙基-10-羥基喜樹堿(SN-38)。隨后SN-38在UGT1A1的作用下代謝失活轉(zhuǎn)化為糖基化SN-38(SN-38G),隨膽汁排泄入腸[11]。UGT1A1*28基因突變能夠?qū)е耈GT1A1表達下降,使得失活代謝產(chǎn)物SN-38G生成減少,繼而引發(fā)具有更強細胞毒作用的活性代謝產(chǎn)物SN-38在體內(nèi)蓄積,最終引起因粒細胞缺乏而導(dǎo)致的骨髓抑制以及因腸道蓄積而產(chǎn)生的嚴(yán)重遲發(fā)性腹瀉[12-13]。

本研究將360例經(jīng)病理確診的老年結(jié)直腸癌病人石蠟樣本納為分析對象,對UGT1A1*28以及UGT1A1*6基因進行多態(tài)性分析。從單位點多態(tài)性統(tǒng)計結(jié)果顯示,在老年結(jié)直腸癌病人中,兩種突變類型皆為野生型>雜合突變型>純合突變型,并且基因型分布在4個不同臨床特征間差異均無統(tǒng)計學(xué)意義。有研究報道,UGT1A1*6是存在于亞洲人群的一種特有的UGT1A1突變類型[14],特別在粒細胞缺乏上,UGT1A1*6純合突變型(A/A)較之雜合突變型(G/A)風(fēng)險更高[15]。UGT1A1*6基因突變者SN-38轉(zhuǎn)變?yōu)镾N-38G的能力比UGT1A1*28突變者更低,因此攜帶UGT1A1*6突變基因的病人發(fā)生骨髓抑制或腹瀉等嚴(yán)重不良反應(yīng)的概率更高[16]。而雙位點交叉統(tǒng)計分析顯示,在老年結(jié)直腸癌病人中兩基因位點至少存在一種突變(包括雜合突變與純合突變)的基因型占比過半,且UGT1A1*6雜合突變與純合突變概率均大于UGT1A1*28,同樣未見雙位點突變分布在4種臨床特征中差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

研究表明,老年結(jié)直腸癌病人分期越晚預(yù)后越差,存活期越短[17]。由于其年老體弱以及基礎(chǔ)疾病的存在,合并UGT1A1基因突變者,對化療藥的耐受性更低,因此基于分子病理進行聯(lián)合位點檢測更能為CPT-11對老年病人的細胞毒作用作出有效預(yù)測,從而指導(dǎo)臨床用藥,提高藥物的療效。然而,UGT1A1*28與UGT1A1*6任一基因為純合突變時,是否與另一方突變排斥,尚未有文獻報道,有待進一步研究。