瞿子惠，劉歆，鄭琳，魏炳棟，閆曉剛，于維，陳龍，郎洪彥

(吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所，吉林公主嶺136100)

豆粕是食品和飼料領(lǐng)域常見(jiàn)的優(yōu)質(zhì)植物性蛋白來(lái)源。 豆粕中主要的抗原蛋白是大豆球蛋白和β-伴球蛋白，分別占豆粕總蛋白的30%和40%左右[1]。 當(dāng)幼齡仔豬攝入這類蛋白質(zhì)時(shí)，會(huì)引起過(guò)敏，導(dǎo)致吸收不良綜合征、生長(zhǎng)抑制和腹瀉。 此外，豆粕中還含有非淀粉多糖，主要由纖維素、半纖維素和果膠組成，被證實(shí)是導(dǎo)致斷奶仔豬腸道疾病的誘因[2]。 發(fā)酵豆粕通過(guò)添加有益微生物，如少孢根霉(Rhizopus oligosporus)、米曲霉(Aspergillus oryzae)、短乳桿菌(Lactobacillus brevis)或枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)，可以有效去除部分對(duì)動(dòng)物有害的抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而改善豆粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，提高動(dòng)物消化利用率[3-5]。

貝萊斯芽孢桿菌(Bacillus velezensis)作為芽孢桿菌中新劃分的一個(gè)種，于2016 年與B. methylotrophicus、B. amyloliquefacienssubsp. plantarum、B. oryzicola重新歸類并命名為B. velezensis[6]。 有關(guān)B. velezensis的研究集中于生物防治和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面[7-8]。 貝萊斯芽孢桿菌于2020 年被列入歐盟安全資格認(rèn)定(QPS)推薦的生物制劑列表中，可作為新型發(fā)酵飼料菌種[9]，有關(guān)B.velezensis在畜禽應(yīng)用的報(bào)道逐漸增多[10]，主要集中在飼料霉菌毒素[玉米赤霉烯酮(zearalenone，ZEN)和黃曲霉毒素B1(AFB1)]脫毒[11]和水產(chǎn)益生菌方面[12]。 本研究團(tuán)隊(duì)主要開(kāi)展有關(guān)B.velezensis在木質(zhì)纖維素利用方面的研究，前期成功分離并鑒定一株來(lái)自雞盲腸內(nèi)容物的B.velezensisCL-4，具有富產(chǎn)木質(zhì)纖維素酶優(yōu)勢(shì)，同時(shí)具有抑制病原細(xì)菌和真菌的能力，對(duì)動(dòng)物安全無(wú)毒，具有良好的益生特性[13]。 現(xiàn)已完成了該菌株的全基因組測(cè)序，并成功用于發(fā)酵玉米胚芽粕，獲得授權(quán)發(fā)明專利《一株禽源貝萊斯芽孢桿菌CL-4及其應(yīng)用》(專利號(hào):202110109964.X)。 豆粕常用發(fā)酵菌多為枯草芽孢桿菌[2]、釀酒酵母菌[14]、植物乳桿菌[15]等，僅有少數(shù)文獻(xiàn)報(bào)道了貝萊斯芽孢桿菌發(fā)酵豆粕的應(yīng)用[16]。 因此，本研究利用B. velezensisCL-4 發(fā)酵豆粕，探究發(fā)酵前后豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子、營(yíng)養(yǎng)成分、微生物、酶活力以及表觀形態(tài)等變化，旨在為生物蛋白飼料提供新型優(yōu)良菌種，為進(jìn)一步改善發(fā)酵豆粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)提供理論依據(jù)和數(shù)據(jù)支撐。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 菌株和發(fā)酵原料 菌種貝萊斯芽孢桿菌(B. velezensis)CL-4 分離自肉雞盲腸內(nèi)容物，病原指示菌為金黃色葡萄球菌ATCC25923、大腸埃希菌ATCC25922，均由吉林省農(nóng)業(yè)科學(xué)院動(dòng)物營(yíng)養(yǎng)與飼料研究所保存，豆粕購(gòu)自吉林省公主嶺禾豐牧業(yè)有限責(zé)任公司。

1.1.2 主要試劑和儀器 DNS 試劑、LB 培養(yǎng)基、大豆球蛋白和β-伴球蛋白ELISA 試劑盒購(gòu)自北京龍科方舟生物工程技術(shù)有限公司，植物蛋白提取試劑盒購(gòu)自南京凱基生物有限公司。 控?fù)u床，恒溫培養(yǎng)箱，高壓滅菌鍋，超凈工作臺(tái)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 豆粕抗原蛋白平板制備及菌株降解能力測(cè)定 抗原蛋白培養(yǎng)基的制備:稱取5 g 豆粕，磨碎后過(guò)60 目篩，加入pH 8.5 的Tris-HCl 緩沖液75 mL，30 ～50 ℃、 200 r/min 振蕩1 h，9 000 r/min離心40 min，沉淀再浸提一次，合并兩次上清液。 向上清液中加入NaHSO3至0.01 mol/L，用2 mol/L HCl 調(diào)pH 至6.4，4 ℃沉淀過(guò)夜。 于6 500 r/min、4 ℃離心30 min，得到大豆球蛋白沉淀。 上清液加NaCl 至0.25 mol/L，調(diào)pH 至4.0 ～6.0，室溫?cái)嚢?0 min，9 000 r/min、4 ℃離心30 min，上清液稀釋2 倍，調(diào)pH 至4.8，6 500 r/min離心20 min 得到β-伴球蛋白沉淀。 將所有沉淀溶于ddH2O，調(diào)pH 至5.5 ～6.5，加入1.5%(w/v)瓊脂，115 ℃滅菌20 min。

抗原蛋白平板制備:在滅菌培養(yǎng)皿中加入15 mL 抗原蛋白培養(yǎng)基，待冷卻后再加入營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(蛋白胨10 g/L、牛肉膏3 g/L、氯化鈉5 g/L、瓊脂20 g/L，121℃高壓滅菌15 min)15 mL，冷卻至凝固，待培養(yǎng)基表面無(wú)明顯水跡后，將已滅菌的牛津杯置于試驗(yàn)平板中，輕輕加壓，使其與培養(yǎng)皿接觸無(wú)空隙，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

菌株降解豆粕抗原蛋白能力測(cè)定:根據(jù)Wongputtisin 等[17]的方法制備候選菌株B. velezensis CL-4 粗上清液，過(guò)0.22 μm 微孔濾膜。 取100 μL 粗上清液加入抗原蛋白篩選平板的牛津杯中培養(yǎng)24 h，以添加100 μL 生理鹽水為對(duì)照。 若菌株對(duì)抗原蛋白有降解作用，即可見(jiàn)到水解圈。 根據(jù)水解圈直徑與牛津杯孔徑比值測(cè)定B. velezensisCL-4 的豆粕抗原蛋白降解能力。

1.2.2 發(fā)酵豆粕的制備 將B. velezensisCL-4 在37 ℃液體LB 培養(yǎng)基中培養(yǎng)12 h 以備固態(tài)發(fā)酵。將豆粕121 ℃高壓滅菌處理20 min，稱取滅菌后的豆粕100 g 于500 mL 燒瓶中，發(fā)酵菌種添加量為107CFU/g，最終含水量為40%，攪拌均勻后用濾菌呼吸膜封住瓶口于37 ℃下發(fā)酵24 h，然后105 ℃、30 min 阻斷發(fā)酵。 以0.85%無(wú)菌生理鹽水為對(duì)照，重復(fù)3 次。 將發(fā)酵樣品65 ℃烘干24 h，冷卻研磨過(guò)60 目篩，用于SDS-PAGE 和營(yíng)養(yǎng)成分分析。

1.2.3 pH 值和發(fā)酵代謝產(chǎn)物相關(guān)指標(biāo)測(cè)定 準(zhǔn)確稱取0、24 h 的發(fā)酵樣品各1.00 g 溶于9.0 mL蒸餾水中，室溫150 r/min 振蕩10 min，靜置1 min后測(cè)定pH 值；采用倍比稀釋法測(cè)定發(fā)酵樣品中活菌數(shù)；通過(guò)DNS 法測(cè)定纖維素酶、木聚糖酶和果膠酶活力，中性蛋白酶活力測(cè)定參考行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)SB/T 10317—1999；使用瓊脂擴(kuò)散法測(cè)定發(fā)酵后豆粕的抑菌性，以金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 作為抑菌試驗(yàn)的指示劑。

1.2.4 營(yíng)養(yǎng)成分分析 根據(jù)AOAC(2005)測(cè)定發(fā)酵前后豆粕中干物質(zhì)、粗纖維、粗蛋白、纖維素、半纖維素、總磷、鈣和灰分等含量。 根據(jù)Ovissipour等[18]的方法測(cè)定發(fā)酵前后豆粕中酸溶蛋白含量。采用氨基酸自動(dòng)分析儀測(cè)定發(fā)酵前后豆粕中氨基酸含量。

1.2.5 豆粕抗原蛋白定量檢測(cè) 利用間接競(jìng)爭(zhēng)性ELISA 法測(cè)定發(fā)酵前后豆粕中大豆球蛋白和β-伴球蛋白含量，采用北京龍科方舟試劑盒進(jìn)行。

1.2.6 SDS-PAGE 分析 根據(jù)植物蛋白提取試劑盒說(shuō)明書提取發(fā)酵0、12、24 h 豆粕可溶性蛋白，使用Bio-Rad 蛋白定量試劑盒將上清液定量至50 μg/mL，分別配制12%分離膠和5%濃縮膠，采用穩(wěn)流35 mA 電泳至蛋白進(jìn)入分離膠，然后設(shè)定穩(wěn)流45 mA 電泳至溴酚藍(lán)離膠底1 cm，最后采用考馬斯亮藍(lán)染色和脫色液脫色，直至凝膠背景脫凈。

1.2.7 掃描電鏡觀察 取發(fā)酵前后豆粕樣品0.1 g 包裹于濾紙內(nèi)，用2.5%戊二醛4 ℃浸泡過(guò)夜。掃描電鏡觀察倍數(shù)分別為1 000、1 500、3 000。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析

使用SPSS 軟件(24.0)通過(guò)Student’st-test和單因素方差分析(ANOVA)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，各組間數(shù)據(jù)顯著差異水平設(shè)定為P＜0.05，數(shù)值表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 B. velezensis CL-4 降解豆粕抗原蛋白能力測(cè)定

如圖1 所示，B. velezensisCL-4 胞外上清液在大豆抗原蛋白篩選板上顯示出較大直徑水解圈，而生理鹽水對(duì)照沒(méi)有出現(xiàn)水解圈，初步推斷B.velezensisCL-4 胞外上清液具有降解大豆抗原蛋白的能力。

圖1 B. velezensis CL-4 降解豆粕抗原蛋白能力

2.2 豆粕發(fā)酵前后營(yíng)養(yǎng)成分比較分析

如表1 所示，與發(fā)酵前相比，B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵24 h 后，豆粕干物質(zhì)含量由93.25%±0.36%下降至92.69%±0.32%，粗蛋白含量由46.78%±0.32%增加到51.28%±0.24%，酸溶蛋白含量由5.15% ±0.04%顯著提升至10.74% ±0.12%，鈣、灰分和總磷含量均有所提高。 粗纖維含量顯著降低，其中半纖維素含量從19.92%±0.11%下降到13.23%±0.09%，纖維素含量由7.41%±0.05%降低到5.85%±0.08%。 各種氨基酸含量均呈上升趨勢(shì)，除精氨酸、蛋氨酸、丙氨酸、酪氨酸和脯氨酸外，其他必需和非必需氨基酸顯著提升(P＜0.05)。 與原始豆粕相比，固態(tài)發(fā)酵飼料的總氨基酸含量由41.72%±0.40%顯著提高至48.14%±0.14%。 因此，B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵可顯著提高豆粕營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)，降低粗纖維含量。

表1 B. velezensis CL-4 發(fā)酵前后豆粕營(yíng)養(yǎng)成分分析%

2.3 發(fā)酵豆粕抗菌活性

圖2顯示，與未發(fā)酵豆粕的上清液相比，固態(tài)發(fā)酵24 h 后的豆粕上清液在MH 固體培養(yǎng)基上對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 具有明顯的抑菌圈。 因此，B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵豆粕具有一定的抗菌活性。

2.4 發(fā)酵豆粕pH 值、活菌數(shù)及酶活力變化

由表2 可知，與發(fā)酵前相比，B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵豆粕的活菌數(shù)從(8.13±0.04) log CFU/g顯著增加到(10.28±0.29) log CFU/g；pH值從6.64±0.02 小幅增加到7.01±0.05；纖維素酶活力由(7.57±0.41) U/g 提升至(18.73±1.67)U/g，木聚糖酶活力由(7.21±0.48) U/g 提升至(23.92±1.48) U/g，果膠酶活力由(5.52±0.38)U/g 上升至(14.05± 2.71) U/g，β-甘露聚糖酶活力由(6.52±0.12) U/g 提升至(17.64±0.84) U/g，中性蛋白酶活力由(7.90±0.74) U/g 提升至(235.93±10.19) U/g，各種酶活力均顯著提高。

表2 B. velezensis CL-4 發(fā)酵豆粕pH 值、活菌數(shù)及酶活力變化

2.5 發(fā)酵豆粕抗原蛋白降解效果

SDS-PAGE 分析結(jié)果(圖3)顯示，在24 h 發(fā)酵過(guò)程中，豆粕分子量大于35 kDa 的蛋白亞基逐步降解，而15～24 kDa 的蛋白含量逐漸提高。 大豆抗原蛋白亞基中的β-伴球蛋白亞基(α 和α′)分子量在70～100 kDa 左右，發(fā)酵12 h 基本降解，而β-伴球蛋白β′亞基分子量為60 kDa 左右，于24 h 被降解。 因此，B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵可將豆粕中大分子抗原蛋白降解成小分子肽類。

圖3 B. velezensis CL-4 發(fā)酵豆粕可溶性蛋白分子量變化

ELISA 定量檢測(cè)結(jié)果(表3)顯示，與發(fā)酵前相比，B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵24 h 后，豆粕中大豆球蛋白含量由(176.14±3.15) mg/g 降低至(26.58±1.22) mg/g，降解率可達(dá)84.91%；β-伴球蛋白含量由(134.66±2.24) mg/g 下降至(25.65±0.75) mg/g，降解率可達(dá)80. 95%。 表明B.velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵可顯著降低豆粕中大豆球蛋白和β-伴球蛋白含量。

表3 B. velezensis CL-4 發(fā)酵豆粕抗原蛋白的降解效果

2.6 發(fā)酵過(guò)程中豆粕表觀形態(tài)變化

掃描電鏡觀察結(jié)果(圖4)顯示，發(fā)酵前豆粕結(jié)構(gòu)緊湊、表面光滑。B. velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵24 h 后，豆粕的塊狀結(jié)構(gòu)被大量分解，呈現(xiàn)出碎片、破裂和多纖維素結(jié)構(gòu)，表明B. velezensisCL-4固態(tài)發(fā)酵可明顯改變豆粕表觀形態(tài)，有效降解木質(zhì)纖維素。

3 討論與結(jié)論

豆粕來(lái)源廣泛且營(yíng)養(yǎng)豐富，是動(dòng)物飼料中主要的植物源性蛋白資源。 然而，豆粕中含有多種抗?fàn)I養(yǎng)因子，限制了其在幼齡動(dòng)物日糧中的廣泛應(yīng)用[17]。 研究表明微生物發(fā)酵可以部分降解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子，從而改善其營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)[19-20]。

本研究中，抗原蛋白平板法測(cè)定驗(yàn)證了新型菌種B. velezensisCL-4 可降解豆粕抗原蛋白，B.velezensisCL-4 固態(tài)發(fā)酵24 h 后，豆粕中大豆球蛋白和β-伴球蛋白的降解率可分別達(dá)84.91%和80.95%。 由于原料在發(fā)酵前已經(jīng)滅菌且發(fā)酵過(guò)程也是無(wú)菌的，不涉及外源或天然微生物影響，因而B. velezensisCL-4 在豆粕發(fā)酵過(guò)程中發(fā)揮主要作用。 SDS-PAGE 測(cè)定的豆粕可溶性蛋白分子量變化與酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定的大豆球蛋白和β-伴球蛋白在發(fā)酵過(guò)程中的降解趨勢(shì)一致。 此前研究也在B. velezensisCL-4 全基因組序列中檢測(cè)到絲氨酸蛋白酶、氨基肽酶、金屬蛋白酶等多種蛋白水解酶的基因[13]。 在酶活力檢測(cè)中也發(fā)現(xiàn)，B.velezensisCL-4 中性蛋白酶活性顯著提高，有效分解豆粕中抗原蛋白。 Wang 等[4]采用兩段發(fā)酵法通過(guò)枯草芽孢桿菌CW4 和糞腸球菌CWEF 發(fā)酵豆粕和玉米混合底物，營(yíng)養(yǎng)價(jià)值顯著提高。 Yao等[21]發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌N-11 厭氧發(fā)酵豆粕可增加酸溶蛋白(ASP)含量，最高達(dá)到13.48%，大豆球蛋白和β-伴球蛋白分別降低82.38%和88.32%。Shi 等[2]發(fā)現(xiàn)在玉米-豆粕混合飼料中接種枯草芽孢桿菌B. subtilis 和屎腸桿菌E. faecium，大豆球蛋白和β-伴球蛋白的降解率分別為86.12%和77.53%。 以上研究與本試驗(yàn)結(jié)果一致，在后續(xù)研究中還需要通過(guò)2DE 電泳和蛋白質(zhì)組學(xué)對(duì)發(fā)酵產(chǎn)物中的蛋白質(zhì)作進(jìn)一步研究。

本研究中，B. velezensis CL-4 固態(tài)發(fā)酵豆粕與原始豆粕相比含有更高含量的粗蛋白和氨基酸含量，與前人的報(bào)道一致[3，22]。 發(fā)酵過(guò)程中干物質(zhì)的損失也可能導(dǎo)致粗蛋白和氨基酸的增加[23]。B. velezensis CL-4 可顯著提高豆粕中酸溶蛋白含量主要是由于在發(fā)酵過(guò)程中，豆粕抗原蛋白或其他蛋白水解形成小分子肽和游離氨基酸[24]。 本研究中，B. velezensis CL-4 發(fā)酵豆粕對(duì)金黃色葡萄球菌ATCC25923 和大腸埃希菌ATCC25922 具有一定抑制能力，可部分替代飼料中的抗生素。

本研究中，與原始豆粕相比，發(fā)酵豆粕中纖維素和半纖維素降解率分別為21.05%和33.58%。在豆粕發(fā)酵過(guò)程中幾種非淀粉多糖降解酶(纖維素酶、木聚糖酶、β-甘露聚糖酶和果膠酶)的活力均顯著上升。 掃描電鏡觀察發(fā)現(xiàn)與原始豆粕相比，發(fā)酵豆粕表面結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)開(kāi)裂和多孔結(jié)構(gòu)，說(shuō)明其中木質(zhì)纖維素組分可能被部分降解，而這與非淀粉多糖降解酶密切相關(guān)。 此外，隨著纖維素和半纖維素的降解，豆粕中蛋白組分更容易被B.velezensis CL-4 分泌的蛋白酶所分解，因此發(fā)酵豆粕可能會(huì)具有更高的養(yǎng)分消化率。

目前生物發(fā)酵飼料常用的發(fā)酵菌種為芽孢桿菌、乳酸菌以及酵母菌。 中國(guó)生物飼料產(chǎn)業(yè)創(chuàng)新戰(zhàn)略聯(lián)盟最新發(fā)布并實(shí)施的《發(fā)酵飼料技術(shù)通則》中明確指出發(fā)酵飼料菌種只允許添加飼料添加劑品種目錄(2013 年)規(guī)定的相應(yīng)菌種，可用菌種約為35 種，而歐盟食品安全局(EFSA)可利用的菌種數(shù)量可達(dá)80 余種[25]。 因而，新型發(fā)酵菌種的研發(fā)和應(yīng)用急需開(kāi)展。 貝萊斯芽孢桿菌菌株通常從土壤、植物根際、河流、動(dòng)物腸道和發(fā)酵食品等來(lái)源分離獲得[26]，其相關(guān)研究集中于生物防治和促進(jìn)植物生長(zhǎng)等方面[27-28]。 貝萊斯芽孢桿菌已于2020 年被列入歐盟安全資格認(rèn)定(QPS)推薦的生物制劑列表中，可作為新型發(fā)酵飼料菌種[29]。 全基因組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)B. velezensis CL-4有大量編碼木質(zhì)纖維素降解酶的基因，其發(fā)酵產(chǎn)生的碳水化合物酯酶、果膠酸裂解酶和碳水化合物結(jié)合模塊(CBMs)也可能影響纖維素和半纖維素降解[13]。 此外，在GH1-13[30]、FZB42[8]、ZY-1-1[31]、LS69[32]和UCMB5113[33]等B. velezensis 基因組中均發(fā)現(xiàn)參與降解纖維素和半纖維素的酶基因。 但有關(guān)將B. velezensis 應(yīng)用于動(dòng)物飼料益生菌和生物發(fā)酵飼料中的報(bào)道仍然較少。

本研究通過(guò)高產(chǎn)蛋白酶和木質(zhì)纖維素降解酶的B. velezensis CL-4 發(fā)酵豆粕，可降解豆粕中抗?fàn)I養(yǎng)因子(大豆抗原蛋白、纖維素和半纖維素)，顯著改變了原始豆粕的營(yíng)養(yǎng)特性，提高了營(yíng)養(yǎng)品質(zhì)和功能代謝物(活菌數(shù)、酶活力以及抑菌活性)，可作為新型發(fā)酵豆粕菌種，具有廣闊的應(yīng)用前景。