王升升，段珍，周培，張吉宇

（蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院，蘭州大學(xué)草種創(chuàng)新與草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)全國重點實驗室，甘肅 蘭州 730020）

氮元素是所有植物維持正常生長發(fā)育不可或缺的生命元素，缺氮會抑制植物生長發(fā)育，導(dǎo)致農(nóng)作物產(chǎn)量下降［1-2］。盡管空氣中含有 78%的惰性氮素，但由于活化惰性氣體極其困難，氮氣難以被大多數(shù)植物直接利用，且土壤本身的含氮化合物十分匱乏，嚴(yán)重限制了作物產(chǎn)量［3］。所以在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中經(jīng)常使用工業(yè)氮肥來提升作物產(chǎn)量，但目前，農(nóng)業(yè)生產(chǎn)嚴(yán)重依賴工業(yè)化肥的投入，我國平均每年的氮肥使用量為 305 kg·hm-2，氮的利用效率只有0.25，然而全球的氮利用效率為 0.42［4-6］，且農(nóng)業(yè)土壤中積累的工業(yè)氮肥對環(huán)境和人類健康產(chǎn)生了諸多危害，包括土壤大面積酸化、地下水污染、氧化亞氮等溫室氣體的積累［6］。為了實現(xiàn)綠色農(nóng)業(yè)的可持續(xù)發(fā)展，提高作物生產(chǎn)的氮利用效率，亟須在農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中找到可持續(xù)的綠色氮素供應(yīng)方式來代替工業(yè)氮肥［7］。

生物固氮是地球生態(tài)系統(tǒng)中氮素來源最主要的形式，全球有 70%的結(jié)合態(tài)氮產(chǎn)自生物固氮，地球上每年通過生物固氮可生產(chǎn) 2 億t 的氮素量［7］，其中最主要的來源是豆科（Leguminosae）植物與根瘤菌的共生固氮［3］。豆科植物種類眾多，其成員遍布全球［8］，大多數(shù)豆科植物能與根瘤菌形成共生固氮關(guān)系，在豆科植物根部形成根瘤器官，將空氣中的氮氣轉(zhuǎn)換為可供植物利用的氨態(tài)氮［9］。豆科植物與根瘤菌的共生固氮使得豆科植物能夠在氮匱乏的環(huán)境中正常生長發(fā)育［10］，同時能夠向土壤中輸入大量的氮、磷、鐵等營養(yǎng)元素，從而改善土壤質(zhì)量［11］，使得豆科植物成為了全球生態(tài)系統(tǒng)中的重要物種，而豆科植物與根瘤菌的共生固氮關(guān)系成為最有潛力的可持續(xù)綠色氮素供應(yīng)方式。

豆科植物與根瘤菌之間通過復(fù)雜的信號交流形成共生固氮關(guān)系，目前在豆科模式植物中通過正反向遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)了 200 多個調(diào)控共生固氮的基因［12］，一些關(guān)鍵基因的突變和缺失將導(dǎo)致侵染線和根瘤的形成及發(fā)育受阻。例如，百脈根（Lotus japonicus）LjNUP85基因的突變體，與根瘤菌共生后無法形成正常的根瘤［13］；蒺藜苜蓿（Medicago truncatula）中MtLIN基因的突變導(dǎo)致無法形成侵染線［14］。其中，通過正向遺傳學(xué)發(fā)現(xiàn)的基因?qū)τ诙箍浦参锱c根瘤菌的共生固氮影響最大，在豆科模式植物中通過甲基磺酸乙酯（ethylmethane sulfonate，EMS）誘變產(chǎn)生了大量共生固氮相關(guān)的突變體［12，15］，按照表型分為不能形成根瘤或侵染線的結(jié)瘤缺失型突變體［16］和能形成白色或綠色等小根瘤但不能進行固氮或固氮能力顯著下降的固氮缺失型突變體［17］。這些突變體被用于共生固氮體系的建立和宿主結(jié)瘤基因的研究中，發(fā)現(xiàn)了參與共生信號通路的關(guān)鍵結(jié)瘤基因［18］。但豆科植物與根瘤菌的共生固氮過程非常復(fù)雜，根瘤菌侵入宿主根細(xì)胞后建立共生關(guān)系的許多過程仍然未知，所以亟須挖掘新的共生固氮基因。

草木樨（Melilotus）是一年生或兩年生的二倍體豆科草本植物［19-20］，白花草木樨（Melilotus albus）是該屬最常見的生產(chǎn)利用種之一［21］。草木樨固氮能力強，能夠改善土壤質(zhì)量，被用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作物輪作系統(tǒng)［22］，且已通過連續(xù)輪回選育，育成了草木樨低香豆素新材料［23-24］。但目前對草木樨與根瘤菌共生固氮的機制研究較少，本研究以白花草木樨野生型Ma389 經(jīng)EMS 誘變后的3 種結(jié)瘤缺失型突變體（Ma58、Ma61、Ma62）為材料［25］，在前期的研究基礎(chǔ)上［26］，對3 種結(jié)瘤缺失突變體植株的結(jié)瘤表型和生物量進行分析，并對突變體Ma62 的根瘤進行切片觀察，為進一步闡明豆科植物與根瘤菌的共生固氮機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

1.1.1 植物材料 白花草木樨野生型Ma389，野生型經(jīng)EMS 誘變產(chǎn)生的突變體Ma58、Ma61 和Ma62 均由加州大學(xué)洛杉磯分校的Ann M. Hirsch 教授友情提供。2022 年4 月在蘭州大學(xué)草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院智能溫室（16 h 光照26 °C/8 h 黑暗18 °C）內(nèi)種植培養(yǎng)。

1.1.2 菌株 本試驗使用的根瘤菌是苜蓿中華根瘤菌（Sinorhizobium meliloti，SM1021）。

1.1.3 培養(yǎng)基 TY 培養(yǎng)基（1 L）：蛋白胨5.0 g，酵母提取物3.0 g，無水CaCl? 0.9 g，pH=7.4（固體培養(yǎng)基加15.0 g 瓊脂）。1×PBS 液體（1 L）：NaCl 8.0 g，KCl 0.2 g，Na2HPO41.44 g，KH2PO40.24 g，pH=7.4。MS 營養(yǎng)液（1 L）：MS 培養(yǎng)基（Solarbio）4.74 g。無氮營養(yǎng)液（1 L）：改良霍格蘭營養(yǎng)液（無氮、不含硝酸鈣）（海博生物技術(shù)有限公司） 0.635 g。

1.2 試驗方法

1.2.1 材料種植條件 挑選顆粒飽滿的野生型Ma389 和突變體Ma58、Ma61 和Ma62 的種子，用砂紙破除硬實后，使用 75%的乙醇處理30 s，5%的次氯酸鈉溶液處理5 min 進行表面消毒［22］。將處理好的種子放入鋪有兩層濾紙的培養(yǎng)皿中，加入少量蒸餾水后用錫箔紙外包放入4 ℃冰箱春化2 d，再放到25 ℃培養(yǎng)箱（16 h 光照/8 h 黑暗）萌發(fā)5 d 后，分別移至富氮和低氮基質(zhì)的花盆中生長，生長一周后在植物根部接種根瘤菌。富氮基質(zhì)：滅菌蛭石（MS 營養(yǎng)液澆灌），低氮基質(zhì)：滅菌蛭石（自來水澆灌），富氮基質(zhì)和低氮基質(zhì)澆水次數(shù)保持一致，每組試驗設(shè)置5 個生物學(xué)重復(fù)，每隔10 d 觀察記錄植株生長性狀，直至觀察至接種后50 d 為止。

1.2.2 根瘤菌培養(yǎng)和接菌 取保存于-80 ℃冰箱的SM1021 菌株，在超凈工作臺中用滅菌的接種環(huán)在固體TY 培養(yǎng)基上進行劃線，30 ℃倒置培養(yǎng)3～4 d，挑取單菌落于10 mL 液體 TY 培養(yǎng)基的離心管中，200 r·min-1下培養(yǎng) 2 d，按照菌液和液體 TY 培養(yǎng)基比例為 1∶200 的體積進行擴繁，30 ℃搖床下培養(yǎng) 36 h。

使用分光光度計（UV7558 紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司）和滅菌雙蒸水將菌液濃度調(diào)制 OD600=0.1，使用注射器在每株草木樨的根部注射10 mL 進行接菌。

1.2.3 根瘤切片觀察 取野生型Ma389 和突變體Ma62 的根瘤于1.5 mL 離心管中，加入1 mL 1×PBS 液體保存。用1 mL 2.5%～4.0%的沃爾醛溶液替換1×PBS 液體后抽真空30 min，放于4 ℃冰箱過夜，用1×PBS 液體洗3 次，間隔10 min，再依次用10%，20%，30%，50%，70%，80%，90%，100%的酒精進行替換，間隔40 min（用70%的酒精替換后可以保存較長時間，放于 4 ℃冰箱），100%的酒精替換4 h 后，再依次用無水乙醇∶樹脂=2∶1，無水乙醇∶樹脂=1∶2，全樹脂進行替換，間隔2～4 h。

配置樹脂∶凝固劑=15∶1 的液體加到包埋板中，每個小孔400 mL，將替換到全樹脂的根瘤，轉(zhuǎn)移到包埋板的小孔中，盡可能將其放在底部，封上合適大小的封口膜，等其凝固進行切片后，用 TBO 染色劑染色3 min，用雙蒸水沖洗干凈（所有切片染色程度應(yīng)相同），晾干后在體視顯微鏡（leica zoom 2000TM，上海佑科儀器儀表有限公司）下觀察，并拍照記錄。

1.3 數(shù)據(jù)處理

使用Microsoft Excel 2010 對所有數(shù)據(jù)進行統(tǒng)計分析，以計算平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤差。

2 結(jié)果與分析

2.1 野生型與3 種突變體的結(jié)瘤表型鑒定

為了觀察白花草木樨野生型Ma389 及其突變體Ma58、Ma61 和Ma62 的結(jié)瘤表型，將萌發(fā)的種子移至裝有蛭石的花盆中，用無氮營養(yǎng)液進行澆灌，生長一周后接種苜蓿中華根瘤菌SM1021。取接種3 d 后的野生型與3 種突變體的根在體視顯微鏡下觀察根毛形態(tài)，以未接種根瘤菌的根作為對照。本研究檢測到野生型Ma389 接種根瘤菌后的根毛呈顯著彎曲變形（圖1 A，E），而突變體 Ma58（圖1 B，F(xiàn)）中觀察到根毛在接種后顯示出近端膨脹和輕微彎曲的變形情況，突變體Ma61（圖1 C，G）和Ma62（圖1 D，H）的根毛在接種后僅顯示出頂端稍微腫脹的有限變形情況，結(jié)果表明相比于野生型Ma389，突變體Ma58，Ma61 和Ma62 接種根瘤菌后根毛顯示出異常和有限的變形情況，推測這3 種突變體的共生信號傳導(dǎo)在早期階段可能就被阻斷。

圖1 野生型與3 種突變體的根毛接種苜蓿中華根瘤菌后的變化Fig.1 Responses of root hairs from wild-type and three mutants inoculated with SM1021

接種30 d 后觀察野生型與3 種突變體的結(jié)瘤表型，野生型Ma389 能夠形成正常的粉色根瘤（圖2 A），平均每株形成21 個根瘤（圖3）。突變體Ma58、Ma61 不形成根瘤，甚至不形成根瘤原基（圖2 B，C）。突變體Ma62 能夠形成少量的白色根瘤（圖2 D），平均每株形成5 個根瘤（圖3），根瘤大小遠(yuǎn)小于野生型。

圖2 野生型與3 種突變體植株30 d 時的根部結(jié)瘤表型Fig. 2 Root nodulation phenotypes of wild-type and three mutants at 30 days

圖3 野生型與3 種突變體植株30 d 時的根瘤數(shù)Fig. 3 Nodule number of wild-type and three mutants at 30 days

2.2 野生型Ma389 與突變體Ma62 根瘤細(xì)胞的切片觀察

為了進一步觀察野生型Ma389 與突變體Ma62 的根瘤細(xì)胞，取Ma389 和Ma62 接種根瘤菌后30 d 的根瘤進行切片染色觀察。研究發(fā)現(xiàn)與野生型Ma389（圖4 A，C）相比，突變體Ma62 的根瘤細(xì)胞顯示沒有根瘤菌的定殖（圖4 B，D），表明由于突變體Ma62 在接種后根毛中沒有形成侵染線，根瘤菌進入根瘤器官的途徑被阻斷，導(dǎo)致突變體Ma62 的根瘤細(xì)胞中沒有定殖根瘤菌，這與前期的研究結(jié)果一致［26］。突變體Ma62形成的少數(shù)白色根瘤為無效根瘤，無法利用空氣中的氮源為植物提供氮素營養(yǎng)。

圖4 野生型Ma389 與突變體Ma62 的根瘤切片表型Fig.4 Root nodule section phenotype of wild-type Ma389 and mutant Ma62

2.3 野生型與3 種突變體的生物量分析

在低氮基質(zhì)中生長的白花草木樨野生型和3 種突變體，在接種根瘤菌后生長至30 d 時，3 種突變體的地上部鮮/干質(zhì)量、株高和根長與野生型相比無顯著差異，而突變體Ma58、Ma61 的根鮮/干質(zhì)量顯著小于野生型（P＜0.05），Ma62 的根鮮/干質(zhì)量與野生型相比無顯著差異。植株生長至40 d 以后，3 種突變體的各性狀均低于野生型（P＜0.05），其中突變體Ma58、Ma61 的地上部鮮/干質(zhì)量顯著低于野生型（P＜0.01）（圖5）。結(jié)果表明，在低氮基質(zhì)中生長時，由于野生型Ma389 在接種根瘤菌后能夠形成正常的根瘤，可以利用空氣中的氮氣為植物提供氮源來維持植物正常生長，但突變體Ma58，Ma61 和Ma62 在接種根瘤菌后無法形成根瘤或只能形成少量的白色無效根瘤，沒有固氮能力，無法提供植株生長所需的氮源（圖6）。

圖5 低氮基質(zhì)中野生型與3 種突變體植株的生物量Fig.5 Biomass of wild-type and three mutants in low nitrogen substrate

圖6 低氮基質(zhì)中野生型與3 種突變體植株30 d 時的表型Fig.6 Phenotypes of wild-type and three mutants at 30 days in low nitrogen substrate

在富氮基質(zhì)中生長的白花草木樨的野生型和3 種突變體，在接種根瘤菌后生長至50 d 時，3 種突變體的地上部鮮/干質(zhì)量、根鮮/干質(zhì)量、株高和根長與野生株相比無顯著差異（圖7）。結(jié)果表明，在富氮基質(zhì)中生長時，雖然突變體Ma58，Ma61 和Ma62 無法通過自身固氮為植株提供氮源，但能夠通過根系吸收基質(zhì)中的氮源來維持植物正常的生長發(fā)育，所以突變體植株的各性狀與野生型相比無明顯差異（圖8）。這說明突變體Ma58，Ma61 和Ma62 的突變基因只與根瘤菌的共生固氮機制相關(guān)。

圖7 富氮基質(zhì)中野生型與3 種突變體植株的生物量Fig.7 Biomass of wild-type and three mutants in rich nitrogen substrate

圖8 富氮基質(zhì)中野生型與3 種突變體植株30 d 時的表型Fig.8 Phenotypes of wild-type and three mutants at 30 days in rich nitrogen substrate

3 討論

3.1 豆科植物與根瘤菌共生固氮關(guān)系的建立

豆科植物與根瘤菌之間通過一系列復(fù)雜的信號識別和相互作用形成根瘤，這個過程主要分為侵染線的形成和根瘤器官的形成兩個部分［12］。首先，在低氮條件下豆科植物根際釋放的類黃酮化合物會吸引土壤中的根瘤菌富集在植物根部并誘導(dǎo)其分泌結(jié)瘤因子（nod factor，NFs）［27］，豆科植物根部表皮細(xì)胞膜上的結(jié)瘤因子受體（nod factors reception，NFRs）會特異性識別和結(jié)合NFs，引起植物根毛頂端腫脹和根毛彎曲變形［28］，彎曲的根毛內(nèi)包裹根瘤菌細(xì)胞形成侵染點，并隨著局部細(xì)胞壁的降解和細(xì)胞膜的凹陷不斷伸長，形成內(nèi)含根瘤菌的侵染線［29］。同時，根瘤菌刺激植物根皮層細(xì)胞不斷分裂，在根毛上局部性體積膨大后形成根瘤原基，根瘤菌通過在侵染線中不斷增殖運動到根瘤原基，最終發(fā)育為具有固氮能力的成熟根瘤［30］。

目前在豆科模式植物中建立了共生固氮早期信號傳導(dǎo)模型［12］，豆科植物的NFRs 在感知到根瘤菌釋放的NFs 后會將結(jié)瘤信號從胞外向胞內(nèi)傳遞到下游，NFRs 一般為LysM 型受體樣激酶，例如蒺藜苜蓿中的LYK3、NFP和百脈根中的NFR1、NFR5［31］，二者形成異源二聚體后共同激活共生受體樣激酶基因（MtDMI2和LjSYMRK）的表達［16］，并引起鈣離子振蕩反應(yīng)，核孔蛋白（LjNUP85、LjNUP133）和陽離子通道蛋白（LjPOLLUX、LjCASTOR、MtDMI1）參與鈣離子信號從細(xì)胞膜內(nèi)傳遞到細(xì)胞核內(nèi)［32］，而細(xì)胞核內(nèi)的鈣和鈣調(diào)依賴的蛋白激酶（LjCCaMK、MtDMI3）能夠解析鈣離子信號［33］，再將信號傳遞到下游的轉(zhuǎn)錄因子NSP1 和NSP2，二者相互作用激活nin 的表達［34］。

基于豆科模式植物蒺藜苜蓿和百脈根生長周期短，均為二倍體植物，基因組都較小，并建立了較為完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系等優(yōu)勢，豆科植物與根瘤菌的共生固氮的理論研究目前主要集中在蒺藜苜蓿和百脈根中［35］。但草木樨作為豆科優(yōu)良牧草，也擁有生長周期短，二倍體植物等優(yōu)點，且本課題組已完成了草木樨的基因組測序工作［36］，建立了發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化技術(shù)［24］，符合基礎(chǔ)理論研究的條件，但草木樨與根瘤菌的共生固氮基因的研究尚未見報道。

3.2 正向遺傳學(xué)篩選的豆科植物共生固氮相關(guān)突變體

正向遺傳學(xué)是指生物通過大規(guī)模自發(fā)或人工隨機誘變，通過從發(fā)育異常的突變個體中篩選相關(guān)的表型和性狀，再尋找到突變的基因并研究其功能［15］。在豆科植物與根瘤菌共生固氮的正向遺傳學(xué)研究中，豆科模式植物通過EMS 誘變產(chǎn)生的與共生固氮相關(guān)的突變體，按照表型主要分為兩種根瘤異常突變體，一種是不能形成根瘤原基，或不能形成正常的侵染線，根瘤菌侵染在早期階段被阻斷，稱為結(jié)瘤缺失型突變體［16］，例如symrk突變體在接種根瘤菌后根毛會出現(xiàn)膨大的現(xiàn)象，但是沒有根毛彎曲的表型無法形成根瘤［16］，nin突變體不能形成侵染線和根瘤原基［37］。一種是該突變體能夠形成白色或者綠色等的小根瘤，或形狀發(fā)育異常的根瘤，根瘤中類菌體不能分化或者已經(jīng)死亡，導(dǎo)致其固氮能力顯著下降或者不能進行固氮，稱為固氮缺失型突變體［17］，例如mtlin突變體只能形成少數(shù)白色的根瘤［14］。豆科植物與根瘤菌的共生固氮早期信號傳導(dǎo)模型中起關(guān)鍵作用的基因，大多都是在經(jīng)過正向遺傳學(xué)篩選的突變體中發(fā)現(xiàn)的［35］。

本研究中，使用白花草木樨野生型Ma389 和經(jīng)EMS 誘變產(chǎn)生的突變體Ma58，Ma61，Ma62，接種根瘤菌后，突變體Ma58 的根毛出現(xiàn)近端腫脹和輕微變形的現(xiàn)象，突變體Ma61 和Ma62 的根毛僅表現(xiàn)出頂端稍微腫脹的有限變形情況。對3 種突變體接種根瘤菌后30 d 觀察到，突變體Ma58，Ma61 不產(chǎn)生根瘤，甚至沒有根瘤原基，推測這兩種突變體中調(diào)控根瘤器官形成的信號通路在開始階段就被阻斷，突變體Ma62 只形成少數(shù)白色的小根瘤，根瘤數(shù)量和大小遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于野生型Ma389。對突變體Ma62 的根瘤進行切片觀察發(fā)現(xiàn)，其根瘤中沒有根瘤菌的定殖。前期研究也表明這3 種突變體均沒有侵染線的形成［24-25］，因此這3 種突變體均屬于結(jié)瘤缺失型突變體。分別觀察在低氮和富氮基質(zhì)中白花草木樨野生型和3 種突變體的生物性狀，發(fā)現(xiàn)在低氮基質(zhì)中突變體Ma58 和Ma61 在生長30 d 時，根鮮/干質(zhì)量顯著小于野生型（P＜0.05），而突變體與野生型相比Ma62 無顯著差異，推測Ma62 經(jīng)EMS 誘變程度相比于Ma58 和Ma61 較低，但3 種突變體生長至40 d 以后，地上部鮮/干質(zhì)量、根鮮/干質(zhì)量、株高和根長等性狀均顯著低于野生型（P＜0.05）。而在富氮基質(zhì)中3 種突變體植株的各性狀與野生型相比無顯著差異，這說明突變體Ma58，Ma61 和Ma62 中的突變基因只與共生固氮相關(guān)。

3.3 白花草木樨結(jié)瘤缺失型突變體Ma58，Ma61 和Ma62 研究前景分析

本研究表明白花草木樨突變體Ma58，Ma61 和Ma62 為結(jié)瘤缺失型突變體，且突變基因只與共生固氮相關(guān)。因為突變體Ma58，Ma61 不形成根瘤原基和侵染線，突變體Ma62 不能形成侵染線，且只能形成少數(shù)白色根瘤，所以推測這3 種突變體的突變基因在共生固氮信號傳導(dǎo)早期階段。為了進一步確定這3 種突變體中與共生固氮相關(guān)的突變基因，后期計劃將這3 種突變體分別與白花草木樨野生型Ma389 進行雜交，并以突變體作為母本，野生型Ma389 作為父本，獲得F1代后，F(xiàn)1代經(jīng)自交產(chǎn)生F2代，觀察F2代植株的結(jié)瘤表型分出突變體表型的單株，采集突變體表型的植株樣品和野生型的樣品分別構(gòu)建DNA 混池，以草木樨基因組為參考基因組［36］，通過混合群體分離分析法（bulked segregant analysis，BSA）重新測序定位草木樨生物固氮相關(guān)基因，篩選候選區(qū)域中有SNP 或Indel 的基因，通過發(fā)根農(nóng)桿菌介導(dǎo)的毛狀根轉(zhuǎn)化技術(shù)進行突變基因的功能驗證，以此來挖掘新的共生固氮基因，為進一步闡明共生固氮早期信號傳導(dǎo)途徑提供新的理論依據(jù)。

4 結(jié)論

本研究對白花草木樨野生型Ma389 和經(jīng)EMS 誘變產(chǎn)生的突變體Ma58，Ma61，Ma62 在接種根瘤菌后的表型和生物量進行了觀察和分析，結(jié)果顯示突變體Ma58，Ma61 無法形成侵染線和根瘤原基，突變體Ma62 不能形成侵染線，只形成不固氮的白色小根瘤，表明這3 種突變體均屬于結(jié)瘤缺失型突變體。在低氮基質(zhì)中生長的突變體植株在 30 d 開始各生物性狀均顯著低于野生型，而在富氮基質(zhì)中則無顯著差異，表明突變基因只與共生固氮相關(guān)，且突變基因定位在共生固氮信號傳導(dǎo)早期階段。白花草木樨突變體與根瘤菌共生的表型鑒定和生物量分析為豆科植物共生固氮機制研究提供了重要參考，也為草木樨種質(zhì)利用和遺傳育種提供了科學(xué)依據(jù)。