張慶 景于娣 陳祉伊 岳明 補(bǔ)成中 張騰 譚鵬 孫玉 徐波

1.中國(guó)石油集團(tuán)川慶鉆探工程有限公司頁(yè)巖氣勘探開(kāi)發(fā)項(xiàng)目經(jīng)理部 2.西南石油大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院 3.中國(guó)石油塔里木油田分公司監(jiān)督中心 4.中國(guó)石油集團(tuán)川慶鉆探工程有限公司安全環(huán)保質(zhì)量監(jiān)督檢測(cè)研究院

隨著頁(yè)巖氣的開(kāi)發(fā),川南威遠(yuǎn)頁(yè)巖氣區(qū)塊長(zhǎng)期出現(xiàn)集輸管道腐蝕、穿孔等現(xiàn)象,造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失[1]。劉喬平[2]和李鑫[3]等在對(duì)頁(yè)巖氣和油田中集輸管道的腐蝕原因進(jìn)行分析研究中發(fā)現(xiàn)微生物腐蝕(microbiologically influenced corrosion,MIC)是造成管道腐蝕穿孔的主要因素。有研究認(rèn)為,在頁(yè)巖氣生產(chǎn)過(guò)程中,壓裂液的使用會(huì)使得微生物進(jìn)入集輸管道,從而發(fā)生微生物腐蝕作用,引起集輸管道穿孔失效[4-6]。因此,頁(yè)巖氣開(kāi)采中對(duì)微生物有關(guān)的研究十分必要。Cluff和Zhong等[7-8]在對(duì)Duvernay,Marcellus等地區(qū)的研究中,發(fā)現(xiàn)在水力壓裂過(guò)程之后,返排液和采出水中大多數(shù)群落與發(fā)酵、碳?xì)浠衔镅趸土蜓h(huán)代謝相關(guān)的耐鹽細(xì)菌有關(guān)。一些研究發(fā)現(xiàn),造成集輸管道腐蝕的微生物主要包括硫酸鹽還原菌(sulfate-reducing bacteria,SRB),鐵氧化菌(iron-oxidizing bacteria,IOB),產(chǎn)酸菌(acid-producing bacteria,APB)與產(chǎn)黏液菌(slime-producing bacteria,SPB)[9-12]。目前,對(duì)川南威遠(yuǎn)頁(yè)巖氣區(qū)塊微生物的相關(guān)研究甚少,特別是對(duì)關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌的分析及菌群演替規(guī)律更少涉及。

以威遠(yuǎn)頁(yè)巖氣區(qū)塊某平臺(tái)頁(yè)巖氣開(kāi)采過(guò)程中的配液用水與采出水(清水配液、回用返排液和采出水)為對(duì)象,研究了配液用水與采出水中細(xì)菌的多樣性,探究了其關(guān)鍵的腐蝕細(xì)菌,初步解析出配液用水與采出水間細(xì)菌的演替規(guī)律,從而為細(xì)菌引起的管道腐蝕提供依據(jù),并為后續(xù)有效的防護(hù)提供參考。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 試劑與儀器

1.1.1試劑

DNA提取試劑盒FastDNA○RSPIN Kit For Soil,MP Biomedicals公司;引物314F和806R,北京諾禾致源科技股份有限公司;6×DNA loading buffer,北京索萊寶科技有限公司;AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒,美國(guó)愛(ài)思進(jìn)公司。

1.1.2儀器

5810R高速冷凍離心機(jī),德國(guó)eppendorf股份公司;Nanodrop 2000核酸測(cè)定儀,美國(guó)Thermo Fisher公司;T100 PCR儀、 PowerPac1645050電泳儀,美國(guó)Bio-rad公司;MiSeq PE300高通量測(cè)序平臺(tái),美國(guó)Illumina公司;QuantiFluor-ST熒光計(jì),美國(guó)Promega公司。

1.2 方法

1.2.1樣品的采集

四川威遠(yuǎn)地區(qū)頁(yè)巖屬于五峰-龍馬溪組,頁(yè)巖儲(chǔ)層主要在缺氧條件成藏,儲(chǔ)層溫度為90～120 ℃[13-14]。在此區(qū)塊某平臺(tái)上共采集7個(gè)配液用水與采出水樣品,其中配液用水是回用返排液與清水的混合物,而清水是附近江河湖泊水,平臺(tái)采用清水與返排液混合配液進(jìn)行壓裂。樣品瓶在取樣前預(yù)先使用N2吹掃排出空氣,樣品采集后于4 ℃保存,并立即帶回實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行后續(xù)分析。樣品信息如表1所列。

表1 樣品信息采集表樣品編號(hào)樣品性質(zhì)取樣時(shí)間L1配液用水(清水)2019-02-16L2配液用水(回用返排液)2019-02-22L3配液用水(回用返排液)2019-02-19L41井采出水2019-04-04L51井采出水2019-04-15L61井采出水2019-04-20L71井采出水2019-04-30

1.2.2DNA的提取

取樣品500 mL,使用孔徑為0.22 μm的無(wú)菌濾膜抽濾,將抽濾后的濾膜使用滅菌的剪刀剪碎,并收集濾膜碎片于滅菌的離心管中,使用FastDNA○RSPIN Kit For Soil試劑盒提取樣品中的總DNA,之后使用核酸測(cè)定儀檢測(cè)DNA的純度和含量。

1.2.3PCR擴(kuò)增及目標(biāo)產(chǎn)物檢測(cè)

以稀釋后的基因DNA為模板,使用特異引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為2%的瓊脂糖凝膠對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行電泳檢測(cè),條帶清晰且無(wú)明顯非特異性擴(kuò)增,即PCR成功。

1.2.4Illumina MiSeq測(cè)序

對(duì)目標(biāo)條帶進(jìn)行切割,利用AxyPrep DNA凝膠提取試劑盒將其條帶回收和純化,利用QuantiFluorTM-ST熒光計(jì)對(duì)PCR產(chǎn)物含量進(jìn)行定量檢測(cè),將目的擴(kuò)增片段構(gòu)建文庫(kù)(PE 2×300)進(jìn)行16S rRNA基因的高通量測(cè)序。

1.2.5細(xì)菌多樣性數(shù)據(jù)分析方法

下機(jī)數(shù)據(jù)進(jìn)行過(guò)濾、篩選和均一化處理后用于OTU聚類分析、Alpha和Beta多樣性分析。選取高頻數(shù)出現(xiàn)序列作為該OTU的代表序列,利用數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行物種注釋分析[15],獲得分類學(xué)信息并分別在門、屬等分類水平上統(tǒng)計(jì)各樣本的群落組成[16]。

2 結(jié)果與討論

2.1 基本數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

清水、回用返排液和采出水7個(gè)樣品共獲得高質(zhì)量的優(yōu)化序列528 450條,進(jìn)一步與物種注釋數(shù)據(jù)庫(kù)比對(duì)檢測(cè)并去除嵌合體序列后獲得有效序列共468 663條。通過(guò)97%相似度聚合后,共獲得1 940個(gè)OTU,對(duì)所有OTU進(jìn)行物種注釋分析,樣品結(jié)果共鑒定出42門76綱197目357科743屬1 124種。

2.2 細(xì)菌多樣性分析

2.2.1OTU聚集分析

圖1所示為7個(gè)樣品的OTU數(shù)目柱狀圖及Venn圖。從圖1可看出:配液用水樣品L1、L2和L3中OTU數(shù)目均較多,其中L2中OTU數(shù)目最多;采出水樣品L4、L5、L6和L7中OTU數(shù)目在350～500個(gè)之間,其中L5樣品中OTU數(shù)目最少。說(shuō)明配液用水中的物種豐富度高于采出水。Venn圖中展示了所有樣品共有和各樣品特有的OTU數(shù)目,可以看出配液用水樣品特有OTU數(shù)目比采出水樣品多。

2.2.2Alpha多樣性

為研究7個(gè)樣品細(xì)菌群落的豐富度和多樣性,在97%相似水平下對(duì)各樣品的Alpha多樣性指數(shù)進(jìn)行計(jì)算[17],結(jié)果見(jiàn)表2。Chao1和ACE指數(shù)用于評(píng)價(jià)樣品的物種群落豐富度,指數(shù)越高,樣本物種群落的豐富度就越高。物種群落多樣性用Shannon和Simpson來(lái)評(píng)價(jià),Shannon指數(shù)越高,Simpson指數(shù)越低,說(shuō)明樣本群落多樣性就越高[18]。由表2可知:配液用水(L1、L2和L3)的ACE和Chao1指數(shù)明顯高于其他樣品,說(shuō)明配液用水(L1、L2和L3)中物種豐富度更高;配液用水(L1和L2)的Shannon指數(shù)明顯高于其他樣品,Simpson指數(shù)低于其他樣品,說(shuō)明配液用水(L1和L2)中物種多樣性也更高。

表2 各樣品Alpha多樣性指數(shù)表樣品編號(hào)ACEChao1Shannon Simpson覆蓋率/%L1981.1991 012.3014.4960.02899.5L21 087.3991 059.5234.0360.05699.5L3979.667947.8512.9580.25399.5L4468.428451.0362.7840.14199.8L5584.803501.7502.5420.17699.7L6623.406612.0143.0140.13299.7L7595.605615.0473.2290.11299.7

圖2所示為7個(gè)樣品稀釋曲線圖。由圖2可知,所有樣品的稀釋曲線后期趨向平緩,覆蓋率均大于99.5%(見(jiàn)表2),表明本研究測(cè)序深度足夠,基本覆蓋到樣品中的所有物種,且能夠反映各樣品的真實(shí)情況,測(cè)序數(shù)據(jù)可滿足后續(xù)要求。

OTU分析及Alpha多樣性說(shuō)明壓裂過(guò)程中物種的豐富度降低,多樣性減少。這可能是由于配制壓裂液時(shí)會(huì)加入殺菌劑等化學(xué)藥劑進(jìn)行殺菌處理,隨后在地層高溫、高壓、厭氧極端條件下,物種的生長(zhǎng)受到極大的抑制甚至死亡,從而一直保持在較低水平,并使得采出水中物種的豐富度和多樣性也降至較低水平,但返排回地面后,由于較長(zhǎng)時(shí)間在地面儲(chǔ)水池或液罐中儲(chǔ)存,細(xì)菌開(kāi)始大量生長(zhǎng)繁殖,導(dǎo)致返排液在回用時(shí)細(xì)菌的豐富度大幅上升[19]。這與Struchtemeyer等[20]的研究結(jié)果一致。

2.2.3Beta多樣性

圖3所示為樣品間基于unweighted-unifrac距離計(jì)算的PCoA圖,用于反映樣品群落結(jié)構(gòu)間的差異大小[21]。PCoA圖中兩個(gè)樣本間距離越近,表明兩個(gè)樣品的群落組成越相似,反之群落組成差異越大。如圖3所示,回用返排液(L2、L3)和采出水(L4、L6)聚集在左側(cè),采出水(L5、L7)聚集在中下部,而清水L1與其他所有樣品明顯地分隔開(kāi),聚集為3個(gè)聚類,各聚類內(nèi)樣品細(xì)菌群落組成較相似,各聚類間存在顯著性差異。

清水配液(L1)與采出水(L4、L5、L6、L7)的細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)完全不同,這與Struchtemeyer等[20]的研究一致。采出水(L4、L5、L6、L7)間細(xì)菌群落組成有相似,也有顯著差異,這可能與采出時(shí)間有關(guān)。這與Cluff等[8]在美國(guó)賓夕法尼亞州Marcellus頁(yè)巖井進(jìn)行的水樣微生物群落動(dòng)態(tài)跟蹤研究結(jié)論一致。回用返排液(L2、L3)與部分采出水(L4、L6)間細(xì)菌群落組成較相似,這是因?yàn)楝F(xiàn)場(chǎng)壓裂采出水也會(huì)返排回地面進(jìn)行回用[22]。

2.3 細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)變化關(guān)系

2.3.1門水平上群落結(jié)構(gòu)分析

圖4所示為在門水平上不同樣品的細(xì)菌結(jié)構(gòu)。由圖4可知,在門水平上,變形菌門(Proteobacteria)、埃普西隆桿菌門(Epsilonbacteraeota)、厚壁菌門(Firmicutes)、擬桿菌門(Bacteroidetes)等是優(yōu)勢(shì)細(xì)菌群類(在所有樣品中平均相對(duì)豐度大于5%)。其中,變形菌門是相對(duì)豐度最高的菌門,平均相對(duì)豐度為56.85%;埃普西隆桿菌門也普遍分布于各樣品中,平均相對(duì)豐度為15.91%;厚壁菌門主要存在于L5中,擬桿菌門主要存在于L1中,其相對(duì)豐度分別為78.36%、21.29%。清水樣品L1中以好氧的變形菌門下α-變形菌綱 (Alphaproteobacteria)為主,采出水(L4、L5、L6、L7)以兼性厭氧的埃普西隆桿菌門、變形菌門下γ-變形菌綱(Gammaproteobacteria)和嚴(yán)格厭氧的δ-變形菌綱(Deltaproteobacteria)為主。這說(shuō)明,生產(chǎn)過(guò)程中微生物群落變化可能是由好氧菌門往厭氧菌門方向演替。

2.3.2屬水平上關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌及菌群演替規(guī)律分析

圖5所示為屬水平上各樣品共有細(xì)菌中的核心細(xì)菌占比情況。核心細(xì)菌包括了弓形桿菌屬(Arcobacter)、海細(xì)菌屬(Marinobacterium)、嗜氫菌屬(Hydrogenophilus)、假單胞菌屬(Pseudomonas)、硫磺螺旋菌屬(Sulfurospirillum)、脫硫微菌屬(Desulfomicrobium)。

弓形桿菌屬?gòu)V泛存在于油田土壤和采出水中,是一種兼性厭氧細(xì)菌[23],Ross等發(fā)現(xiàn)弓形桿菌屬能夠分泌胞外聚合物 (extracellular polymeric substances,EPS),并形成生物膜[24],假單胞菌屬也能分泌EPS[25]。因此,弓形桿菌屬和假單胞菌屬的存在可能會(huì)利于SRB等腐蝕細(xì)菌在管道內(nèi)壁的附著,從而加速管道腐蝕。海細(xì)菌屬是一種兼性厭氧的SRB,廣泛存在于油田采出水中,能夠利用脂肪酸、氨基酸、糖類和芳香族化合物等作為碳源生長(zhǎng),還原硫酸鹽進(jìn)行生長(zhǎng)代謝[26]。脫硫微菌屬能夠利用硫單質(zhì)作為電子受體產(chǎn)生硫化物,同時(shí)也能夠?qū)⒘蛩猁}還原為硫化物,從而推動(dòng)系統(tǒng)中的硫循環(huán),是油氣開(kāi)采中導(dǎo)致腐蝕的最主要的細(xì)菌[27]。硫磺螺旋菌屬屬于硫氧化細(xì)菌,參與了硫循環(huán)[28]。這些核心細(xì)菌屬于嗜溫細(xì)菌,大都是腐蝕細(xì)菌,可直接造成或促進(jìn)管道腐蝕,被認(rèn)為是關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌。

圖6所示為7個(gè)樣品屬水平上的熱力圖。從圖6可看出,關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌在回用返排液(L2、L3)和采出水(L4、L5、L6、L7)中的占比極大,并且清水配液(L1)中也存在。

對(duì)圖6及圖3分析可知,清水L1樣品與其他6個(gè)樣品的物種構(gòu)成有較大的區(qū)別。Limnohabitans、norank-CladeIII、CL500-29_marine_group、hgcI_clade、噬冷菌屬(Algoriphagus)、沉積小桿菌屬(Sediminibacterium)、黃桿菌屬(Flavobacterium)和Fluviicola等菌屬僅在L1中有著較高相對(duì)豐度(>75%),這些細(xì)菌幾乎均為江河湖泊中常見(jiàn)的好氧菌群,其硫酸鹽還原、產(chǎn)酸等功能非常弱,因此,對(duì)管道腐蝕有較小的風(fēng)險(xiǎn)。在壓裂液注入地層后,采出水群落結(jié)構(gòu)發(fā)生改變,鑒定出更多的是與腐蝕相關(guān)的細(xì)菌,如嗜溫的脫硫芭蕉菌屬(Desulfuromusa)、弧菌屬(Vibrio)、希瓦氏菌屬(Shewanella)、海旋菌屬(Thalassospira)、海神單胞菌屬(Neptunomonas)、寡養(yǎng)單胞菌屬(Stenotrophomonas)和嗜熱的芽孢桿菌屬(Bacillus)、Thermovirga、熱袍菌屬(Thermotoga)等。關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌的相對(duì)豐度也在急劇增加,可能是由于配制壓裂液時(shí)加入的化學(xué)添加劑中的有機(jī)物提供了碳源,以及受地層環(huán)境因素的影響。采出水樣品中的菌群大多數(shù)為嗜溫細(xì)菌,也有少部分為嗜熱菌,但它們大多數(shù)(>90%)都屬于兼性厭氧、厭氧或嚴(yán)格厭氧細(xì)菌,且具有硫酸鹽還原、硫還原、硫氧化、產(chǎn)酸、產(chǎn)生物膜、鐵還原等功能,這些細(xì)菌一旦在管道內(nèi)大量富集,可能會(huì)對(duì)現(xiàn)場(chǎng)集輸管道造成嚴(yán)重的腐蝕。特別是在回用返排液L2和L3中,存在大量的硫代謝、產(chǎn)酸和產(chǎn)生物膜的細(xì)菌,腐蝕細(xì)菌在L2中的相對(duì)豐度超過(guò)75%,L3中也超過(guò)67%。

3 結(jié)論

(1) 威遠(yuǎn)頁(yè)巖氣區(qū)塊某平臺(tái)配液用水與采出水中細(xì)菌的高通量測(cè)序共鑒定出42門76綱197目357科743屬1 124種。Alpha多樣性及Beta分析結(jié)果顯示,清水配液的物種組成與其他樣品差距很大,壓裂后物種豐富度降低,多樣性減少。

(2) 門水平清水樣品以好氧的變形菌門下α-變形菌綱為主,采出水樣品以兼性厭氧的埃普西隆桿菌門、變形菌門下γ-變形菌綱和嚴(yán)格厭氧的δ-變形菌綱為主;屬水平采出水樣品主要以弓形桿菌屬和海細(xì)菌屬為主;各樣品關(guān)鍵腐蝕細(xì)菌主要包括弓形桿菌屬、海細(xì)菌屬、假單胞菌屬、硫磺螺旋菌屬、脫硫微菌屬,這些細(xì)菌屬于嗜溫細(xì)菌,可直接造成或促進(jìn)管道腐蝕。

(3) 清水配液中細(xì)菌群落是由嗜溫、好氧、硫酸鹽還原、產(chǎn)酸等功能較弱的細(xì)菌為主,回用返排液中存在大量具有硫代謝、產(chǎn)酸和產(chǎn)生物膜功能的細(xì)菌,經(jīng)壓裂后,采出水中以兼性厭氧、厭氧或嚴(yán)格厭氧,即具有硫酸鹽還原、硫還原、硫氧化、產(chǎn)酸、產(chǎn)生物膜、鐵還原等功能的細(xì)菌為主,并鑒定出部分嗜熱細(xì)菌。回用返排液與采出水細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)相似。