姚來娣吳香菊齊靜叢曉燕李均同賈杏林杜以軍

(1. 湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物醫(yī)學(xué)院，湖南長沙 410128；2. 山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實驗室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部畜禽生物組學(xué)重點(diǎn)實驗室，山東濟(jì)南 250100)

TRIM56 是三基序蛋白(tripartite motif protein，TRIM)家族中的一員。 根據(jù)TRIM 家族成員之間C 末端結(jié)構(gòu)域的結(jié)構(gòu)差異分為11 個亞家族(C-Ⅰ—C-Ⅺ)，而TRIM56 是C-V 亞家族成員之一[1]。 近年來TRIM 家族蛋白的重要性日益凸顯，其不僅廣泛表達(dá)于成年哺乳動物的各種組織中，在細(xì)胞內(nèi)信號通路調(diào)控和自噬等方面也發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用，尤其是在調(diào)節(jié)先天性免疫應(yīng)答方面受到高度重視[2-4]。 隨著對TRIM 家族蛋白抗病毒作用的深入研究，發(fā)現(xiàn)TRIM 家族蛋白是一種新型的泛素化家族蛋白[5]，而蛋白翻譯后修飾越來越受到重視。 TRIM56 作為泛素化家族成員之一，對其結(jié)構(gòu)及功能也有了初步的了解。

TRIM56 蛋白于2010 年首次被報道[6]，在機(jī)體的先天免疫、轉(zhuǎn)錄調(diào)控、細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤惡性進(jìn)展等方面都發(fā)揮著極其重要的作用，特別是在抗病毒免疫中的功能尤為重要，而這與TRIM56的結(jié)構(gòu)密切相關(guān)。 不同種屬的TRIM56 氨基酸組成及結(jié)構(gòu)存在差異，例如豬、人類、小鼠的TRIM56蛋白分別由755、755、734 個氨基酸組成，但它們都具有TRIM 家族共有的3 個N 端保守結(jié)構(gòu)域，即鋅指結(jié)構(gòu)域(RING finger domain)、B-box 結(jié)構(gòu)域和超螺旋結(jié)構(gòu)域(Coil-Coil region)。 其中，鋅指結(jié)構(gòu)域能夠介導(dǎo)不同底物的泛素化，具有E3泛素連接酶特有的標(biāo)志，因此TRIM56 被認(rèn)為可以參與蛋白的泛素化蛋白酶體修飾過程[6-7]；Bbox 結(jié)構(gòu)域是TRIM 蛋白所特有的，但其功能目前尚不明確[8]；超螺旋結(jié)構(gòu)域(C-C 區(qū)域)通常位于C 端，對于同源相互作用是必要的，其功能主要是促進(jìn)大分子復(fù)合物的形成以及參與同源二聚體的相互作用[9]。 而TRIM56 的C 末端功能還需深入研究。

目前對人TRIM56 的研究較多，而對于豬TRIM56(swine tripartite motif 56，sTRIM56)的研究相對較少。 因此，還需對sTRIM56 結(jié)構(gòu)和功能的更多特點(diǎn)進(jìn)行深入研究。 本研究構(gòu)建了sTRIM56 全長及其截短體的真核表達(dá)質(zhì)粒，并檢測其在細(xì)胞內(nèi)的表達(dá)及定位，為進(jìn)一步研究sTRIM56 蛋白全長和其不同結(jié)構(gòu)域的抗病毒作用及分子機(jī)制奠定了基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

人胚胎腎細(xì)胞(HEK-293T)、豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)和空載體pXJ41 由山東省畜禽疫病防治與繁育重點(diǎn)實驗室保存。

1.2 主要試劑

RNA-easy Isolation Reagent 購自南京諾唯贊生物科技股份有限公司；DL5000DNA Marker、PrimeSTAR?HS DNA Polymerase、 PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser 反轉(zhuǎn)錄試劑盒等購自TaKaRa 寶生物工程(大連)有限公司；限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、BamHⅠ及T4 DNA Ligase 購自Thermo Fisher Scientific 公司；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA 回收試劑盒購自北京天根生物工程有限公司；WesternBright Sirius 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒購自Advansta 公司；Western blotting 一抗稀釋液、DAPI染色液購自碧云天生物技術(shù)有限公司；轉(zhuǎn)染試劑Lipofectamine?3000、Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 購自Invitrogen 公司；PVDF 膜購自Millipore 公司；青鏈霉素混合液、PMSF、Tween-20、cocktail 購自Sigma 公司；Opti-MEM、高糖型DMEM 細(xì)胞培養(yǎng)基、胰蛋白酶購自Gibco 公司；DH5α 感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；兔源Myc 抗體、鼠源Myc 抗體購自Sigma公司；β-actin 抗體購自SantaCruz 公司；辣根過氧化物酶(HRP)標(biāo)記的羊抗兔IgG 購自武漢博士德公司；4%多聚甲醛通用型組織固定液購自Biosharp 公司；Triton X-100、抗熒光衰減封閉劑購自Solarbio 公司。

1.3 sTRIM56 結(jié)構(gòu)分析及截短體設(shè)計

sTRIM56 由755 個氨基酸組成，N 端具有TRIM 家族的3 個保守結(jié)構(gòu)域——鋅指結(jié)構(gòu)域(21～60 aa)、B-box 結(jié)構(gòu)域(164 ～205 aa)和超螺旋結(jié)構(gòu)域(220 ～287 aa)，但其C 末端結(jié)構(gòu)(288 ～755 aa)尚不十分清楚[1，10]。 根據(jù)sTRIM56基因序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，參考不同種屬的保守序列分析，將其分為4 個不同的截短體，同時為便于表達(dá)鑒定，在N 端均添加Myc 標(biāo)簽，構(gòu)建真核表達(dá)質(zhì)粒。4 個截短體分段分別為Myc-sTRIM56-ΔRING(80～755 aa)、Myc-sTRIM56-ΔN(210 ～755 aa)、Myc-sTRIM56-ΔC(1 ～287 aa)、Myc-sTRIM56-ΔC-C(1～210 aa)，結(jié)構(gòu)示意圖如圖1 所示。

圖1 sTRIM56 全長及截短體結(jié)構(gòu)示意圖

1.4 sTRIM56 全長及截短體的引物設(shè)計

參考NCBI 中sTRIM56的基因序列(GenBank No. KJ881160)，結(jié)合真核表達(dá)載體pXJ41 的酶切位點(diǎn)，設(shè)計含Myc 標(biāo)簽的擴(kuò)增sTRIM56基因全長的特異性引物。 同時根據(jù)sTRIM56全長序列以及4 個截短體序列的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，分別設(shè)計相應(yīng)的含Myc 標(biāo)簽序列的擴(kuò)增sTRIM56截短體的特異性引物。 引物由北京擎科生物技術(shù)有限公司合成，引物信息如表1 所示。

表1 PCR 擴(kuò)增引物及序列

1.5 sTRIM56 全長真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

豬肺泡巨噬細(xì)胞(3D4/21)在24 孔板中培養(yǎng)24 h 后，使用RNA-easy Isolation Reagent 提取總RNA，再使用PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser RT-PCR 試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得cDNA。 以cDNA 為模板，分別以F-Myc-sTRIM56-EcoRⅠ和R-sTRIM56-BamHⅠ為上、下游引物，PCR 擴(kuò)增Myc-sTRIM56(WT)全長基因。 PCR 反應(yīng)體系為25 μL:cDNA 50 ng，dNTP 2 μL，5×PrimeSTAR Buffer 5 μL，F(xiàn)-Myc-sTRIM56-EcoRⅠ和R-sTRIM56-BamH Ⅰ各1 μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。 PCR 反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min 30 s，35 個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。

用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切pXJ41 載體和Myc-sTRIM56全長基因，膠回收酶切產(chǎn)物。將目的基因與pXJ41 載體用T4 DNA Ligase 于16 ℃過夜連接；次日，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含有氨芐西林(50 μg/mL)的5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。 鑒定為陽性的質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.6 sTRIM56 截短體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

以成功構(gòu)建的pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)真核表達(dá)質(zhì)粒為模板，Myc-sTRIM56-ΔRING 分別以1F-Myc-sTRIM56-ΔRING-EcoR Ⅰ和RsTRIM56-BamH Ⅰ作為上、 下游引物，Myc -sTRIM56-ΔN 分別以2F-Myc-sTRIM56-ΔNEcoRⅠ和R-sTRIM56-BamHⅠ作為上、下游引物，Myc-sTRIM56-ΔC 分別以F-Myc-sTRIM56-EcoRⅠ和3R-sTRIM56-ΔC-BamHⅠ作為上、下游引物，Myc-sTRIM56-ΔC-C 分別以F-MycsTRIM56-EcoRⅠ和4R-sTRIM56-ΔC-C-BamHⅠ作為上、下游引物，PCR 擴(kuò)增Myc-sTRIM56各截短體基因。 PCR 反應(yīng)體系為25 μL:pXJ41-MycsTRIM56 50 ng，dNTP 2 μL，5×PrimeSTAR Buffer 5 μL，上、下游引物各1 μL，PrimeSTAR?HS DNA Polymerase(2.5 U/μL)0.25 μL，ddH2O 補(bǔ)足25 μL。 PCR 反應(yīng)條件:98 ℃預(yù)變性2 min；98 ℃變性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸2 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸3 min。 將PCR 產(chǎn)物進(jìn)行0.8%瓊脂糖凝膠電泳并膠回收。

用EcoRⅠ和BamHⅠ分別雙酶切pXJ41 載體和Myc-sTRIM56截短體基因，膠回收酶切產(chǎn)物；將目的基因與pXJ41 載體用T4 DNA Ligase 于16 ℃過夜連接；次日將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化到DH5α 感受態(tài)細(xì)胞中，37 ℃過夜培養(yǎng)，挑取單菌落接種于含有氨芐西林(50 μg/mL)的5 mL LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃、200 r/min 過夜培養(yǎng)，次日提取質(zhì)粒，進(jìn)行EcoRⅠ和BamHⅠ雙酶切鑒定。 鑒定為陽性的質(zhì)粒送北京擎科生物科技有限公司測序。

1.7 Western blotting 檢測融合蛋白的表達(dá)

將HEK-293T 細(xì)胞鋪于6 孔板中，待細(xì)胞密度達(dá)到70%～80%時，利用Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑分別轉(zhuǎn)染空載體pXJ41 和鑒定正確的重組質(zhì)粒pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)、pXJ41-MycsTRIM56-ΔRING、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔN、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC-C 各2 μg，然后置于37 ℃、5% CO2的恒溫細(xì)胞培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h。 將6 孔板置于冰上，棄上清，用PBS 緩沖液洗2 次后每孔加120 μL 裂解液裂解細(xì)胞，20 min 后將樣品收集到1.5 mL EP 管中，4 ℃、12 000 r/min 離心10 min，取上清移至新的1.5 mL EP 管，分別加入40 μL 4×loading buffer 混勻，煮沸15 min，置于-20 ℃保存，用于鑒定蛋白表達(dá)情況。

將已處理好的蛋白樣品進(jìn)行12% SDSPAGE 電泳，電壓分別為濃縮膠80 V、分離膠120 V。 電泳結(jié)束后用PVDF 膜進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，110 V、70 min。 轉(zhuǎn)膜完畢，用含5%脫脂奶的TBST 室溫封閉2 h，然后TBST 洗膜5 min 并重復(fù)5 次。 分別用一抗稀釋液稀釋的兔源Myc 一抗于4 ℃下過夜孵育，TBST 洗膜5 min 并重復(fù)5 次。 用含5%脫脂奶的TBST 配制的HRP 標(biāo)記的羊抗兔二抗室溫孵育1 h，TBST 洗膜5 min 并重復(fù)5 次。 用WesternBright Sirius 化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒進(jìn)行顯色，BIO-RAD 凝膠成像儀進(jìn)行曝光。

1.8 IFA 檢測融合蛋白的細(xì)胞定位

用無菌鑷子夾取細(xì)胞爬片置于24 孔板內(nèi)，接種3D4/21 細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到40%～50%時，利用Lipofectamine?3000 轉(zhuǎn)染試劑，各孔分別轉(zhuǎn)染空載體pXJ41 和pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)、pXJ41 -Myc -sTRIM56 -ΔRING、pXJ41 -Myc -sTRIM56-ΔN、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC-C 質(zhì)粒各0.5 μg，靜置培養(yǎng)24 h 后吸棄培養(yǎng)基，PBS 小心清洗2 次后，用4%多聚甲醛室溫固定30～45 min 或4 ℃過夜。

固定結(jié)束后，棄掉4%多聚甲醛，用PBS 清洗10 min 并重復(fù)3 次。 加入0.1% Triton X-100 室溫通透30～45 min，用PBS 清洗10 min 并重復(fù)3次。 接著室溫孵育鼠源Myc 一抗2 h，用PBS 清洗10 min 并重復(fù)3 次。 室溫避光孵育Alexa Fluor 488 標(biāo)記的羊抗鼠IgG 二抗1 h，PBS 清洗10 min并重復(fù)3 次。 加入DAPI，室溫避光作用10 ～15 min，棄掉DAPI，PBS 清洗10 min 并重復(fù)3 次。最后加入適量抗熒光衰減封閉劑進(jìn)行封片，通過Leica 熒光顯微鏡觀察各蛋白在細(xì)胞內(nèi)的定位情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 sTRIM56 全長真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

通過RT-PCR 擴(kuò)增獲得Myc-sTRIM56全長基因。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳可見大小約為2 268 bp 的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖2)。 重組質(zhì)粒pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后得到預(yù)期大小的片段(圖3)，序列測定結(jié)果表明成功構(gòu)建了pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)表達(dá)質(zhì)粒。

圖2 Myc-sTRIM56(WT)全長基因的RT-PCR 擴(kuò)增

圖3 pXJ41-Myc-sTRIM56(WT)質(zhì)粒的EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切鑒定

2.2 sTRIM56 截短體真核表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建及鑒定

通過PCR 擴(kuò)增獲得Myc-sTRIM56-ΔRING、Myc-sTRIM56 -ΔN、Myc -sTRIM56 -ΔC、Myc -sTRIM56-ΔC-C截短體基因。 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)0.8%瓊脂糖凝膠電泳可見大小分別為2 028、1 638、861、630 bp 的特異性擴(kuò)增片段，與預(yù)期大小相符(圖4)。 截短體重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ/BamHⅠ雙酶切后得到預(yù)期大小的片段(圖5)，序列測定結(jié)果表明成功構(gòu)建了pXJ41 - Myc - sTRIM56 -ΔRING、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔN、pXJ41-MycsTRIM56-ΔC、pXJ41-Myc-sTRIM56-ΔC-C 截短體表達(dá)質(zhì)粒。

圖4 sTRIM56 各截短體基因的PCR 擴(kuò)增

圖5 sTRIM56 各截短體質(zhì)粒的EcoR Ⅰ/BamH Ⅰ雙酶切鑒定

2.3 sTRIM56 全長及截短體蛋白的表達(dá)

sTRIM56 全長及截短體的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染HEK-293T 細(xì)胞后，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)Western blotting 檢測，結(jié)果顯示sTRIM56 全長及截短體重組質(zhì)粒都能在細(xì)胞中表達(dá)，分別在約82、73、59、31、23 kDa 處出現(xiàn)特異性的單一蛋白條帶，且條帶大小與Myc-sTRIM56(WT)、Myc-sTRIM56-ΔRING、Myc-sTRIM56-ΔN、Myc-sTRIM56-ΔC、Myc-sTRIM56-ΔC-C 蛋白大小預(yù)期相符(圖6)；而空載體僅在約52 kDa 處出現(xiàn)一條非特異性條帶，與其他泳道相同。 表明sTRIM56 全長及截短體蛋白都能在轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中正常表達(dá)。

圖6 Western blotting 檢測sTRIM56 及其截短體質(zhì)粒的蛋白表達(dá)

2.4 sTRIM56 全長及截短體在細(xì)胞中的定位

sTRIM56 全長及截短體的真核表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染3D4/21 細(xì)胞后，利用IFA 檢測，熒光顯微鏡觀察顯示sTRIM56 全長Myc-sTRIM56-WT 及其不同截短體形式 Myc - sTRIM56 - ΔRING、 Myc -sTRIM56-ΔN、Myc-sTRIM56-ΔC、Myc-sTRIM56-ΔC-C 的蛋白均主要定位于細(xì)胞質(zhì)中(圖7)。

圖7 IFA 檢測融合蛋白的亞細(xì)胞定位

3 討論與結(jié)論

近年來，研究人員已對TRIM56 蛋白的結(jié)構(gòu)和功能進(jìn)行了初步的研究和探索，結(jié)果表明TRIM56 在機(jī)體的許多功能中都發(fā)揮著極其重要的作用，特別是其在抗病毒免疫中的作用越來越受到研究者的重視。 最近，TRIM56 被證明是少數(shù)能夠正向調(diào)節(jié)產(chǎn)生干擾素(IFN)的先天性免疫通路的TRIMs 之一[11]。 研究發(fā)現(xiàn)TRIM56 在機(jī)體先天抗病毒作用中具有多種生物學(xué)功能[12]，通過與其他宿主蛋白相互作用參與TLR3 信號通路和IFN-β 信號通路[13-14]。 例如，TRIM56 不僅可以通過與干擾素激活蛋白(STING)相互作用來調(diào)節(jié)先天免疫應(yīng)答，促進(jìn)STING 的K63 連接泛素化，經(jīng)多聚泛素化修飾靶蛋白，在機(jī)體防御病毒入侵方面發(fā)揮著重要作用[6]，還可以通過誘導(dǎo)環(huán)狀GMP-AMP 合成酶(cGAS)的Lys335 單泛素化，導(dǎo)致其二聚化，從而顯著增加DNA 結(jié)合活性以及cGAMP(cyclic GMP-AMP)產(chǎn)生[15]。 除此之外，TRIM56 作為一種多功能蛋白，還可以與病毒蛋白相互作用。

隨著對TRIM56 研究的不斷深入，也有研究指出TRIM56 的抗病毒活性機(jī)制不依賴于TLR3/TRIF、RIG-I 或STING，而主要依賴于其E3 泛素連接酶活性和C 端區(qū)域的完整性，這表明TRIM56 是一種限制病毒感染的新型抗病毒宿主因子[11，16]，有可能在抗病毒治療方面有著巨大的潛力。 從目前的研究結(jié)果來看，TRIM56 主要針對RNA 病毒，如黃熱病毒(YFV)、登革熱病毒血清型2(DENV2)、牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)以及人類冠狀病毒OC43(HcoV-OC43)等[16-18]，其RING＋超螺旋＋C 末端部分序列影響YFV 的復(fù)制，RING＋C 末端部分序列影響DENV2 的復(fù)制，RING 結(jié)構(gòu)域＋完整C 末端影響B(tài)VDV 的復(fù)制，RING 結(jié)構(gòu)域影響HCoV-OC43 的復(fù)制等[11]，可見TRIM56 可以通過不同結(jié)構(gòu)域來抑制病毒的復(fù)制。 此外，TRIM56 對DNA 病毒如單純皰疹病毒1 型(HSV-1)也有一定防御作用[15，19]。 盡管一些研究指出TRIM56 在肺中表達(dá)最為豐富，但關(guān)于TRIM56 對呼吸道病毒如流感病毒等負(fù)鏈RNA病毒的抗病毒譜及特性知之甚少[16]。

近年來雖然TRIM56 的研究主要集中于人，但對豬TRIM56 的研究也不可忽視。 目前，sTRIM56 的B-box 結(jié)構(gòu)域、C-C 區(qū)域或C 末端區(qū)域的其他部分等是否在sTRIM56 的抗病毒免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用仍不清楚，其具體機(jī)制和功能研究尚不徹底，許多抗病毒作用也有待闡明；同時，研究已表明人TRIM56 主要定位在細(xì)胞漿中[20]，但豬TRIM56 是否也定位于細(xì)胞漿中尚未明確，且sTRIM56 的具體功能與定位之間的關(guān)系還很模糊不清，需要進(jìn)一步研究和探索。

本研究首先構(gòu)建了sTRIM56 全長及其4 個截短體的真核表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切及測序進(jìn)行了鑒定，進(jìn)一步轉(zhuǎn)染HEK - 293T 細(xì)胞確定了sTRIM56 全長及其截短體蛋白的表達(dá)，并在3D/421 細(xì)胞中探索了其表達(dá)的蛋白主要定位于細(xì)胞質(zhì)中。 這些研究結(jié)果可為探究sTRIM56 蛋白及其不同結(jié)構(gòu)域在真核細(xì)胞中的功能以及在抗病毒先天免疫反應(yīng)中的作用奠定基礎(chǔ)。