劉敏卓，張小月，張靈芝，曹孟君，葉素芳，吳澤華，張 杰，曾志紅

（長沙學(xué)院生物與化學(xué)工程學(xué)院，湖南長沙 410022）

竹茹（Bambusae Caulisin Taeniam）為禾本科植物淡竹、大頭典竹或青稈竹的莖稈的干燥中間層，具有清熱化痰、除煩止嘔等功效，是衛(wèi)健委公布的藥食同源類物質(zhì)[1]?；瘜W(xué)成分研究表明，竹茹中主要含有黃酮類、五環(huán)三萜類、多糖類等物質(zhì)[2]?，F(xiàn)代藥理研究顯示，竹茹三萜類成分具有良好的降脂、降壓、抗炎、抗腫瘤等活性[2-4]。竹茹多糖具有顯著的免疫調(diào)節(jié)活性[5]。竹茹黃酮具有延緩皮膚細胞衰老的效能，這可能與其具有抗氧化活性有關(guān)[6]。因此，本研究針對于竹茹中黃酮的提取及其抗氧化活性的分析，對其資源的開發(fā)以及高值化應(yīng)用具有重要的經(jīng)濟效益和實際意義。

天然產(chǎn)物中黃酮類成分的提取方法有許多種，較為常見的有回流提取法、超聲波提取法、酶提取法、微波提取法、超臨界流體萃取法等[7-10]。其中纖維素酶提取法是利用纖維素酶將植物細胞壁中的纖維素等成分進行降解，提高胞內(nèi)黃酮類成分的溶出速度，且具有提取條件溫和、提取黃酮的品質(zhì)高等特點[10-11]；超聲波提取法是利用超聲波的振動作用使植物組織結(jié)構(gòu)形成空洞，結(jié)合其具有的熱效應(yīng)能加速胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)的溶出，因而該法具有提取時間短、黃酮得率高的特點[12-13]。超聲-纖維素酶協(xié)同提取法結(jié)合了上述兩種方法的優(yōu)點，已廣泛應(yīng)用于天然產(chǎn)物活性成分的提取[14-16]，但采用超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹總黃酮的研究尚未見報道。

因此本研究以竹茹作為原料，總黃酮得率為評價指標，采用超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹中的總黃酮，通過單因素實驗及響應(yīng)面法優(yōu)選出最佳提取工藝條件，同時利用DPPH 法、ABTS 法和FRAP法評價竹茹總黃酮提取物的體外抗氧化活性，為竹茹的深入開發(fā)利用以及竹茹總黃酮提取物作為天然抗氧化劑在食品領(lǐng)域的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

竹茹 購自千金大藥房（湖南省長沙市天心區(qū)），經(jīng)長沙學(xué)院唐偉卓副教授鑒定為禾本科植物青稈竹Bambusa tuldoidesMunro 莖稈的干燥中間層；蘆丁、VC標準品（純度≥98%）成都埃法生物科技有限公司；纖維素酶（活力≥400 U/mg）Sigma 公司；ABTS、2,4,6-三吡啶基三嗪（TPTZ）、DPPH、硝酸鋁、三氯化鐵、硫酸亞鐵、亞硝酸鈉、氫氧化鈉 分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司。

F-040SD 超聲波清洗機 深圳福洋科技集團有限公司；Agilent Cary 60 型紫外可見分光光度計 安捷倫科技公司；Bioteck Synergy2 酶標儀 美國伯騰儀器有限公司；SN-HH-6 型數(shù)顯恒溫水浴鍋 上海尚儀儀器設(shè)備有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 竹茹總黃酮的提取 將竹茹干燥、粉碎。精密稱取竹茹粉末2.0 g，置于250 mL 錐形瓶中，加入50 mL 60%乙醇溶液（料液比為1:25（g/mL）），在水浴中加熱至60 ℃，用鹽酸、氫氧化鈉調(diào)節(jié)pH 至5，在如下條件下進行提取：纖維素酶添加量5%（酶與物料的質(zhì)量比）、超聲溫度60 ℃、超聲功率240 W、超聲時間30 min，提取完成后在100 ℃下加熱5 min使纖維素酶失活，減壓抽濾，得竹茹提取液，用60%乙醇溶液定容至100 mL，備用。

1.2.2 竹茹總黃酮的含量測定

1.2.2.1 蘆丁標準曲線的繪制 參考Liu 等[17]的方法并稍作修改。準確稱取10 mg 蘆丁對照品，置于50 mL 容量瓶中，加入60%乙醇超聲溶解并定容，搖勻，得到濃度為0.2 mg/mL 的對照品溶液。依次吸取上述標準溶液0、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL 置于10 mL 具塞比色管中，并加入5%亞硝酸鈉0.5 mL，搖勻后靜置7 min；再加入10%硝酸鋁0.5 mL，搖勻后靜置7 min；然后再加入4%氫氧化鈉5 mL，搖勻后用60%乙醇定容至10 mL，靜置15 min。以加0 mL 蘆丁標準液為空白對照，在510 nm 處分別測定各溶液的吸光值。以吸光值A(chǔ) 為縱坐標，蘆丁對照品溶液濃度C（mg/mL）為橫坐標，擬合出標準曲線的回歸方程為A=5.9054C+0.0479（R2=0.9993）。結(jié)果表明蘆丁標準品在0.01～0.06 mg/mL 濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

1.2.2.2 竹茹總黃酮的含量測定 精密吸取3.0 mL竹茹樣液于10 mL 比色管中，按“1.2.2.1”中的方法測定其吸光值，利用標準曲線回歸方程獲得樣品溶液中的總黃酮濃度，并按照公式（1）計算樣品的總黃酮得率。

式中：M 為竹茹樣品的取樣量，mg；N 為稀釋倍數(shù)；V 為提取液定容的最終體積，mL；C 為測試液總黃酮濃度，mg/mL。

1.2.3 單因素實驗 在固定纖維素酶添加量5%、提取溶液pH5、乙醇濃度60%、超聲功率240 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:25（g/mL）、超聲時間30 min的條件下，每個因素設(shè)6 個水平：纖維素酶添加量（1%、3%、5%、7%、9%、11%）、提取溶液pH（3、4、5、6、7、8）、乙醇濃度（40%、50%、60%、70%、80%、90%）、超聲功率（160、200、240、280、320、360 W）、超聲溫度（30、40、50、60、70、80 ℃）、料液比（1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35 g/mL）和超聲時間（20、30、40、50、60、70 min），考察各單因素對竹茹總黃酮得率的影響。

1.2.4 響應(yīng)面優(yōu)化試驗 基于單因素實驗結(jié)果，選擇3 個對竹茹總黃酮得率影響較大的因素：乙醇濃度（A）、提取溶液pH（B）和超聲功率（C）為考察因素，以總黃酮得率為指標，采用Design-Expert 10 軟件設(shè)計響應(yīng)面試驗，優(yōu)化超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹總黃酮的最佳工藝條件。響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計見表1。

表1 響應(yīng)面試驗因素與水平設(shè)計Table 1 Factors and levels of response surface methodology design

1.2.5 竹茹總黃酮體外抗氧化活性分析

1.2.5.1 DPPH 法測定抗氧化活性 參考IryanaIhsanpuro 等[18]的方法并稍作修改。精密吸取100 μL 不同濃度的竹茹總黃酮溶液（10、20、40、80、160、320 μg/mL）和100 μL 0.3 mmol/L DPPH 無水乙醇溶液，置于96 孔板中，搖勻，在37 ℃下避光條件下放置30 min，于517 nm 處測定吸光值；采用VC作為陽性對照。DPPH 自由基清除率按公式（2）計算。

式中，A1為100 μL DPPH 無水乙醇溶液+100 μL樣品液的吸光值；A2為100 μL 無水乙醇溶液+100 μL樣品液的吸光值；A0為100 μL DPPH 無水乙醇溶液+100 μL 無水乙醇溶液的吸光值。

1.2.5.2 ABTS 法測定抗氧化活性 參考Pablo 等[19]的方法并加以修改。精密吸取100 μL 不同濃度的竹茹總黃酮溶液（10、20、40、80、160、320 μg/mL）和100 μL ABTS 工作液，置于96 孔板中，搖勻，在37 ℃下避光條件下放置30 min，于734 nm 處測定吸光值；采用VC作為陽性對照。ABTS+自由基清除率按公式（3）計算。

式中，A1為100 μL ABTS 工作液+100 μL 樣品液的吸光值；A2為100 μL 無水乙醇溶液+100 μL 樣品液的吸光值；A0為100 μL ABTS 工作液+100 μL無水乙醇溶液的吸光值。

1.2.5.3 FRAP 法測定抗氧化能力 參照Wang 等[20]的方法，并稍作修改。將300 mmol/L 的醋酸緩沖液（pH3.6）、10 mmol/L TPTZ 溶液（用40 mmol/L HCl配制）、20 mmol/L 的FeCl3溶液按體積比10:1:1的比例混勻，37 ℃保溫30 min，得FRAP 工作液[9]。精密吸取5 μL 不同濃度的FeSO4·7H2O 溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mmol/L）和150 μL FRAP工作液，置于96 孔板中，搖勻，在37 ℃避光條件下放置30 min，于593 nm 處測定吸光值。以FeSO4·7H2O 溶液濃度C（mmol/L）對吸光值（A）進行線性回歸分析，繪制標準曲線為：A=0.329C+0.3461，R2=0.9997，F(xiàn)eSO4·7H2O 線性范圍為0.1～1.0 mmol/L。

準確配制不同濃度的竹茹總黃酮溶液（0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8、1.0 mg/mL）。實驗組加入5 μL不同濃度樣品和150 μL FRAP 工作液，空白組加入5 μL 無水乙醇與150 μL FRAP 工作液，對照組加入5 μL 不同濃度樣品和150 μL 醋酸緩沖液（pH3.6）。避光放置30 min，于593 nm 處測定吸光值，空白組吸光值為A0，實驗組吸光值為A1，對照組吸光值為A2。然后根據(jù)FeSO4·7H2O 標準曲線，將樣品的實際吸光值（即A1-A2-A0）換算為FeSO4·7H2O 的濃度值（FRAP，mmol/L），F(xiàn)RAP 值越大，表示其抗氧化活性越強。另取VC作為陽性對照，同法測定其總抗氧化能力。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所有實驗均平行進行3 次，實驗數(shù)據(jù)用平均值±標準差表示。采用Design-Expert 10 軟件進行響應(yīng)面試驗設(shè)計；采用Origin 2021、Excel 2021 對數(shù)據(jù)進行分析處理、制圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果

2.1.1 纖維素酶添加量對總黃酮得率的影響 由圖1A可知，纖維素酶添加量為5%時，竹茹總黃酮得率最大，為0.68%±0.01%。當纖維素酶添加量在1%～5%范圍時，隨纖維素酶添加量的增加，竹茹總黃酮的得率呈上升趨勢，這可能是由于隨著纖維素酶含量的增加，其對細胞壁的破壞作用增強，促進了黃酮類物質(zhì)的溶出。當纖維素酶添加量超過5%時，竹茹總黃酮得率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為酶解部分纖維素和過多的酶附著在竹茹顆粒表面，阻塞了黃酮類成分的溶出，導(dǎo)致總黃酮得率下降[21]。因此，選擇最佳纖維素酶添加量為5%。

圖1 纖維素酶添加量（A）、提取溶液pH（B）、乙醇濃度（C）、超聲功率（D）、超聲溫度（E）、料液比（F）和超聲時間（G）對竹茹總黃酮得率的影響Fig.1 Effects of amount of cellulase added (A),pH of extraction solvents (B),ethanol concentration (C),ultrasonic power (D),ultrasonic temperature (E),material-liquid ratio (F) and ultrasonic time (G) on the total flavonoids yield of Bambusae Caulis in Taeniam

2.1.2 提取溶液pH 對總黃酮得率的影響 由圖1B可知，當pH 在3～5 范圍時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)上升趨勢；當pH 大于5 時，總黃酮得率顯著（P<0.05）下降。這可能是因為纖維素酶的最適pH 在5 附近，在最適pH 下，該酶的活力最強。當大于或小于最適pH 時，纖維素酶的活性都會降低，從而導(dǎo)致酶作用于提取竹茹總黃酮的效果受到影響，得率降低[22]。因此，選擇提取溶液pH（4、5、6）三個水平進行響應(yīng)面試驗。

2.1.3 乙醇濃度對總黃酮得率的影響 由圖1C 可知，乙醇濃度為60%時，竹茹總黃酮的得率最高，為0.57%±0.01%。當乙醇濃度在40%～50%范圍時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)緩慢上升趨勢；乙醇濃度在50%～60%范圍時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)顯著（P<0.05）上升趨勢，這可能是因為黃酮類化合物大多為醇溶性成分，在一定范圍內(nèi)，其溶出率隨著醇濃度的增加而提高[23]。當乙醇濃度超過60%時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)下降趨勢，這可能是因為乙醇濃度大于60%時，脂溶性雜質(zhì)溶出增多，另外，乙醇濃度過高會使纖維素酶活性降低，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[24]。因此，選擇乙醇濃度50%、60%、70%三個水平進行響應(yīng)面試驗。

2.1.4 超聲功率對總黃酮得率的影響 由圖1D 可知，超聲功率為240 W 時，竹茹總黃酮得率最高，為0.71%±0.01%。當超聲功率在160～200 W 范圍時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)緩慢上升趨勢；超聲功率在200～240 W 時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)顯著（P<0.05）上升趨勢；當超聲功率超過240 W 時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)下降趨勢。這是因為當超聲功率較低時，產(chǎn)生的機械及空化效應(yīng)對細胞壁的破壞程度較小，故總黃酮得率不高。隨著超聲功率不斷增加，分子運動加劇，細胞壁破碎程度加大，總黃酮得率升高。當超聲功率超過240 W 時，總黃酮得率隨著超聲波功率的增加而減少，是因為超聲波功率大，在強大的機械振動作用下，提取劑的流動加快，導(dǎo)致超聲波的停留時間減少，同時空化作用增強后，將產(chǎn)生大量的無用空化泡，會增加超聲波的散射衰減，同時超聲波功率增大，也會加快黃酮的氧化作用，從而導(dǎo)致總黃酮得率下降[25]。因此，選擇超聲功率200、240、280 W 三個水平進行響應(yīng)面試驗。

2.1.5 超聲溫度對總黃酮得率的影響 由圖1E 可知，超聲溫度為60 ℃時，竹茹總黃酮的得率最高，為0.66%±0.01%。當超聲溫度在30～60 ℃范圍時，竹茹總黃酮的得率隨超聲溫度的升高而增大，這可能是因為溫度升高有利于加快分子運動速度和提高纖維素酶的活性，使黃酮類成分更易于從細胞內(nèi)溶出，從而提高總黃酮得率。當超聲溫度超過60 ℃時，總黃酮的得率隨超聲溫度的升高而下降，這可能是因為溫度超過一定極限后，黃酮類物質(zhì)分子結(jié)構(gòu)易被破壞，且溫度過高會使纖維素酶活力下降，另外，溫度過高時，超聲所產(chǎn)生的氣泡中蒸汽壓增大，氣泡閉合時增強了緩沖作用而使空化作用減弱，從而導(dǎo)致總黃酮得率降低[26]。因此，超聲溫度選擇60 ℃為最佳。

2.1.6 料液比對總黃酮得率的影響 由圖1F 可知，料液比為1:30（g/mL）時，竹茹總黃酮得率最大，為0.75%±0.02%。當料液比在1:10～1:30（g/mL）范圍時，竹茹總黃酮得率隨料液比的增加呈現(xiàn)上升趨勢，當料液比超過1:30（g/mL）時，繼續(xù)提高料液比竹茹總黃酮得率差異不顯著（P>0.05）。原因為料液比過低，原料與提取溶劑接觸不充分，黃酮未被有效溶出；增大料液比，原料被充分浸沒在提取溶劑中，在超聲波作用下黃酮被充分溶出，得率提高；料液比過大時，體系中的可溶性物質(zhì)會與黃酮競爭溶劑，影響黃酮提取，另外，過高的料液比會造成纖維素酶的稀釋，使其活力下降，導(dǎo)致總黃酮得率降低[27]。因此，選擇最佳料液比為1:30（g/mL）。

2.1.7 超聲時間對總黃酮得率的影響 如圖1G 所示，超聲時間在20～30 min 范圍時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)上升趨勢。超聲時間為30 min 時，竹茹總黃酮的得率最高，為0.69%±0.01%。當超聲時間超過30 min 時，竹茹總黃酮的得率呈現(xiàn)緩慢下降趨勢。原因可能是在提取黃酮的最開始階段，溶劑內(nèi)外存在較大的濃度差，因此隨著超聲時間的增加，黃酮會迅速進入提取溶劑中，從而提高黃酮得率；但隨著超聲時間的不斷延長，樣品中其他醇溶性物質(zhì)被浸提出來，導(dǎo)致總黃酮得率有所下降[28]。綜合考慮時間和成本問題，超聲時間選擇30 min 為最佳。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化竹茹總黃酮提取工藝

2.2.1 響應(yīng)面試驗設(shè)計及結(jié)果 由以上幾組單因素實驗結(jié)果可知，乙醇濃度、提取溶液pH 和超聲功率對工藝的影響較大，而料液比、超聲時間、纖維素酶添加量和超聲溫度則可分別固定為1:30（g/mL）、30 min、5%和60 ℃。根據(jù)三因素三水平的原則，將乙醇濃度定為50%、60%、70%；提取溶液pH 定為4、5、6；超聲功率定為200、240、280 W，設(shè)計17 組試驗（表2）。

表2 竹茹總黃酮提取的響應(yīng)面試驗設(shè)計與結(jié)果Table 2 Design and results of response surface methodology of extracting total flavonoids of Bambusae Caulis in Taeniam

2.2.2 方差分析 采用Design-Expert 10 軟件對表2中數(shù)據(jù)進行擬合，得二次多元回歸方程為Y=0.84+3.125×10-3A-9.625×10-3B+1.000×10-3C-2.500×10-3AB-3.750×10-3AC+3.750×10-3BC-0.035A2-0.017B2-0.030C2。方差分析結(jié)果見表3。

表3 回歸模型方差分析Table 3 Variance analysis of regression model

由表3 可知，回歸模型方差分析顯著性檢驗表明，該回歸模型顯著（P<0.001），失擬項不顯著（P=0.9132>0.05），表明該模型具有統(tǒng)計學(xué)意義。模型的決定系數(shù)R2=0.9916，說明該模型擬合度好，相關(guān)性好，調(diào)整決定系數(shù)R2Adj=0.9866，說明該回歸模型能較好地反應(yīng)出因素和因變量的關(guān)系，可信度高，可用于超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取竹茹總黃酮工藝參數(shù)的初步分析和預(yù)測。由表3 中P值可知，其中一次項A、C，交互項AC，二次項A2、B2、C2對竹茹總黃酮得率有極顯著影響（P<0.01）；一次項B 對竹茹總黃酮得率有顯著影響（0.010.05）。由F值可知，各因素對竹茹總黃酮得率的影響的大小順序為超聲功率（C）>乙醇濃度（A）>提取溶液pH（B）。

2.2.3 交互作用分析 乙醇濃度（A）、提取溶液pH（B）和超聲功率（C）兩兩交互作用對竹茹總黃酮得率的影響結(jié)果如圖2 所示。

由圖2 可知，乙醇濃度（A）和超聲功率（C）交互作用的曲面有極大值，坡度較陡峭，說明這一組交互作用對竹茹總黃酮得率的影響顯著，而乙醇濃度（A）與提取溶液pH（B）交互作用、提取溶液pH（B）與超聲功率（C）交互作用的曲面坡度較平緩，說明這兩組交互作用對竹茹總黃酮得率的影響不顯著，這與表3中交互項P值分析結(jié)果一致。

2.2.4 驗證實驗 根據(jù)響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，得到竹茹總黃酮的最佳提取工藝條件為超聲功率239.8 W、乙醇濃度60.54%、提取溶液pH4.72，該條件下竹茹總黃酮的理論得率為0.84%。根據(jù)實際情況，將提取工藝調(diào)整為纖維素酶添加量5%、提取溶液pH4.7、乙醇濃度61%、超聲功率240 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時間30 min，在此條件下進行驗證實驗，得到竹茹總黃酮的得率為0.83%±0.02%，這與理論估計值0.84%非常接近，表明該模型準確可靠，能對試驗進行準確預(yù)測，因此將此提取工藝作為竹茹總黃酮的最優(yōu)提取工藝參數(shù)。此外，利用本研究建立的總黃酮含量測定方法對所得竹茹提取物中的總黃酮含量進行測定，結(jié)果為16.21%±0.42%。

2.3 不同提取方法的比較

根據(jù)課題組前期實驗及“1.2.3”項單因素實驗和“1.2.4”項響應(yīng)面優(yōu)化試驗結(jié)果，設(shè)置回流提取法、超聲波提取法、纖維素酶提取法和超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的工藝參數(shù)，考察不同提取方法對竹茹總黃酮得率的影響，結(jié)果見表4。與超聲波提取法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的竹茹總黃酮得率提高了53.70%，原因可能是使用纖維素酶后，細胞壁上的纖維素有部分降解，甚至有些細胞會破裂，促進了黃酮類成分的釋放，所以總黃酮得率會提高[29]。與纖維素酶提取法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的竹茹總黃酮得率提高了72.92%，原因可能是使用超聲波，可以產(chǎn)生強烈振動、空化效應(yīng)及攪拌作用，促進了黃酮類物質(zhì)的溶出，所以總黃酮得率會提高[29]。與回流提取法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法的竹茹總黃酮得率提高了45.61%，原因可能是使用了纖維素酶和超聲波，兩者都能促進細胞內(nèi)黃酮類物質(zhì)的釋放，所以總黃酮得率會更高，而且超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法還具有提取條件溫和、提取時間短等優(yōu)點[29]。綜上所述，與其他幾種提取方法相比，超聲波處理與纖維素酶協(xié)同提取法更適合于竹茹總黃酮的提取。

表4 不同提取方法對竹茹總黃酮得率的影響Table 4 Effects of different extraction methods on the total flavonoids yield of Bambusae Caulis in Taeniam

2.4 竹茹總黃酮的體外抗氧化活性

2.4.1 清除DPPH 自由基能力 由圖3 可知，在10～320 μg/mL 范圍內(nèi)，竹茹總黃酮提取物清除DPPH自由基的能力弱于同濃度的VC。隨著濃度的增加，兩者對DPPH 自由基的清除作用均增大，在320 μg/mL時竹茹總黃酮提取物對DPPH 自由基的清除率為70.33%±1.21%，低于VC的73.68%±2.25%。另外，在10～320 μg/mL 范圍時，VC及竹茹總黃酮提取物對DPPH 自由基的清除率與其濃度相關(guān)性較好。由回歸方程求得VC和竹茹總黃酮提取物的IC50值分別為123.5 和150.1 μg/mL。以上結(jié)果表明，雖然竹茹總黃酮提取物對DPPH 自由基的清除能力弱于VC，但也具有較強的清除能力，且與濃度具有量效關(guān)系。

圖3 不同濃度梯度竹茹總黃酮提取物和VC 對DPPH 自由基的清除率Fig.3 Scavenging rate of DPPH free radicals by total flavonoids extract from Bambusae Caulis in Taeniam and VC at different concentration gradients

2.4.2 清除ABTS+自由基能力 由圖4 可知，樣品濃度在10～320 μg/mL 范圍時，竹茹總黃酮提取物和VC對ABTS+自由基清除率隨著濃度的增加均逐漸增強，兩者之間的差距也逐漸縮小。當樣品濃度在80～320 μg/mL 范圍時，竹茹總黃酮提取物對ABTS+自由基的清除能力高于VC，濃度達到320 μg/mL時，竹茹總黃酮提取物對ABTS+自由基的清除率為76.97%±1.86%，略高于VC的76.77%±2.14%。另外，在10～320 μg/mL 范圍時，VC及竹茹總黃酮提取物對ABTS+自由基的清除率與其濃度相關(guān)性較好。由回歸方程求得竹茹總黃酮提取物和VC的IC50值分別為44.6 和35.1 μg/mL。以上結(jié)果表明，雖然竹茹總黃酮提取物對ABTS+自由基的清除能力弱于VC，但也具有較強的清除能力，且與濃度具有量效關(guān)系。竹茹中的黃酮類化合物具有抗氧化作用可能是由于其結(jié)構(gòu)上存在羥基，其能夠通過與自由基發(fā)生化學(xué)反應(yīng)，干擾自由基鏈式反應(yīng)發(fā)生，從而產(chǎn)生抗氧化作用[30]。

圖4 不同濃度梯度竹茹總黃酮提取物和VC 對ABTS+自由基的清除率Fig.4 Scavenging rate of ABTS+ free radicals by total flavonoids extract from Bambusae Caulis in Taeniam and VC at different concentration gradients

2.4.3 鐵離子還原能力 在酸性條件下，F(xiàn)e3+-TPTZ可被樣品中抗氧化物質(zhì)還原為Fe2+-TPTZ，并呈現(xiàn)出明顯的藍色，在593 nm 處有強吸收。當體系中的Fe3+-TPTZ 過量時，檢測Fe2+-TPTZ 的生成量可評價樣品的還原能力，即鐵離子還原能力（總抗氧化能力）[31]。鐵離子還原能力以FRAP 值衡量，F(xiàn)RAP 值越大，還原能力越強[31]。由圖5 可知，樣品濃度在0.1～1.0 mg/mL 范圍時，隨著濃度的增加，竹茹總黃酮提取物和VC的FRAP 值均有所提高。當樣品濃度在0.1～0.4 mg/mL 范圍時，竹茹總黃酮提取物的FRAP 值與VC相比，相差不大，當樣品濃度在0.4～1.0 mg/mL 范圍時，竹茹總黃酮提取物的FRAP 值與VC相差較大，且竹茹總黃酮提取物的FRAP 值大于VC，當濃度為1.0 mg/mL 時，竹茹總黃酮提取物的FRAP 值為2.63 mmol/L，高于VC的1.75 mmol/L。以上結(jié)果表明竹茹總黃酮提取物具有良好的鐵離子還原能力，且與濃度具有量效關(guān)系。

圖5 不同濃度梯度竹茹總黃酮提取物和VC 的鐵離子還原能力Fig.5 Ferric reducing ability by total flavonoids extract from Bambusae Caulis in Taeniam and VC at different concentration gradients

3 結(jié)論

本研究采用超聲波處理與纖維素酶協(xié)同法提取竹茹總黃酮，經(jīng)單因素實驗和響應(yīng)面試驗優(yōu)選出竹茹總黃酮的最佳提取工藝條件為：纖維素酶添加量5%、提取溶液pH4.7、乙醇濃度61%、超聲功率240 W、超聲溫度60 ℃、料液比1:30（g/mL）、超聲時間30 min。在此條件下，竹茹總黃酮的得率為0.83%±0.02%，回歸模型的實測值與理論預(yù)測值0.84%接近（<0.03%），表明該模型可靠。該結(jié)果可為今后的相關(guān)研究提供技術(shù)支持和工藝參考，加快竹茹資源的開發(fā)與利用。

體外抗氧化活性研究結(jié)果表明，竹茹總黃酮提取物對DPPH 自由基、ABTS+自由基均具有一定的清除能力，其對DPPH 自由基、ABTS+自由基的IC50值分別為150.1 μg/mL 和44.6 μg/mL，同時還具有較好的鐵離子還原能力（強于VC）。實驗結(jié)果證明了竹茹總黃酮提取物具有較強的抗氧化活性，可為其今后作為天然抗氧化劑應(yīng)用于食品等領(lǐng)域提供數(shù)據(jù)支撐。