劉澤清，宋秀蘭，張雨青

（太原理工大學(xué) 環(huán)境科學(xué)與工程學(xué)院，山西 晉中 030600）

基于活性污泥法的污水處理工藝會產(chǎn)生大量剩余污泥。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2020年我國城市污水處理能力約為5 472.3 km3，剩余污泥產(chǎn)量超過60 Mt（以含水率80%計(jì)）［1］。剩余污泥組成十分復(fù)雜，包含了眾多有機(jī)物、致病微生物、重金屬等，易對環(huán)境造成嚴(yán)重污染。厭氧發(fā)酵是應(yīng)用最廣泛的剩余污泥處理處置方法之一，能有效實(shí)現(xiàn)污泥的減量化、穩(wěn)定化［2］。由于以產(chǎn)甲烷為導(dǎo)向的厭氧發(fā)酵技術(shù)周期長（15~30 d）、經(jīng)濟(jì)價值不如短鏈脂肪酸（SCFA）高，因此，基于剩余污泥的厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸技術(shù)成為持續(xù)研究熱點(diǎn)［3］。研究表明，SCFA可作為污水處理廠良好的外加碳源，也能用于合成高附加值產(chǎn)品，如可生物降解塑料和生物柴油［4-5］。然而，剩余污泥整體結(jié)構(gòu)復(fù)雜，胞外聚合物和半剛性的細(xì)胞壁重重包裹著污泥細(xì)胞，導(dǎo)致大分子有機(jī)物不易破胞溶出，限制了厭氧發(fā)酵的速率。為了提高污泥發(fā)酵產(chǎn)酸效率，需要對其進(jìn)行預(yù)處理。通常認(rèn)為，堿性條件較酸性和中性條件更適合污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸，它能促進(jìn)污泥溶解、強(qiáng)化水解酸化過程［6-7］。

三氯生（TCS），廣譜抗菌劑［8］，是一種典型的內(nèi)分泌干擾物質(zhì)，常用于生產(chǎn)各種藥品和個人護(hù)理用品［9］。分散于生態(tài)環(huán)境中的TCS，經(jīng)污水處理廠生化處理后最終富集于剩余污泥中，其含量可達(dá)0.028~37.189 mg/kg（以TSS計(jì)，下同）［10］。由于厭氧發(fā)酵過程包含了一系列復(fù)雜的代謝反應(yīng)和微生物活動，因此TCS可能會通過影響部分菌群和生物酶的活力影響發(fā)酵產(chǎn)酸效能。研究表明，污泥中TCS含量為100 mg/kg時，可促進(jìn)丁酸和丙酸的積累，使SCFA產(chǎn)量增加約36%；而較高含量的TCS（500 mg/kg）會抑制發(fā)酵［11］。盡管目前已有關(guān)于TCS對污泥厭氧發(fā)酵產(chǎn)酸影響的研究，但堿性條件下的該類研究仍未見報(bào)道。

本工作考察了TCS投加量對剩余污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)酸效果的影響，通過污泥溶解、水解、酸化和水解酶活力實(shí)驗(yàn)探究了TCS強(qiáng)化污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)酸的機(jī)理，并采用高通量測序技術(shù)分析了3種發(fā)酵條件下功能菌群的變化，以期為污泥資源化提供新的理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)用剩余污泥取自山西省楊家堡污水處理廠的濃縮池，并置于冰箱4 ℃下沉降24 h，棄去上清液，其基本性質(zhì)如表1所示。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

產(chǎn)酸實(shí)驗(yàn)采用6組工作體積為500 mL的血清瓶，每個血清瓶中加入450 mL剩余污泥。向各組血清瓶中分別投加0，40，120，200，400，500 mg/kg的TCS，使污泥的初始總TCS質(zhì)量濃度分別為0.073，0.785，2.210，3.635，7.197，8.978 mg/L；再用2.5 mol/L的NaOH和HCl溶液調(diào)節(jié)污泥pH為10，發(fā)酵第1 d調(diào)3次pH，每次間隔8 h，發(fā)酵第2、3 d每天各調(diào)節(jié)2次，每次間隔12 h。將所有血清瓶用氮?dú)獯祾? min，并立即用橡皮塞密封以保證厭氧環(huán)境；再置于恒溫空氣振蕩器中開始發(fā)酵，溫度和轉(zhuǎn)速分別設(shè)置為30 ℃和200 r/min。實(shí)驗(yàn)發(fā)酵周期為10 d，期間每天取樣，樣品在4 500 r/min下離心5 min，取上清液經(jīng)0.45 μm濾膜過濾，測定SCFA濃度。10 d發(fā)酵結(jié)束后，測定水相、泥相中TCS的濃度以及污泥VSS，根據(jù)發(fā)酵前后的VSS計(jì)算污泥的VSS減少率，以此表征有機(jī)質(zhì)的減少率。

機(jī)理研究中，選取空白、pH 10、pH 10+400 mg/kg TCS 3種發(fā)酵條件。在發(fā)酵2 d時，取樣測定污泥中α-葡萄糖苷酶和蛋白酶的活性；發(fā)酵5 d時取樣進(jìn)行微生物分析。進(jìn)行污泥溶解過程研究時，取樣測定發(fā)酵前3 d時的SCOD、溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質(zhì)濃度。進(jìn)行水解過程研究時，將2.423 g牛血清蛋白（BSA，模擬蛋白化合物）和0.719 g葡聚糖（模擬碳水化合物）溶解于405 mL蒸餾水中，接種45 mL原剩余污泥使最終污泥TSS為1.78 g/L，并在上述3種條件下進(jìn)行3 d發(fā)酵，每天取樣測定上清液中BSA和葡聚糖的濃度。酸化過程研究方法同水解過程一致，僅將模擬底物更換為L-丙氨酸和葡萄糖。

1.3 分析方法

1.3.1 TCS的測定

取適量污泥樣品，在GT10-1型離心機(jī)（北京時代北利離心機(jī)有限公司）中以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min以分離水相和泥相。將上清液，即水相，用1 mol/L的H2SO4溶液調(diào)節(jié)pH至2~3，過0.45 μm濾膜，于4 ℃保存。將離心后的污泥，即泥相，平鋪于干燥盤中，于-20 ℃冷凍24 h，再置于FD-1A-50型冷凍干燥機(jī)（北京博醫(yī)康實(shí)驗(yàn)有限公司）中于-50 ℃冷凍干燥48 h，研磨過篩（60目），稱取0.1 g于離心管中，加入5 mL甲醇，用THZ-C型渦旋混合器（大倉市實(shí)驗(yàn)設(shè)備廠）充分混合，超聲萃取30 min，以8 000 r/min轉(zhuǎn)速離心10 min，取上清液于棕色試管中，在40 ℃水浴條件下氮?dú)獯抵? mL，用超純水定容至100 mL，再用1 mol/L H2SO4溶液調(diào)節(jié)pH至2~3，于4 ℃保存。

將上述預(yù)處理后所得的水相和泥相樣品采用Oasis HLB型固相萃取柱（沃特世科技（上海）有限公司）進(jìn)行萃取，然后采用Agilent 1260 Inifinity Ⅱ型高效液相色譜儀（安捷倫科技有限公司）測定TCS質(zhì)量濃度。根據(jù)下式計(jì)算剩余污泥的總TCS質(zhì)量濃度（ρ，mg/L）；根據(jù)發(fā)酵后的水相TCS質(zhì)量濃度和發(fā)酵前的總TCS質(zhì)量濃度計(jì)算TCS的表觀去除率；根據(jù)發(fā)酵后和發(fā)酵前的總TCS質(zhì)量濃度計(jì)算TCS的降解率。

式中：ρw和ρs分別為水相和泥相中的TCS質(zhì)量濃度，mg/L；Cs為泥相中的TCS含量，mg/kg。

1.3.2 其他

TSS、VSS、SCOD和TCOD的測定均參照標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行［12］。采用SP 2100型氣相色譜儀（北京北分瑞利分析儀器有限公司）測定SCFA濃度，包括乙酸、丙酸、正丁酸、異丁酸、異戊酸、正戊酸6種有機(jī)酸，其濃度分別乘以換算因子1.07，1.51，1.82，1.82，2.04，2.04轉(zhuǎn)化為以COD計(jì)的濃度［13］?？扇苄缘鞍踪|(zhì)和BSA的測定采用福林酚試劑法［14］，溶解性碳水化合物、葡聚糖和葡萄糖的測定采用蒽酮-硫酸法［15］，L-丙氨酸測定采用液相色譜法［16］。溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質(zhì)濃度分別乘以換算因子1.06和1.50轉(zhuǎn)化為以COD計(jì)的濃度。參照文獻(xiàn)測定α-葡萄糖苷酶和蛋白酶的相對活力［17］。微生物樣品委托生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行Illumina MiSeq平臺測序分析。

2 結(jié)果與討論

2.1 TCS對污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)酸過程的影響

2.1.1 TCS投加量對SCFA產(chǎn)量的影響

圖1a顯示了TCS投加量對污泥堿性發(fā)酵（pH 10）過程中SCFA濃度的影響。整體而言，各組反應(yīng)體系SCFA濃度均隨發(fā)酵時間呈現(xiàn)出先迅速增大后逐漸減小的趨勢。原因是堿性條件促進(jìn)了污泥的分解過程，迅速釋放出水解、酸化過程所需的有機(jī)底物；而污泥中有機(jī)物隨發(fā)酵進(jìn)行不斷被消耗，導(dǎo)致了SCFA濃度難以進(jìn)一步提高。在發(fā)酵的前5 d，隨TCS投加量從0升至400 mg/kg，SCFA產(chǎn)量逐漸增大。在400 mg/kg TCS組發(fā)酵至5 d時達(dá)到最大SCFA濃度，為2 900.37 mg/L（產(chǎn)量2 740.96 mg/L），相比未投加TCS組5 d時提高了352.54 mg/L，這表明投加400 mg/kg的TCS可顯著提高SCFA產(chǎn)量。而進(jìn)一步提高TCS投加量至500 mg/kg時，SCFA濃度發(fā)生了下降。這表明一定量的TCS能夠有效強(qiáng)化污泥堿性發(fā)酵的產(chǎn)酸性能，而過高的TCS濃度可能對微生物有較強(qiáng)危害作用，從而抑制了污泥中產(chǎn)酸優(yōu)勢菌的生長，影響SCFA的進(jìn)一步積累［11］。因此，在本實(shí)驗(yàn)中，強(qiáng)化污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)酸的最佳TCS投加量為400 mg/kg。

SCFA可作為污水處理廠生物脫氮除磷的外加碳源，而其中乙酸的利用效率最高，因此提高SCFA中乙酸的相對含量有利于污泥資源化利用。圖1b顯示了堿性發(fā)酵5 d時，不同TCS投加量下的SCFA組成。由圖可知：在所有發(fā)酵條件下，乙酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)始終是最高的，占SCFA的30.20%~36.73%；其次是丙酸，占SCFA的18.56%~21.39%；而正戊酸的占比最低，約為7%。本實(shí)驗(yàn)中，400 mg/kg TCS組的乙酸相對含量最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)到36.73%，是未投加TCS組的1.22倍，表明該條件下的發(fā)酵液更適合作為污水廠的外加碳源，有助于實(shí)現(xiàn)污泥資源化。

2.1.2 TCS投加量對有機(jī)質(zhì)減少的影響

厭氧發(fā)酵過程能促進(jìn)污泥中固體有機(jī)質(zhì)的溶出和利用，這對污泥減量化意義重大。圖2顯示了10 d堿性發(fā)酵結(jié)束時不同TCS投加量下的VSS的變化情況，以此表征有機(jī)質(zhì)的變化。由圖2可知，所有投加TCS的反應(yīng)體系中VSS均低于未投加組，相應(yīng)的減少率均高于未投加組，表明TCS能有效促進(jìn)污泥厭氧發(fā)酵過程中有機(jī)質(zhì)的減少。隨著TCS投加量從0升至400 mg/kg，污泥的VSS減少率逐漸變大，在400 mg/kg TCS組達(dá)到最高（40.50%），相較未投加TCS組提高了3.39個百分點(diǎn)。這表明該條件下進(jìn)行發(fā)酵對污泥有機(jī)質(zhì)的消耗程度最高，有助于實(shí)現(xiàn)污泥減量化。

圖2 TCS投加量對有機(jī)質(zhì)的影響

2.1.3 污泥發(fā)酵過程對TCS的去除

污泥中TCS的去除有吸附和生物降解兩種途徑，其中吸附是依靠TCS在固-液相之間的遷移，而生物降解能真正去除TCS。研究表明，污泥厭氧發(fā)酵過程可以促進(jìn)污泥中抗生素的溶出，更好地發(fā)揮生物降解作用［18］。圖3顯示了10 d堿性發(fā)酵結(jié)束時，TCS在各組污泥樣品泥相、水相中的殘余濃度及其降解率。由圖3數(shù)據(jù)計(jì)算可知，各組水相中TCS的表觀去除率均超過90%，其中400 mg/kg TCS組的殘余總TCS濃度為3.61 mg/L，降解率達(dá)到最高值，為49.80%。

圖3 污泥堿性發(fā)酵對TCS的去除效果

2.2 TCS強(qiáng)化污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)酸的機(jī)理分析

2.2.1 污泥溶解過程

碳水化合物和蛋白質(zhì)是污泥細(xì)胞和胞外聚合物的主要組成部分，污泥厭氧發(fā)酵首先要將這些有機(jī)物由顆粒態(tài)轉(zhuǎn)化為溶解態(tài)，以便進(jìn)一步利用。因此，可溶性有機(jī)物的釋放情況能表征剩余污泥的溶解程度。圖4顯示了3種發(fā)酵條件下污泥中SCOD、溶解性碳水化合物及可溶性蛋白質(zhì)濃度在發(fā)酵3 d內(nèi)的變化情況。由圖可知，隨發(fā)酵時間的延長，3種不同發(fā)酵體系下的溶解性有機(jī)物濃度均不斷增加，且pH 10+400 mg/kg TCS組的SCOD、溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質(zhì)濃度均高于其他組。在發(fā)酵3 d時，pH 10+400 mg/kg TCS組的SCOD達(dá)到2 616.0 mg/L，分別是空白組和pH 10組的4.09和1.10倍。這表明，投加TCS進(jìn)一步促進(jìn)了堿性發(fā)酵條件下污泥中顆粒有機(jī)物的溶出，增強(qiáng)了污泥厭氧發(fā)酵的溶解過程。同時，pH 10+400 mg/kg TCS組的溶解性碳水化合物和可溶性蛋白質(zhì)濃度在發(fā)酵3 d時達(dá)到461.1 mg/L和1 225.3 mg/L，分別是空白組的4.52倍和1.14倍，pH 10組的4.66倍和1.04倍。這進(jìn)一步證明了投加TCS對污泥堿性發(fā)酵溶解過程有促進(jìn)作用，為后續(xù)微生物水解及酸化提供了更充足的底物，有利于SCFA的迅速積累。

圖4 發(fā)酵條件對污泥溶解過程影響

2.2.2 水解、酸化過程

污泥中的大分子有機(jī)物經(jīng)破胞溶出后，在微生物作用下會被進(jìn)一步水解成小分子，并代謝酸化成SCFA。因此，微生物的水解酸化速率也同SCFA積累密切相關(guān)。如圖5a和圖5b所示，本實(shí)驗(yàn)通過葡聚糖、BSA的降解模擬污泥水解過程。不難看出，3種發(fā)酵體系下BSA和葡聚糖的降解率均隨時間延長而不斷提高。在發(fā)酵3 d時，pH 10+400 mg/kg TCS組的BSA降解率最高（76.38%），相比空白組和pH 10組分別提高了25.92和2.56個百分點(diǎn)。同時，pH 10+400 mg/kg組發(fā)酵第3 d的葡聚糖降解率為44.00%，分別是空白組和pH 10組的1.32和1.10倍。由此可知，pH 10+400 mg/kg TCS組的水解速率最大，可使污泥中更多的溶解性大分子有機(jī)物（如碳水化合物和蛋白化合物）水解為低分子量物質(zhì)（如葡萄糖和氨基酸），為產(chǎn)酸菌群提供更多底物。上述結(jié)果表明，在堿性條件下，污泥中含有一定量TCS能有效提高水解效率。此外，本實(shí)驗(yàn)通過葡萄糖、L-丙氨酸的降解來模擬污泥酸化過程，如圖5c和圖5d所示。3種發(fā)酵體系下的L-丙氨酸和葡萄糖的降解率也隨發(fā)酵時間的延長而不斷提高。在發(fā)酵3 d時，pH 10+400 mg/kg TCS組中L-丙氨酸和葡萄糖的降解率分別為64.72%和71.75%，是空白組的1.17和1.11倍，相比pH 10組分別提高了5.40和3.82個百分點(diǎn)。這表明，污泥堿性發(fā)酵下投加TCS能進(jìn)一步促進(jìn)酸化過程，更多的水解產(chǎn)物被產(chǎn)酸微生物轉(zhuǎn)化為SCFA。

圖5 發(fā)酵條件對水解、酸化過程的影響

2.2.3 水解酶活力

SCFA復(fù)雜的代謝合成離不開眾多生物酶的參與，如功能菌群在水解大分子有機(jī)物時會分泌水解酶，以提高轉(zhuǎn)化效率。α-葡萄糖苷酶和蛋白酶是兩種關(guān)鍵的水解酶，分別通過破壞多糖的糖苷鍵和蛋白質(zhì)的肽鏈來促進(jìn)污泥水解，產(chǎn)生葡萄糖和氨基酸。圖6顯示了污泥發(fā)酵2 d時這兩種水解酶的相對活力（以空白組酶活力為100%）。由圖可知：pH 10+400 mg/kg TCS組的α-葡萄糖苷酶活力為空白組的1.62倍，比pH 10組提高了11個百分點(diǎn)；pH 10+400 mg/kg TCS組的蛋白酶活力是空白組的2.21倍，比pH 10組提高了7個百分點(diǎn)。這表明堿性條件促進(jìn)了兩種關(guān)鍵水解酶的釋放，而投加TCS能進(jìn)一步提高酶活力，從而提升污泥水解速率，為產(chǎn)酸微生物提供更多小分子底物。

圖6 發(fā)酵條件對水解酶活力的影響

2.3 功能菌群分析

污泥厭氧發(fā)酵體系中微生物群落結(jié)構(gòu)復(fù)雜，為了實(shí)現(xiàn)SCFA的富集，需要各種微生物相互配合。如圖7所示，在門水平上的優(yōu)勢菌群主要包括厚壁菌門（Firmicutes）、放線菌門（Actinobacteria）和變形菌門（Proteobacteria）。研究表明，厚壁菌門微生物能釋放水解酶、利用有機(jī)物產(chǎn)酸且抗極端環(huán)境能力強(qiáng)，而放線菌門微生物與大分子有機(jī)物的降解密切相關(guān)［19-22］。二者在pH 10+400 mg/kg TCS組的合計(jì)相對豐度由空白組的5.98%大幅增至51.78%，比pH 10組提高了2.22個百分點(diǎn)。變形菌門（Proteobacteria）微生物主要參與發(fā)酵過程中乙酸、丙酸和丁酸的消耗［23］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度為21.53%，相較于空白組和pH 10組分別降低了11.27和2.55個百分點(diǎn)。

圖7 不同發(fā)酵條件下微生物在門水平上的相對豐度

如圖8所示，在綱水平上的優(yōu)勢菌群主要有梭狀芽孢桿菌綱（Clostridia）、放線菌綱（Actinobacteria）和α-變形菌綱（Alphaproteobacteria）。梭狀芽孢桿菌綱是水解大分子有機(jī)物的主要菌群［24］，在pH 10+400 mg/kg TCS組其相對豐度為33.01%，高于空白組（1.76%）和pH 10組（31.50%）。放線菌綱微生物是典型的發(fā)酵產(chǎn)酸菌，能利用水解底物進(jìn)行SCFA的生產(chǎn)［25］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度也顯著高于空白組（3.80%）和pH 10組（10.15%），達(dá)到11.63%。α-變形菌綱微生物可利用糖類和蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)化產(chǎn)生乙酸和丙酸［26］，在pH 10+400 mg/kg TCS組中相對豐度為12.32%，相比空白組提高了3.52個百分點(diǎn)。上述結(jié)果表明，堿性發(fā)酵條件下投加TCS有效富集了污泥中SCFA的生產(chǎn)者，同時也削減了消費(fèi)者，促進(jìn)了SCFA的不斷積累。

圖8 不同發(fā)酵條件下微生物在綱水平上的相對豐度

圖9進(jìn)一步在屬水平上分析了3組污泥樣品的微生物群落分布情況。由圖可知，厭氧醋菌屬（Acetoanaerobium）、蛋白水解菌屬（Proteinivorax）和泰氏菌屬（Tissierella）是3種主要的優(yōu)勢菌屬，且同屬于厚壁菌門（Firmicutes），該菌門中不少微生物都對產(chǎn)酸發(fā)揮主要作用。厭氧醋酸菌屬微生物可以吸收H2和CO2并轉(zhuǎn)化為乙酸［27］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度為15.88%，顯著高于空白組（0.08%）且比pH 10組提高了0.88個百分點(diǎn)。這表明，pH 10條件下污泥發(fā)酵易產(chǎn)生更多乙酸，而投加TCS也能進(jìn)一步提高乙酸相對含量。蛋白水解菌屬微生物可在堿性厭氧條件下，以蛋白質(zhì)、二糖、丙酮等物質(zhì)作基質(zhì)產(chǎn)生SCFA［28］，其在pH 10+400 mg/kg TCS組中的相對豐度達(dá)到1.90%，高于pH10組（0.53%），而在空白組中未發(fā)現(xiàn)。這說明TCS的存在有效富集了蛋白水解菌屬微生物。此外，pH 10+400 mg/kg TCS組中的泰氏菌屬的相對豐度由空白組的0.02%升至6.12%，且顯著高于pH 10組（4.57%）。有研究表明，該菌屬微生物通過代謝有機(jī)物可產(chǎn)生乙酸、丁酸和氨氮［29］。

圖9 不同發(fā)酵條件下微生物在屬水平上的相對豐度

上述結(jié)果表明，pH 10+400 mg/kg TCS發(fā)酵體系通過破壞污泥細(xì)胞釋放出可溶性有機(jī)物，有效促進(jìn)了水解和產(chǎn)酸菌的富集。該結(jié)論證實(shí)了TCS對污泥堿性發(fā)酵產(chǎn)酸的強(qiáng)化作用。

3 結(jié)論

a）TCS影響污泥堿性發(fā)酵（pH 10）的產(chǎn)酸效果。當(dāng)TCS投加量為400 mg/kg且發(fā)酵5 d時，SCFA的產(chǎn)量最高，為2 740.96 mg/L，相比未投加TCS時提高了352.54 mg/L。該體系中，乙酸在SCFA中的占比最高，質(zhì)量分?jǐn)?shù)達(dá)36.73%；以VSS減少率表征的有機(jī)質(zhì)減少率最大，達(dá)40.50%，有助于污泥資源化利用。

b）機(jī)理研究表明，TCS進(jìn)一步促進(jìn)了污泥堿性發(fā)酵的溶解、水解和酸化過程，同時增強(qiáng)了水解酶的活力，為產(chǎn)酸微生物提供更多底物。

c）功能菌群分析表明，TCS顯著強(qiáng)化了厚壁菌門和放線菌門微生物在污泥堿性發(fā)酵過程中的富集，尤其是厚壁菌門的厭氧醋酸菌屬和泰氏菌屬微生物，其相對豐度分別達(dá)到15.88%和6.12%，有利于SCFA的積累。