朱飛，李文波，田磊，沈洪偉，季敬敬，魏元甲，王蕓，王欣麗

(1. 臨沂市農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，山東臨沂 276000；2. 臨沂市農(nóng)業(yè)科學(xué)院，山東臨沂 276000；3. 山東省水土保持與環(huán)境保育重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/臨沂大學(xué)資源環(huán)境學(xué)院，山東臨沂 276005)

硝化作用是土壤氮轉(zhuǎn)化的一個(gè)重要步驟，它不僅關(guān)系到礦化釋放的銨態(tài)氮或外源銨態(tài)氮在土壤氮循環(huán)中的轉(zhuǎn)化，還與土壤氮的損失有關(guān)；所涉及的過(guò)程關(guān)聯(lián)著土壤酸化、水體富營(yíng)養(yǎng)化以及溫室氣體N2O 排放等環(huán)境問(wèn)題[1]。 因此，硝化作用一直是氮轉(zhuǎn)化過(guò)程中一個(gè)備受關(guān)注的環(huán)節(jié)。 氨氧化是硝化作用的第一步也是限速步驟，氨氧化細(xì)菌(AOB)和氨氧化古菌(AOA)被認(rèn)為是氨氧化作用的主要執(zhí)行者[2]。 由于AOA、AOB 等功能群體對(duì)環(huán)境因子(如氧氣和底物等)具有不同的響應(yīng)特征，因此不同的土壤類型和土地利用類型下不同功能群的生態(tài)位會(huì)發(fā)生變化。

AOA 和AOB 在生理和代謝途徑上存在很大差異[3-4]，包括其對(duì)土壤pH 值[5]、土壤有機(jī)質(zhì)含量[6]和氨濃度[7]等的適應(yīng)，導(dǎo)致土壤中氨氧化微生物不同的群落結(jié)構(gòu)和功能。 研究表明土壤pH值影響硝化作用底物的化學(xué)形態(tài)和生物可利用性，在AOA 和AOB 的生態(tài)位分異中起著重要作用[8]。 與AOB 相比，AOA 對(duì)底物NH3有更高的親和力[9]，高氮土壤更利于AOB 的增長(zhǎng)[10]。 有機(jī)質(zhì)含量也是影響AOA 和AOB 相對(duì)競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)的重要因素[6-7，10]。 土壤有機(jī)質(zhì)一方面會(huì)刺激具有混合營(yíng)養(yǎng)能力的AOA，另一方面其礦化釋放的氨會(huì)促進(jìn)AOA 豐度的增加[6]。

不同的土地利用和管理模式對(duì)土壤的屬性和環(huán)境可產(chǎn)生劇烈影響，導(dǎo)致土壤理化性質(zhì)和微生物活性發(fā)生改變[11-14]。 天然土地轉(zhuǎn)化成農(nóng)業(yè)用地后利用強(qiáng)度提高，尤以設(shè)施蔬菜地土壤的利用程度最高，具有無(wú)機(jī)和有機(jī)肥料投入量高、種植強(qiáng)度大等特點(diǎn)[15]。 不同利用方式土壤在pH 值、氮素狀況等方面的差異必然影響AOB、AOA 的豐度和群落組成。 前人研究多數(shù)針對(duì)酸性土壤，關(guān)于原堿性土壤不同干擾程度下的土地利用氨氧化微生物是如何響應(yīng)的研究很少。 本研究選取褐土林地、農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地3 種中國(guó)北方常見(jiàn)土地利用類型的土壤，代表不同的干擾程度(林地＜農(nóng)田＜設(shè)施蔬菜地)，采用熒光定量PCR 和Illumina MiSeq 高通量測(cè)序技術(shù)，研究不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的豐度、多樣性和群落結(jié)構(gòu)的變化，探討土壤理化性質(zhì)變化對(duì)氨氧化微生物群落組成的影響以及氨氧化微生物對(duì)環(huán)境的長(zhǎng)期適應(yīng)性，以期為土壤肥力提升和土地的合理利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究區(qū)與土壤樣品采集

土壤樣品采集自山東省沂南縣(35°36′28″N，118°22′4″E)，屬暖溫帶大陸性季風(fēng)氣候，全年平均氣溫13.7 ℃，年均降水量856 mm。 最冷月份為1 月，平均氣溫為-0.8 ℃；最熱月份為7 月，平均氣溫為26.4 ℃。 土壤類型屬于褐土，起源于石灰?guī)r。 選取3 種鄰近(相距1 km 內(nèi))但不同的土地利用類型土壤作為研究對(duì)象，分別是林地、農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地。 林地是人工林(大約20 年)，主要樹(shù)種是毛白楊(Populus tomentosaCarr.)；農(nóng)田種植時(shí)間大于30 年，主要是小麥(Triticum aesti-vumL.)和玉米(Zea maysL.)輪作，每年施氮量350～450 kg/hm2；設(shè)施蔬菜地主要種植黃瓜(Cucumis sativusL.)，種植時(shí)間為10 年以上，每年施氮量800～900 kg/hm2。

土壤樣本于2017 年5 月采集。 每個(gè)采樣點(diǎn)設(shè)3 次重復(fù)，每個(gè)重復(fù)樣本由5 份隨機(jī)采集的0～20 cm 土壤混合而成。 采集的新鮮土樣置于冰上運(yùn)回實(shí)驗(yàn)室，去除植物根系和石塊后過(guò)2 mm 篩，一部分儲(chǔ)存在-80 ℃冰箱，用于amoA基因群落豐度和結(jié)構(gòu)分析，另一部分用于理化性質(zhì)分析。

1.2 土壤理化性質(zhì)測(cè)定

理化性質(zhì)測(cè)定參考魯如坤[16]的方法。 土壤pH 值采用電極法測(cè)定，水土比為2.5∶1(v/m)。土壤有機(jī)碳(SOC)含量測(cè)定采用硫酸-重鉻酸鉀氧化法。 土壤全氮(TN)含量測(cè)定用半微量凱氏定氮法。 銨態(tài)氮和硝態(tài)氮含量測(cè)定時(shí)首先用2 mol/L KCl 溶液浸提，然后用SkalarplusSan 流動(dòng)分析儀測(cè)定。

1.3 DNA 提取及熒光定量PCR

土壤總DNA 的提取采用FastDNA?SPIN Kit for soil (MP Biomedicals，USA)試劑盒進(jìn)行，具體操作方法參照說(shuō)明書(shū)。 將提取的土壤總DNA 溶解于100 μL TE buffer 中。 用Nanodrop (ND-1000 UV-Vis Spectrophotometer Therom，USA) 檢測(cè)DNA 的純度和濃度，用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)其片段大小，置于-20 ℃冰箱保存。

以AOA 和AOBamoA基因的重組質(zhì)粒作為標(biāo)準(zhǔn)DNA 模板，經(jīng)10 倍連續(xù)稀釋，制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。用SYBRPremix Ex TaqTMKit(TaKaRa)試劑盒，分別以Arch-amoAF/Arch-amoAR[17]和amoA-1F/amoA-2R[18]為引物，在CFX96 Real-Time PCR System(Bio-Rad，USA)實(shí)時(shí)熒光定量PCR 儀上進(jìn)行擴(kuò)增，定量分析AOA 和AOB 的amoA基因拷貝數(shù)。 qPCR 反應(yīng)體系(20 μL):2×SYBR Premix Ex PCR buffer 10 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.5 μL，DNA 模板1 μL。 qPCR 擴(kuò)增程序:95 ℃預(yù)變性3 min；95 ℃變性10 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s；40 個(gè)循環(huán)。

1.4 Illumina MiSeq 測(cè)序

采用PCR 擴(kuò)增AOA 和AOBamoA基因，擴(kuò)增引物和反應(yīng)體系同1.3，擴(kuò)增條件為:94 ℃5 min；95 ℃30 s，55 ℃45 s，72 ℃45 s，35 個(gè)循環(huán)；72 ℃7 min。 以2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR 產(chǎn)物。 樣品送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司，運(yùn)用Illumina MiSeq 測(cè)序平臺(tái)進(jìn)行測(cè)序。 序列用FLASH 合并，利用微生物生態(tài)學(xué)(Qiime)軟件對(duì)所得序列進(jìn)行過(guò)濾、拼接和去除嵌合體。 OTU 按照97%進(jìn)行聚類分析。 利用RDP 分類器對(duì)每條序列進(jìn)行物種分類注釋，比對(duì)fgr/amoA 數(shù)據(jù)庫(kù)，置信閾值為70%。 利用Mothur 1.30.1 軟件在97%相似水平上對(duì)氨氧化微生物群落α 多樣性指數(shù)進(jìn)行分析。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

采用SPSS 19.0 軟件對(duì)土壤理化性質(zhì)、氨氧化微生物豐度和群落α 多樣性指數(shù)進(jìn)行差異顯著性分析(P＜0.05)和Pearson 相關(guān)性分析。 采用CANOCO 4.5.1 軟件(Microcomputer Power，Ithaca，USA) 開(kāi)展CCA 分析，明確AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)和土壤理化因子間的關(guān)系。 利用Origin(OriginPro 9.0 for Windows)軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同土地利用類型土壤理化性質(zhì)

由表1 可知，林地土壤呈堿性，其pH 值在褐土的常見(jiàn)值范圍內(nèi)；農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地土壤呈酸性，其中設(shè)施蔬菜地的pH 值最低(5.32)。 林地土壤的有機(jī)碳和全氮含量最高，農(nóng)田土壤最低。設(shè)施蔬菜地中銨態(tài)氮、硝態(tài)氮含量顯著高于林地和農(nóng)田，農(nóng)田中的硝態(tài)氮含量顯著高于林地土壤。

表1 不同土地利用類型土壤理化性質(zhì)

2.2 不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的豐度

由圖1 可以看出，林地土壤AOAamoA基因豐度顯著高于農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地，農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地土壤間無(wú)顯著差異。 AOBamoA基因豐度為4.99×106～2.81×107copies/g；農(nóng)田土壤豐度顯著高于設(shè)施蔬菜地和林地(P＜0.05)，林地土壤基因豐度最低。

圖1 不同土地利用類型土壤AOA 和AOB amoA 基因豐度

2.3 不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的α多樣性指數(shù)

如表2 所示，所有樣品AOA 和AOBamoA基因的測(cè)序覆蓋度在0.9991 ～0.9996。 不同土地利用類型對(duì)AOA 和AOB Shannon 指數(shù)均有影響，農(nóng)田土壤AOA 和AOB Shannon 指數(shù)均最高，設(shè)施蔬菜地AOA Shannon 指數(shù)最低，林地和設(shè)施蔬菜地AOB Shannon 指數(shù)較低，且兩者無(wú)顯著差異。 不同土地利用類型對(duì)AOA Simpson 指數(shù)無(wú)顯著影響；林地和設(shè)施蔬菜地中AOB 的Simpson 指數(shù)顯著高于農(nóng)田土壤。 設(shè)施蔬菜地土壤AOA 的ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)顯著低于林地和農(nóng)田，而AOB 的ACE指數(shù)和Chao1 指數(shù)在3 種土壤中無(wú)顯著差異。

表2 不同土地利用類型土壤氨氧化微生物群落α 多樣性指數(shù)

2.4 AOA 和AOB amoA 基因豐度和群落α 多樣性指數(shù)與土壤理化性狀的相關(guān)性分析

相關(guān)性分析結(jié)果(表3)表明，AOAamoA基因豐度與土壤有機(jī)碳含量、pH 值呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)，與硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；AOBamoA基因豐度與有機(jī)碳和全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)。

表3 土壤理化性狀與amoA 基因豐度和α 多樣性指數(shù)的相關(guān)性

AOA 群落的Shannon 指數(shù)與土壤全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)；Simpson 指數(shù)與有機(jī)碳和全氮含量呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)；ACE 指數(shù)和Chao1 指數(shù)與硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05，P＜0.01)，Chao1 指數(shù)與pH 值呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)。 AOB 群落的Shannon 指數(shù)與有機(jī)碳和全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.01)；Simpson 指數(shù)與有機(jī)碳和全氮含量均呈顯著正相關(guān)(P＜0.01)；ACE 指數(shù)與pH 值呈顯著正相關(guān)(P＜0.05)，和硝態(tài)氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)(P＜0.05)。

2.5 不同土地利用類型對(duì)AOA 和AOB 群落的影響

在門水平上，AOA 群落由奇古菌門(Thaumarchaeota)、泉古菌門(Crenarchaeota)、 Unclassified_k_norank_d_Archaea 和Environmental_samples_k_norank_d_Archaea 組成(圖2a)。 泉古菌門在林地和農(nóng)田中為主要優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度分別為79.94%和58.95%，在設(shè)施蔬菜地中僅占13.03%；奇古菌門在設(shè)施蔬菜地中為主要優(yōu)勢(shì)類群，相對(duì)豐度為66.80%，在林地和農(nóng)田中分別為3.05%和31.19%。 在屬水平上，共檢測(cè)到5 個(gè)類群(圖2b)，分別為Environmental_samples_p_Crenarchaeota、亞硝化球菌屬(Nitrososphaera)、Environmental_samples_p_Thaumarchaeota、Unclassified_k_norank_d_Archaea、Environmental_samples_k_norank。Nitrososphaera只分布在農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地中，相對(duì)豐度分別為19.54%和66.60%。

圖2 不同土地利用類型土壤AOA 門(a)和屬(b)水平的群落組成

3 種土地利用類型的AOB 在門水平上包括變形菌門(Proteobacteria)、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Environmental_samples_k_norank 和Ammonia_oxidsing_bacteria_ensemble(圖3a)。 變形菌門在林地和農(nóng)田中為主要優(yōu)勢(shì)類群，分別占83.52%和95.11%；在設(shè)施蔬菜地中占23.10%。設(shè)施蔬菜地中Unclassified_k_norank_d_Bacteria和Environmental_samples_k_norank 為優(yōu)勢(shì)類群，分別占44.20%和32.68%。 在屬水平上檢測(cè)到5個(gè)類群，分別是亞硝化螺菌屬(Nitrosospira)、Norank_p_environmental_samples、Unclassified_k_norank_d_Bacteria、Unclassified_o_Nitrosomonadales和其他(圖3b)。 已知屬為Nitrosospira，在農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地中分別占83.47%和12.35%。

圖3 不同土地利用類型土壤AOB 門(a)和屬(b)水平的群落組成

2.6 AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的關(guān)系

對(duì)AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)與環(huán)境變量進(jìn)行典型對(duì)應(yīng)分析(CCA)，結(jié)果(圖4)表明，AOA 的第一、二坐標(biāo)軸(CCA1 和CCA2)分別解釋了52.5%和22.2%的變異，全氮(TN)含量和土壤pH 值顯著影響AOA 的群落結(jié)構(gòu)。 AOB 的第一、二坐標(biāo)軸分別解釋了55.1%和21.1%的變異，土壤pH 值和SOC 含量顯著影響AOB 的群落結(jié)構(gòu)。不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 群落均明顯分開(kāi)。

圖4 AOA(a)和AOB(b)群落結(jié)構(gòu)與土壤理化性質(zhì)的CCA 分析

3 討論與結(jié)論

不同土地利用類型顯著影響AOA 和AOB 的群落豐度。 林地土壤AOA 豐度顯著高于農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地，原因可能與森林土壤較高的有機(jī)質(zhì)含量和低氨濃度有關(guān)。 研究表明根系分泌物[19]和凋落物[20]促進(jìn)了AOA 的顯著生長(zhǎng)，證明了有機(jī)質(zhì)對(duì)AOA 生長(zhǎng)的重要性。 豐富的有機(jī)質(zhì)一方面會(huì)促進(jìn)AOA 的增長(zhǎng)；另一方面，在自然條件下，通過(guò)有機(jī)物礦化，以持續(xù)的低速率產(chǎn)生的氨可利用性很低，有利于對(duì)氨親和力較高的AOA 的生長(zhǎng)[6，21]。 與之形成對(duì)比，農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地土壤中AOB 豐度顯著高于林地。 AOB 對(duì)氨的親和力較低，森林有機(jī)質(zhì)礦化過(guò)程緩慢釋放的并不足以支持其大量生長(zhǎng)，因此其只在大量施肥的農(nóng)田和設(shè)施蔬菜農(nóng)地中具有較高豐度[7，22]。Zhong 等[23]也發(fā)現(xiàn)密集施肥的設(shè)施蔬菜地土壤中AOB 占優(yōu)勢(shì)。 大量研究表明，土壤pH 值是影響硝化微生物豐度和組成的關(guān)鍵因子之一[5，8]，農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地由于長(zhǎng)期施肥導(dǎo)致土壤pH 值下降。 Chen 等[24]研究認(rèn)為，土壤pH 值與AOB 數(shù)量呈顯著負(fù)相關(guān)，與AOA 數(shù)量沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系。 然而，楊亞?wèn)|等[25]研究認(rèn)為，土壤pH 值與AOA 數(shù)量顯著正相關(guān)，與AOB 數(shù)量沒(méi)有顯著相關(guān)關(guān)系，這與本研究結(jié)果相同。 因此，在復(fù)雜的土壤環(huán)境中，pH 值不總是影響AOA 和AOB 分異的決定性因子。

不同土地利用類型土壤AOA 和AOB 的α多樣性不同，農(nóng)田土壤AOA 和AOB 的Shannon 指數(shù)顯著高于設(shè)施蔬菜地土壤，且與土壤全氮含量呈顯著負(fù)相關(guān)，說(shuō)明設(shè)施蔬菜地土壤由于施氮量增加而降低了土壤AOA 和AOB 的多樣性。 該結(jié)果與Wang[26]、周晶[27]等的研究結(jié)論一致。 適量施用氮肥能提高AOA 和AOB 的多樣性，但長(zhǎng)期大量施用氮肥則不利于保持多樣性。

在門分類水平上，林地和農(nóng)田土壤AOA 主要優(yōu)勢(shì)類群是泉古菌門，設(shè)施蔬菜地土壤AOA 優(yōu)勢(shì)類群為奇古菌門。 趙輝等[28]研究發(fā)現(xiàn)，設(shè)施蔬菜地隨著種植年限的增加，奇古菌門的相對(duì)豐度增大，說(shuō)明長(zhǎng)期大量施肥有利于奇古菌門AOA 的生長(zhǎng)。 相比林地土壤，農(nóng)田和設(shè)施蔬菜地土壤里的已知屬Nitrososphaera在AOA 功能群中的占比更高，并在設(shè)施蔬菜地的AOA 類群中占據(jù)顯著優(yōu)勢(shì)。 這一結(jié)果與早期研究結(jié)論[29]并不一致。 而近期研究發(fā)現(xiàn)，酸性土壤中主導(dǎo)硝化的AOA 類群屬于Nitrososphaera viennensisEN76 相關(guān)類群，并且其活性源于對(duì)酸性環(huán)境的耐受性，而非對(duì)氨的高度親和力(如在偏堿性森林土中)[30-31]。

AOB 中的變形菌門在林地和農(nóng)田中為主要優(yōu)勢(shì)類群，而在設(shè)施蔬菜地中僅占23.10%，這可能與變形菌門適合的營(yíng)養(yǎng)閾值有關(guān)[32]。 設(shè)施蔬菜地與農(nóng)田相比，由于養(yǎng)分大量富集，超過(guò)了變形菌門的生態(tài)閾值，對(duì)其生長(zhǎng)起到了抑制作用。 已知屬Nitrosospira是農(nóng)業(yè)施肥土壤中最常見(jiàn)的一類硝化細(xì)菌[33]，Chu 等[34]的研究結(jié)果也表明施氮肥會(huì)導(dǎo)致NitrosospiraCluster 3 的競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì)，但是Nitrosospira更喜歡低氨的環(huán)境[35]，因此在施氮量高的設(shè)施蔬菜地中所占比例(12.35%)遠(yuǎn)低于農(nóng)田(83.47%)。

CCA 分析表明土壤pH 值、全氮和銨態(tài)氮含量顯著影響AOA 的群落結(jié)構(gòu)，解釋了不同土地利用類型中74.7%的AOA 群落組成差異。 土壤pH值、有機(jī)質(zhì)含量顯著影響了AOB 的群落結(jié)構(gòu)，解釋了不同土地利用類型中76.2%的AOB 群落組成差異。 說(shuō)明林地轉(zhuǎn)變?yōu)檗r(nóng)業(yè)用地后，在作物種植和施肥管理過(guò)程中，土壤酸化、氮肥積累和有機(jī)肥使用等因素直接影響了土壤的理化性質(zhì)，從而決定了AOA 和AOB 群落結(jié)構(gòu)的變化[36-37]。