陳志遠(yuǎn)，李樹(shù)凡，遲麗麗，于澤海，劉健，張玫瑜，徐守振

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，山東 青島 266109)

牛支原體(Mycoplasmabovis)是柔膜體綱、支原體屬中的一員，是引起牛病的一種重要的致病性病原體，在1961年被鑒定為致乳腺炎的病原，1976年被描述為呼吸道疾病的病因并命名為牛支原體[1]?，F(xiàn)在證實(shí)牛支原體還可以導(dǎo)致牛的關(guān)節(jié)炎、流產(chǎn)、生殖道炎癥等多種疾病[2]。牛群運(yùn)輸、飼養(yǎng)管理、環(huán)境變化等都可能引起牛支原體的流行，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大危害。近年來(lái)隨著養(yǎng)牛業(yè)的不斷發(fā)展，養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，牛支原體感染已呈世界性分布，日本、歐洲、美國(guó)都暴發(fā)過(guò)牛支原體肺炎，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失[3-4]。2008年，我國(guó)首次出現(xiàn)了支原體引起的牛壞死性肺炎疫情[5]。2010年湖北省從外地引進(jìn)的肉牛出現(xiàn)了以壞死性肺炎為主要特征的呼吸道傳染病并在全省快速傳播[6]，在中國(guó)十多個(gè)省份報(bào)道了牛支原體肺炎病例，危害十分嚴(yán)重，造成的經(jīng)濟(jì)損失巨大[7]。牛支原體引起的疾病嚴(yán)重阻礙了我國(guó)養(yǎng)牛業(yè)的健康發(fā)展。因此，深入對(duì)支原體蛋白的研究，建立準(zhǔn)確而快速的牛支原體抗體檢測(cè)方法是十分必要的。

由于支原體缺乏細(xì)胞壁，所以支原體細(xì)胞膜表面的膜蛋白在侵襲過(guò)程中起著非常重要的作用。目前認(rèn)為，牛支原體主要通過(guò)膜蛋白纖毛，促進(jìn)炎性因子的分泌、激活炎癥信號(hào)通路等方式干擾宿主細(xì)胞膜表面受體的功能，導(dǎo)致宿主細(xì)胞膜損傷甚至引起細(xì)胞凋亡[8]。P48蛋白廣泛存在于支原體表面，影響宿主細(xì)胞的黏附作用，與致病機(jī)理密切相關(guān)。支原體P48蛋白與其他膜蛋白相比，不同菌株間的基因序列同源性極高，具有保守性高的優(yōu)勢(shì)[9]，可用作牛支原體診斷的靶標(biāo)抗原，適用于診斷試劑的開(kāi)發(fā)[10]。由于支原體的特殊結(jié)構(gòu)，普通的藥物治療效果不顯著且沒(méi)有成熟的商品化疫苗[11]。病原的分離周期長(zhǎng)，營(yíng)養(yǎng)要求高，需要專業(yè)人員和儀器設(shè)備，因而無(wú)法適應(yīng)牧場(chǎng)大量牛群篩選工作。ELISA有著高通量、操作簡(jiǎn)單快捷、靈敏性及特異性好等優(yōu)點(diǎn)，被廣泛應(yīng)用于牧場(chǎng)檢測(cè)和篩查牛支原體。目前，用P48全蛋白建立抗體ELISA檢測(cè)方法未見(jiàn)報(bào)道。因此，本研究選取P48全蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)、純化和Western blot鑒定，建立牛支原體抗體間接ELISA檢測(cè)方法，對(duì)該病的診斷、抗體水平的評(píng)估和防控措施的制定都具有重大意義。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

牛支原體抗體陰、陽(yáng)性血清，牛巴氏桿菌抗體陽(yáng)性血清，牛曼氏桿菌抗體陽(yáng)性血清，牛呼吸道合胞體病毒(BRSV)抗體陽(yáng)性血清，牛傳染性鼻氣管炎病毒(IBRV)抗體陽(yáng)性血清，牛病毒性腹瀉病毒(BVDV)抗體陽(yáng)性血清，牛結(jié)核病(MAP)抗體陽(yáng)性血清均由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)獸醫(yī)微生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室保存，臨床血清收集自山東地區(qū)規(guī)?；膛?chǎng)。

1.2 主要試劑和儀器

重組質(zhì)粒pCold-P48由實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建，His蛋白純化試劑盒購(gòu)自康為世紀(jì)生物科技有限公司；馬血清購(gòu)自Biosharp公司；酪蛋白、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗牛HRP標(biāo)記抗體、TMB單組份顯色液購(gòu)自Solarbio公司；牛支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒購(gòu)于國(guó)生生物；蛋白電泳儀、凝膠成像儀購(gòu)自Bio-Rad公司；超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)購(gòu)自寧波新芝股份生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 P48蛋白原核表達(dá)及純化

重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化BL21(DE3)感受態(tài)細(xì)胞，培養(yǎng)至菌液OD600為0.5～0.8時(shí)，加入IPTG至終濃度為0.5 mmol/L，16 ℃、220 r/min培養(yǎng)12 h，離心收集菌體沉淀，蛋白超聲破碎后，分別取上清液和沉淀進(jìn)行SDS-PAGE，檢測(cè)蛋白是否可溶性表達(dá)。按照蛋白純化試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行重組蛋白純化。

1.3.2 表達(dá)產(chǎn)物Western blot鑒定

采用濕轉(zhuǎn)法進(jìn)行Western blot鑒定，100 V恒壓轉(zhuǎn)膜100 min；5% BSA封閉液室溫封閉1 h；1∶2 000稀釋鼠源抗His標(biāo)簽一抗，4 ℃孵育過(guò)夜；1∶2 000稀釋兔抗鼠HRP標(biāo)記抗體，室溫孵育1 h；按照碧云天BeyoECL Plus試劑盒說(shuō)明進(jìn)行顯色。

1.3.3 間接ELISA檢測(cè)方法建立

對(duì)純化后的P48蛋白，以間接ELISA方法為基礎(chǔ)，采用單因素變量的試驗(yàn)方式，分別對(duì)影響間接ELISA反應(yīng)的抗原包被濃度、最佳封閉液、一抗稀釋度、二抗稀釋度、抗原包被時(shí)間、封閉時(shí)間、一抗孵育時(shí)間、二抗孵育時(shí)間、顯色時(shí)間等因素進(jìn)行方陣優(yōu)化，每孔做3次平行重復(fù)，并計(jì)算變異系數(shù)，以評(píng)估本方法的重復(fù)性。

1.3.4 間接ELISA方法陰陽(yáng)性臨界值確定

1.3.5 特異性試驗(yàn)

使用優(yōu)化后的ELISA方法對(duì)牛支原體抗體陰、陽(yáng)性血清，IBRV，BVDV，MAP，BRSV，牛巴氏桿菌，牛曼氏桿菌抗體陽(yáng)性血清進(jìn)行同步檢測(cè)，以評(píng)估本ELISA方法的特異性。每孔做3次重復(fù)，并計(jì)算變異系數(shù)。

1.3.6 敏感性試驗(yàn)

將牛支原體抗體陽(yáng)性血清倍比稀釋至1∶160、1∶320、1∶640、1∶1 280、1∶2 560、1∶5 120、1∶10 240，使用優(yōu)化后的ELISA方法進(jìn)行檢測(cè)，以評(píng)估本ELISA方法的敏感性。每孔做3次重復(fù)，并計(jì)算變異系數(shù)。

1.3.7 重復(fù)性試驗(yàn)

使用不同批次的蛋白包被酶標(biāo)板，選取4份支原體陰性牛血清和4份牛支原體陽(yáng)性牛血清進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)血清做6個(gè)重復(fù)。使用同一批次的P48蛋白包被，對(duì)8份牛血清進(jìn)行檢測(cè)，每個(gè)血清做6個(gè)重復(fù)，檢測(cè)結(jié)果分別計(jì)算變異系數(shù)，判定其重復(fù)性。

1.3.8 臨床樣品檢測(cè)

應(yīng)用建立的ELISA方法與商品化牛支原體抗體ELISA檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)90份臨床牛血清樣品，比較檢測(cè)結(jié)果，計(jì)算陰陽(yáng)性符合率。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組P48蛋白表達(dá)及鑒定

SDS-PAGE結(jié)果顯示，超聲破碎后分離上清液成功表達(dá)P48蛋白，大小為103 kDa，與預(yù)期大小相符(見(jiàn)圖1)，純化后的蛋白與目的蛋白大小一致。Western blot鑒定結(jié)果顯示，純化后的重組P48蛋白在103 kDa處出現(xiàn)了特異性條帶，目的蛋白大小與預(yù)期大小相符，說(shuō)明表達(dá)的蛋白為目的蛋白(見(jiàn)圖2)。

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 誘導(dǎo)后沉淀；2.誘導(dǎo)后上清液；3. 對(duì)照菌液。圖1 P48蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)分析

M. 蛋白質(zhì)分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)；1. 未誘導(dǎo)對(duì)照；2. 重組P48蛋白；3. 空載體。圖2 重組蛋白的Western blot鑒定

2.2 間接ELISA方陣優(yōu)化

2.2.1 最佳抗原包被濃度的確定

結(jié)果顯示，抗原包被濃度為5 μg/mL時(shí)，P/N比值最高，確定為最佳的抗原包被濃度，各包被濃度OD值見(jiàn)表1。

表1 抗原包被濃度優(yōu)化

2.2.2 最佳封閉液的確定

結(jié)果顯示，當(dāng)封閉液為10%馬血清時(shí)，陰陽(yáng)性P/N值最高，確定為最佳的封閉液，各封閉液OD值見(jiàn)表2。

表2 最佳封閉液選擇

2.2.3 一抗最佳稀釋度的確定

結(jié)果顯示，當(dāng)一抗稀釋度為1∶160時(shí)，P/N值最高，確定為最佳一抗稀釋度，各一抗稀釋度OD值見(jiàn)表3。

表3 一抗稀釋度優(yōu)化

2.2.4 二抗最佳稀釋度的確定

結(jié)果顯示，當(dāng)酶標(biāo)二抗稀釋度為1∶12 000時(shí)，P/N值最高，確定為最佳二抗稀釋度，各二抗稀釋度OD值(見(jiàn)表4)。

表4 二抗稀釋度優(yōu)化

2.2.5 最佳包被溫度、時(shí)間、封閉時(shí)間的確定

結(jié)果顯示，當(dāng)包被溫度為4 ℃，包被時(shí)間為過(guò)夜，封閉時(shí)間為2 h時(shí)，P/N值最高，確定為最佳包被和封閉條件，各條件的OD值見(jiàn)表5。

表5 包被溫度、時(shí)間、封閉時(shí)間優(yōu)化

2.2.6 一抗孵育時(shí)間及顯色時(shí)間

結(jié)果顯示，當(dāng)一抗孵育時(shí)間為1 h，顯色時(shí)間為20 min時(shí)，P/N值最高，確定為最佳一抗孵育時(shí)間和顯色時(shí)間，各條件的OD值見(jiàn)表6。

表6 一抗孵育時(shí)間及顯色時(shí)間優(yōu)化

2.2.7 酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間的優(yōu)化

結(jié)果顯示，當(dāng)酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間為30 min時(shí)，P/N值最高，確定為最佳二抗孵育時(shí)間，酶標(biāo)二抗孵育時(shí)間的OD值見(jiàn)表7。

表7 二抗孵育時(shí)間優(yōu)化

經(jīng)過(guò)方陣優(yōu)化后最佳條件為：5 μg/mL抗原包被后4 ℃過(guò)夜，10%馬血清封閉時(shí)間2 h，1∶160稀釋一抗孵育1 h，1∶12 000稀釋二抗孵育30 min，顯色20 min。

2.3 間接ELISA方法陰陽(yáng)性臨界值確定

表8 陰陽(yáng)性臨界值的確定

2.4 特異性試驗(yàn)

特異性試驗(yàn)結(jié)果顯示，僅牛支原體抗體陽(yáng)性血清檢測(cè)OD450值大于0.361，其他血清均為陰性(表9)，表明該方法具有良好的特異性。

表9 特異性試驗(yàn)結(jié)果

2.5 敏感性試驗(yàn)

敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，當(dāng)陽(yáng)性血清稀釋2 560倍時(shí)，OD450值仍大于0.361(表10)，表明本方法具有良好的敏感性。

表10 敏感性試驗(yàn)結(jié)果

2.6 重復(fù)性試驗(yàn)

使用優(yōu)化后的ELISA條件，檢測(cè)血清樣品，檢測(cè)結(jié)果顯示，批間重復(fù)試驗(yàn)和批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)的變異系數(shù)均小于15%(表11、表12)，表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表11 批間重復(fù)性試驗(yàn)

表12 批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)

2.7 臨床樣品檢測(cè)

使用建立的間接ELISA方法與商品化牛支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒同時(shí)檢測(cè)90份臨床牛血清樣品，并對(duì)檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(表13)。牛支原體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果：陽(yáng)性樣品27份，陰性樣品63份。建立的間接ELISA檢測(cè)方法檢測(cè)27份陽(yáng)性樣品結(jié)果為24份陽(yáng)性，3份陰性；63份陰性樣品中，58份陰性5份陽(yáng)性；兩者陽(yáng)性符合率為88.89%，陰性符合率為92.06%，總體符合率為91.11%。

表13 臨床樣品檢測(cè)結(jié)果

3 討論

牛支原體相關(guān)疾病已成為危害養(yǎng)牛業(yè)的重要疾病之一，我國(guó)多個(gè)地區(qū)發(fā)生過(guò)牛支原體感染，造成了嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。目前，牛支原體的診斷包括病原分離鑒定、分子生物學(xué)、血清學(xué)診斷等[12]，牛支原體生長(zhǎng)緩慢，診斷周期長(zhǎng)，對(duì)病料的采集、運(yùn)輸、試驗(yàn)設(shè)備要求較高，臨床診斷較為困難。對(duì)牛群進(jìn)行支原體抗體篩查可追蹤牛群近期感染情況，有利于判定牛群的感染狀態(tài)。牛支原體抗體檢測(cè)有多種方法，特異性抗體的血清學(xué)檢測(cè)被認(rèn)為是篩選牛群的常用方法[13]，由于間接ELISA方法對(duì)儀器、環(huán)境要求不高，敏感性好，成本較低，檢測(cè)迅速，因此得到了廣泛認(rèn)可，在對(duì)臨床血清、乳樣的大規(guī)?？贵w檢測(cè)上具有廣闊的前景。目前，已經(jīng)建立了P28[14]、P81[15]等牛支原體蛋白抗體檢測(cè)方法，因?yàn)楦鱾€(gè)蛋白的功能不同，因此選擇優(yōu)勢(shì)蛋白進(jìn)行表達(dá)十分重要[16]。P48蛋白具有良好的抗原性，穩(wěn)定性高、特異性強(qiáng)，在支原體的生存中占據(jù)重要地位[17]。本研究將P48全蛋白進(jìn)行可溶性表達(dá)，建立的間接ELISA方法敏感性高，特異性和重復(fù)性好。馬海彬等[18]用表達(dá)的支原體P48截短片段建立了間接ELISA方法，但未進(jìn)行敏感性試驗(yàn)。劉洋等[14]用支原體P28蛋白建立的ELISA方法檢測(cè)16份陽(yáng)性血清，稀釋到1 028倍時(shí)出現(xiàn)陰性結(jié)果。本試驗(yàn)建立的ELISA與基于P28[14]、P81[15]建立的ELISA相比，包被用抗原蛋白更少，被檢血清稀釋倍數(shù)更高，陽(yáng)性血清稀釋到2 540倍時(shí)仍出現(xiàn)陽(yáng)性結(jié)果，敏感性更高。對(duì)影響結(jié)果的各項(xiàng)因素進(jìn)行優(yōu)化，盡量減少試驗(yàn)過(guò)程中抗體的交叉反應(yīng)和非特異吸附[19]，節(jié)約了試劑，降低了試驗(yàn)成本，使反應(yīng)達(dá)到最佳效果。此外，表達(dá)的P48蛋白也可以和牛支原體乳樣相結(jié)合，可用來(lái)檢測(cè)乳樣中牛支原體抗體水平。

綜上，本研究建立的ELISA方法能夠正確區(qū)分牛支原體陰性、陽(yáng)性血清，未與呼吸道常見(jiàn)細(xì)菌、病毒陽(yáng)性血清發(fā)生反應(yīng)，具有良好的特異性。與商品化牛支原體ELISA抗體檢測(cè)試劑盒相比，陽(yáng)性符合率為88.89%，陰性符合率為92.06%，總體符合率為91.11%，說(shuō)明本研究建立了一種符合率好、敏感性高的牛支原體間接ELISA檢測(cè)方法。本方法也可用于乳樣中牛支原體抗體水平的評(píng)估，具有廣闊的應(yīng)用前景，對(duì)牛群的全群檢疫、抗體水平及支原體感染情況的評(píng)估都具有重大意義。