吳康，蘇安琪，田雪嬌，李傳收，付志順，楊靜靜，宿紅艷

(魯東大學農學院，山東煙臺 264025)

納米材料和植物納米生物技術是新興的正處于發(fā)展中的國際前沿研究領域，其對世界經濟發(fā)展以及人們的生產生活會產生非常重要的影響。碳納米管(carbon nanotubes，CNTs)是一種工程碳基納米材料，按照所含石墨烯片的層數(shù)可分為單壁碳納米管(SWCNTs)和多壁碳納米管(MWCNTs)。 目前，CNTs 已被廣泛應用于航空航天、醫(yī)療、工業(yè)等領域[1-4]。 隨著納米技術的發(fā)展，CNTs在植物生物技術以及農業(yè)領域(例如納米農藥、納米肥料、納米殺蟲劑或納米仿生)的應用受到越來越多的關注[5-6]。 因此，探究CNTs 對植物生長發(fā)育的影響及其在植物生長發(fā)育中的響應機制，對促進其更好地應用于農業(yè)生產和作物管理具有重要意義。

目前國內外已經開展過一系列關于CNTs 影響植物生長發(fā)育的研究。 現(xiàn)階段有關CNTs 對植物生長影響的研究大致持兩種觀點:一部分研究認為CNTs 對植物生長有促進作用或者沒有明顯毒性作用，另一部分研究則認為CNTs 能夠通過影響植物根系水分吸收、光合作用等過程抑制種子萌發(fā)和幼苗生長。 Ca?as 等[7]研究表明，相對低劑量的SWCNTs 可以穿透種皮，促進番茄幼苗生長；相反地，Stampoulis 等[8]的研究表明，1 000 mg/L MWCNTs 會誘導細胞產生大量活性氧(ROS)并損傷抗氧化系統(tǒng)，擾亂正常代謝及信號轉導過程導致其生物量降低。 此外，有研究表明適宜濃度的CNTs 可以調節(jié)細胞內抗氧化酶(如SOD、POD 和CAT)活性，進而提高植物對鹽脅迫的耐受性[9-11]。 可以看出，CNTs 對植物生長的利弊與其自身特性、環(huán)境條件及植物種類密切相關。

雖然目前關于CNTs 對作物生長發(fā)育的影響已有大量研究報道，但受試物種主要集中在擬南芥、番茄、小麥、紅波菜和水稻等模式植物及禾本科植物上，而關于CNTs 對木本植物蘋果生長影響的研究尚未見報道。 鑒于此，本試驗以蘋果砧木平邑甜茶幼苗為材料，測定分析不同濃度(0、10、20 mg/L)羧基化單壁碳納米管(SWCNTs)對平邑甜茶幼苗生長、葉片光合作用、葉綠素含量以及抗氧化酶活性的影響，旨在探討SWCNTs 對平邑甜茶幼苗生長的影響和作用機理，以期為CNTs在環(huán)境和農業(yè)生產上的安全使用和處理處置提供一定的科學依據。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于2020—2021 年在魯東大學農學院試驗基地進行。 2021 年2 月1 日挑選飽滿一致的平邑甜茶種子，用0.2%高錳酸鉀消毒30 min，流水沖洗12 h，然后置于4 ℃下沙藏40 天。 SWCNTs 干粉購自中國科學院成都有機化學有限公司(http:/ /www.cioc.ac.cn/)，產品具體參數(shù)見表1。

表1 羧基化單壁碳納米管(SWCNTs)參數(shù)

1.2 試驗設計與處理

2021 年3 月中旬選擇露白一致的平邑甜茶種子播種于穴盤(540 mm×280 mm)中，其育苗基質為蛭石與營養(yǎng)土混合(1∶1)基質，待長至4 片真葉時移栽到培養(yǎng)缽(7 cm×7 cm)中，之后進行正常肥水管理。 稱取一定量的SWCNTs 粉末加入到去離子水中，超聲分散(100 W、40 Hz)1 h，配制成不同濃度(0、10 mg/L 和20 mg/L)SWCNTs 懸浮液。 待植株長至8 片真葉時，選擇長勢一致的幼苗，分為3 組，以15 棵苗為1 組，葉面噴施0、10 mg/L 和20 mg/L SWCNTs 懸浮液，分別記為CNTs0、CNTs10 和CNTs20 處理。 每個處理獨立重復3 次。 約20 天后，植株表型出現(xiàn)明顯差異，收集暴露于SWCNTs 的植株葉片以供指標分析。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 生物量測定 處理20 天時，每組隨機選取5 株平邑甜茶幼苗，用米尺測定株高；取地上部莖葉用分析天平稱取鮮重，之后放入烘箱內，105 ℃殺青30 min 后70 ℃連續(xù)烘干72 h，至恒重時記為干重。

1.3.2 光合速率及葉綠素含量測定 選擇上午9∶00—11∶00，用LI-6400 光合測定儀測定植株功能葉的光合速率。 葉綠素含量測定采用分光光度法[12]，即利用95%乙醇提取色素，分別測定665、649 nm 處的OD 值，計算葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總含量。

1.3.3 抗氧化酶活性和其它理化指標測定 超氧化物歧化酶(SOD)活性采用氮藍四唑(NBT)法測定[13]；過氧化物酶(POD)活性采用愈創(chuàng)木酚法測定[14]；過氧化氫酶(CAT)活性采用紫外分光光度法測定[15]。 丙二醛(MDA)含量采用硫代巴比妥酸法測定[16]；過氧化氫(H2O2)含量采用TiCl4沉淀法測定[17]。

1.3.4 AsA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)指標測定 抗壞血酸(AsA) 和脫氫抗壞血酸(DHA) 含量參照Ma等[18]的方法測定。 谷胱甘肽(GSH)和氧化型谷胱甘肽(GSSG)含量參照Anderson 等[19]的方法測定。 抗壞血酸過氧化物酶(APX)活性的測定[20]，監(jiān)測APX 氧化AsA 引起的290 nm 處光吸收值的下降。 脫氫抗壞血酸還原酶(DHAR)活性的測定[21]，監(jiān)測由AsA 的生成引起的265 nm 處吸光值的上升。 谷胱甘肽還原酶(GR) 活性的測定[22]，監(jiān)測由NADPH 氧化所引起的340 nm 處吸光值的下降。

1.3.5 透射電子顯微鏡(TEM)觀察SWCNTs 在葉片細胞中的分布 將對照和暴露于SWCNTs 的植株葉片放于固定液中，用手術刀切割組織取樣1 mm3左右，經脫水、包埋、切片、染色后于透射電子顯微鏡下觀察，并采集圖像分析。

1.4 數(shù)據處理與分析

試驗數(shù)據采用Microsoft Excel 2019 和IBM SPSS Statistics 25.0 軟件進行統(tǒng)計分析和作圖，用One-way ANOVA 方法進行Duncan’s 檢驗(P＜0.05)，數(shù)據取平均值±標準差(n ＝3，3 個生物學重復)。

2 結果與分析

2.1 葉面噴施SWCNTs 對平邑甜茶幼苗地上部生長的影響

如圖1 所示，葉面噴施SWCNTs 可顯著影響平邑甜茶幼苗株高、地上部鮮重和干重。 與對照相比，不同濃度SWCNTs 處理下，平邑甜茶幼苗株高、地上部鮮重和干重均有不同程度提高，其中10 mg/L SWCNTs 處理下平邑甜茶幼苗株高顯著增高21.2%，地上部鮮重顯著增加25.7%。

圖1 不同濃度SWCNTs 處理下平邑甜茶幼苗表型

2.2 葉面噴施SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片光合作用和葉綠素含量的影響

圖2顯示，與對照相比，葉面噴施SWCNTs 顯著提高平邑甜茶幼苗葉片的凈光合速率，其中10、20 mg/L SWCNTs 處理凈光合速率分別提高10.9%和12.3%。 隨著SWCNTs 濃度升高，葉綠素a、葉綠素b 和葉綠素總含量均有不同程度提高，其中，20 mg/L SWCNTs 處理葉綠素a 含量提高11.7%，葉綠素b 含量提高16.4%，葉綠素總含量提高13.3%。

圖2 不同濃度SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片光合作用的影響

2.3 葉面噴施SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片MDA 和H2O2含量的影響

如圖3 所示，與對照相比，噴施10、20 mg/L SWCNTs 處理平邑甜茶幼苗葉片的丙二醛(MDA)和過氧化氫(H2O2)含量略微增加。 這表明該濃度范圍內SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片沒有產生明顯的毒性作用。

圖3 不同濃度SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片MDA 和H2O2含量的影響

2.4 葉面噴施SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

如圖4 所示，葉面噴施SWCNTs 可提高平邑甜茶幼苗葉片SOD、POD、CAT、DHAR、APX、GR活性。 SWCNTs 處理組平邑甜茶幼苗葉片SOD、CAT 活性顯著高于對照，其中10 mg/L SWCNTs 處理葉片CAT 活性較對照提高23.7%(P＜0.05)，20 mg/L SWCNTs 處理葉片SOD、POD、CAT 活性較對照分別提高25.5%、11.9%和19.6%(P＜0.05)。葉面噴施SWCNTs 后平邑甜茶幼苗葉片APX、DHAR、GR 活性均有不同程度的升高，與對照相比，10 mg/L SWCNTs 處理葉片APX、DHAR、GR活性分別提高28.9%、44.8%和16.6%(P＜0.05)，但10、20 mg/L SWCNTs 處理之間DHAR 和GR活性無顯著差異。

圖4 不同濃度SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片抗氧化酶活性的影響

2.5 葉面噴施SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片非酶抗氧化物質含量的影響

如圖5 所示，與對照相比，10 mg/L SWCNTs處理下，平邑甜茶幼苗葉片AsA、GSH 含量分別提高26.1%和18.2%(P＜0.05)，而DHA、GSSG 含量分別降低21.9%和10.5%(P＜0.05)，AsA/DHA和GSH/GSSG 的比值分別升高49.8%和49.3%。

圖5 不同濃度SWCNTs 對平邑甜茶幼苗葉片非酶抗氧化物質含量的影響

2.6 SWCNTs 在平邑甜茶幼苗葉片中的分布

為了探究SWCNTs 在平邑甜茶幼苗葉片中的吸收和積累情況，利用透射電子顯微鏡(TEM)對平邑甜茶葉片進行觀察。 如圖6 所示，經SWCNTs 處理的葉片細胞中分布著黑色顆粒團聚體，而對照葉片細胞中沒有黑色束或團聚體。 這一結果表明，SWCNTs 能被平邑甜茶葉片吸收。

圖6 對照(A)和20 mg/L SWCNTs 處理(B)平邑甜茶幼苗葉片透射電鏡(TEM)結果

3 討論與結論

碳納米管(CNTs)對植物生長的積極影響及其潛在機制先前已有報道。 例如，Seddighinia等[23]研究發(fā)現(xiàn)50 mg/L MWCNTs 促進了苦瓜根系和莖的伸長。 我們最近的研究表明，土壤澆灌50、100 mg/L SWCNTs 顯著上調楊樹莖中纖維素和木質素合成酶(CesA、PAL 和C4H)的活性，促進楊樹莖中纖維素和木質素的積累[24]。 本研究中，葉片噴施10、20 mg/L SWCNTs 促進平邑甜茶幼苗地上部的生長。

光合作用在植物生命活動中具有重要意義，納米材料的應用有助于提高植物光合速率，促進植物生長[25]。 Zhang 等[26]發(fā)現(xiàn)，20 mg/L SWCNTs 增加水稻葉片葉綠素含量，促進水稻幼苗葉片的光合作用及其生長發(fā)育，顯著上調水稻葉綠體發(fā)育所必需的VIRESCENT2 和YGL138(t)基因的轉錄水平。 本試驗中，葉片噴施10、20 mg/L SWCNTs 顯著提高葉片葉綠素a、葉綠素b 和總葉綠素含量。 光合色素可以通過清除ROS 保護葉綠體，從而減少葉片中的氧化損傷[27]。 葉綠素含量增加表明平邑甜茶幼苗葉片葉綠體保護機制可能被SWCNTs 激活。 最近的幾項研究表明，SWCNTs 可以有效地附著在植物光合反應中心的蛋白質上并與光合反應中心交換電子，提高電子傳遞的閾值以及光能利用效率，將光合作用活性提高3 倍以上[28-30]。 相反地，另一項研究表明，高劑量SWCNTs(300 mg/L)會引起光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應中心失活以及光系統(tǒng)Ⅰ(PSⅠ)末端的受體減少，導致葉綠體基粒和基質區(qū)的膨脹，顯著降低凈光合速率[30]。 本研究結果顯示，SWCNTs 能被平邑甜茶幼苗葉片吸收，但其是否能夠附著在葉綠體表面以及是否與葉綠體進行電子交換尚不確定。因此，平邑甜茶幼苗葉片增加的光合活性是由于SWCNTs 和葉綠體之間電子轉移的增加還是葉綠素含量增加所致仍需要進一步的探索。

許多研究表明，碳基納米材料可作為非生物激發(fā)因子誘導植物發(fā)生一定程度的氧化脅迫，但是植物可通過啟動體內抗氧化系統(tǒng)，包括抗氧化物質(AsA 和GSH)以及抗氧化酶(POD、SOD、CAT、APX、GR 和DHAR)，響應CNTs 造成的氧化脅迫[31-34]。 本研究結果顯示，10、20 mg/L SWCNTs 均能促進平邑甜茶幼苗葉片POD、SOD、CAT、APX、GR、DHAR 活性升高，這與CNTs 處理蘋果無菌苗、蠶豆和鼠尾草等植物中的結果相一致[35-37]。 此外，10、20 mg/L SWCNTs 處理提高平邑甜茶幼苗葉片AsA、GSH 含量，一定程度上降低DHA、GSSG 含量，從而顯著提高AsA/DHA、GSH/GSSG 比值。 較高的AsA/DHA 和GSH/GSSG 比值使抗氧化物質維持在較高的還原態(tài)，能夠直接猝滅ROS[38-39]。 本研究中，10、20 mg/L SWCNTs 處理下平邑甜茶幼苗葉片H2O2、MDA 含量比對照略高，但差異不顯著，表明抗氧化系統(tǒng)能正常清除ROS。

綜上所述，葉面噴施SWCNTs 能提高葉片葉綠素含量和光合作用，促進平邑甜茶地上部生長，上調抗氧化酶活性，加快ASA-GSH 循環(huán)系統(tǒng)的高效運轉，使植物細胞保持較高的抗氧化能力。