曹正鄧淵, 文雙雅, 高志強(qiáng)

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院,湖南長沙 410128)

油菜是我國第一大植物油源,每年可提供約520萬t優(yōu)質(zhì)食用油。冬油菜作為越年生植物,可以使耕地在冬季能更有效地利用起來,增加土地利用效率,使農(nóng)民在農(nóng)閑期也有收入。葉綠素?zé)晒鈪?shù)可反映植物光合作用機(jī)理和光合生理狀況,是作物逆境脅迫研究中的重要指標(biāo),同時作為植物與環(huán)境之間的紐帶,對于研究植物光合作用與環(huán)境之間的關(guān)系具有重要意義[1]。其中,Fv/Fm表示為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)中的最大光量子產(chǎn)量,對于研究作物生理變化和逆境脅迫具有重要意義[2]。胡能兵等利用Fv/Fm在不同脅迫時間和PEG濃度下的變化差異進(jìn)行耐高溫脅迫育種研究[3];Poudyal等為了實現(xiàn)在生長發(fā)育前期對番茄的耐熱性進(jìn)行監(jiān)測,通過Fv/Fm,針對高溫脅迫條件下的耐熱性,對不同基因型番茄進(jìn)行篩選[4];王淦等用Fv/Fm監(jiān)測了木薯在干旱脅迫下受到的影響,結(jié)果表明,品種的抗旱性越強(qiáng),Fv/Fm的下降速度越慢,并且會延后內(nèi)源乙烯含量的上升時間[5]。

在不同的研究中,使用葉綠素?zé)晒鈨x對熒光參數(shù)進(jìn)行測定時,根據(jù)不同標(biāo)準(zhǔn),有5、10、15、20、30 min 等[6-10]。在目前Fv/Fm監(jiān)測手段中,Fm作為光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ)反應(yīng)中心完全關(guān)閉時的熒光產(chǎn)量,通常需要葉片經(jīng)過20 min暗適應(yīng)才可測得[11],監(jiān)測速度較慢,時間成本上升。同時,可監(jiān)測葉綠素?zé)晒鈪?shù)的監(jiān)測儀器造價高昂,很多科研人員難以承擔(dān)。這2個方面的不足大大阻礙了葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm的研究。因此,如何在快速無損且低成本的前提下精確監(jiān)測Fv/Fm是一個亟待解決的科學(xué)問題,具有重要的現(xiàn)實意義。

光譜技術(shù)由于具有無損、快速、精度高等優(yōu)點,目前已被廣泛應(yīng)用于各類作物生理狀態(tài)的監(jiān)測中[12-13]。例如,譚昌偉等通過分析高光譜植被指數(shù)與緊湊型玉米整個生育期的Fv/Fm相關(guān)關(guān)系,建立了相應(yīng)的高光譜監(jiān)測模型,結(jié)果表明,Fv/Fm與所選的植被指數(shù)呈極顯著正相關(guān);其中,基于相關(guān)系數(shù)最高的結(jié)構(gòu)敏感色素指數(shù)(SIPI)所建立的監(jiān)測模型的決定系數(shù)(R2)達(dá)到0.812 6,均方根誤差(RMSE)達(dá)到0.082[14]。Zhang等用植被指數(shù)對不同鹽度海灘的鹽地堿蓬葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的相關(guān)性進(jìn)行了回歸分析,結(jié)果表明,680 nm和935 nm是葉綠素?zé)晒庾蠲舾械母吖庾V波段,其中,植被指數(shù)(R680 nm-R935 nm)/(R680 nm+R935 nm)和(R680 nm/R935 nm)具有較高的相關(guān)系數(shù)和較低的均方根誤差,進(jìn)而對Fo、Fm、Fv/Fm等多種葉綠素?zé)晒鈪?shù)進(jìn)行了預(yù)測[15]。由此可見,利用光譜反射來對Fv/Fm進(jìn)行預(yù)測是可行的,但由于使用植被指數(shù)進(jìn)行預(yù)測模型的構(gòu)建時,其擬合公式固定而導(dǎo)致模型的精度不高,而通過機(jī)器學(xué)習(xí)進(jìn)行預(yù)測模型的構(gòu)建是提升模型精度的一個重要途徑。

基于此,本試驗采集甘藍(lán)型油菜薹期葉片的光譜和葉綠素?zé)晒鈪?shù)Fv/Fm,分別使用Savitzky-Golay卷積平滑(SG)、標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)變換(SNV)和多元散射校正(MSC)組成3種方法對原始光譜進(jìn)行預(yù)處理,然后通過競爭性自適應(yīng)重加權(quán)算法(CARS)挑選特征波段,進(jìn)而建立并對比偏最小二乘回歸(PLSR)、支持向量回歸(SVR)和徑向基神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)(RBFNN)3種預(yù)測模型的精度,甄選出精度最高的建模方法,從而為高光譜快速無損監(jiān)測Fv/Fm提供技術(shù)支撐以及為實時監(jiān)測油菜生理狀況提供方法路線。

1 材料與方法

1.1 試驗設(shè)置及供試材料

試驗全程均在面積為20 hm2的湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)瀏陽教學(xué)科研綜合平臺基地(28°30′N,113°84′E)進(jìn)行,試驗時間為2021年9月至2022年5月。供試材料為湘雜油787,為湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院油菜育種團(tuán)隊選育的甘藍(lán)型中熟雜交油菜品種,是湖南省主推的種植品種。播種時間為2021年9月29日,收獲時間為2022年5月6日。播種方式采用直播,播種時統(tǒng)一施用復(fù)合肥(氮磷鉀有效營養(yǎng)配比為 18 ∶ 12 ∶ 10),主區(qū)因素P為播種量,設(shè)3個水平,分別為高密(P1:4.608 kg/hm2)、中密(P2:3.456 kg/hm2)和低密(P3:2.304 kg/hm2);裂區(qū)因素B為施肥量,設(shè)3個水平,依次為低肥(B1:300 kg/hm2)、中肥(B2:600 kg/hm2)和高肥(B3:900 kg/hm2)。一共設(shè)置9個處理,進(jìn)行4次重復(fù),共計36個小區(qū),各小區(qū)的面積為258 m2(86 m×3 m),每小區(qū)施硼砂16.5 kg/hm2。

1.2 數(shù)據(jù)采集

本研究在2022年2月26日對油菜葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)、葉片反射率數(shù)據(jù)進(jìn)行采集。在樣本小區(qū)中心位置各選取3株具有代表性的冬油菜植株,選取1張完全展開的綠色葉片,分別測量其光譜反射率和葉綠素?zé)晒鈪?shù)。用美國ASD-FieldSpec 3地物波譜儀完成葉片光譜反射率的采集,選用的光譜范圍為350～2 500 nm,光譜分辨率為3nm @ 350～1 000 nm、10 nm @ 1 000～2 500 nm。首次使用需預(yù)熱15 min,測試每個樣品前都進(jìn)行白板定標(biāo)。每個樣品重復(fù)測量5次,將5次數(shù)據(jù)進(jìn)行平均后得出的平均反射率作為該樣品的實際光譜反射率。一共采集540條原始光譜數(shù)據(jù),平均后得到108條實際光譜反射率。

葉綠素?zé)晒鈪?shù)的收集采用捷克PSI-FluorPen-FP110手持式葉綠素?zé)晒鈨x。每張葉提前進(jìn)行20 min暗適應(yīng),儀器夾在葉片上進(jìn)行測量,要確保地物波譜儀和葉綠素?zé)晒鈨x所測量的為同一葉片位置,且葉綠素?zé)晒鈪?shù)與葉片光譜反射率的獲取時間間隔不超過10 min;然后使用FlourPen導(dǎo)出所測得的初始熒光Fo和最大熒光產(chǎn)量Fm參數(shù)值,進(jìn)而通過計算得到108條Fv/Fm。Fv/Fm的數(shù)學(xué)公式如下:

Fv/Fm=(Fm-Fo)/Fm。

(1)

1.3 數(shù)據(jù)分析方法

由于高光譜數(shù)據(jù)存在嚴(yán)重的共線性和冗余干擾信息,因而需要在全波段的基礎(chǔ)上進(jìn)行光譜預(yù)處理和特征波段提取[16-17]。本試驗所有計算均通過Matlab 2018a編輯代碼完成,繪圖均使用Origin 2021。使用SG平滑進(jìn)行第1次預(yù)處理。SG平滑是在移動平滑的基礎(chǔ)上進(jìn)行改進(jìn),其原理為:假設(shè)存在一個擬合點xk,在xk的左右兩側(cè)各自選取m個數(shù)據(jù)點,將選取的2m+1個數(shù)據(jù)點進(jìn)行多項式擬合,當(dāng)數(shù)據(jù)點的實際值與擬合值差值的平方和最小時完成擬合,完成后將xk進(jìn)行平移,重復(fù)相同的計算,使整條曲線最終趨于平滑[18-20]。然而在葉片光譜的采集過程中,由于所采集葉片上顆粒不同或者光的散射水平不同,導(dǎo)致所采集光譜信息中出現(xiàn)大量冗余甚至錯誤的信息,因此需要對原始光譜信息進(jìn)行散射校正。MSC通過計算得出的平均光譜作為“理想光譜”,通過一元線性回歸,將原始光譜向著“理想光譜”平移、靠攏,從而提升光譜信息的準(zhǔn)確性。而SNV則是對每條光譜曲線完成標(biāo)準(zhǔn)正態(tài)化,從而修正散射帶來的誤差。SNV與MSC主要是算法上的差異,而二者共同的優(yōu)勢都是不會改變光譜曲線的趨勢即樣品對光譜的吸收信息,保存了原始信息的完整性。本研究分別使用SG平滑、SNV和MSC進(jìn)行光譜的預(yù)處理,使用競爭自適應(yīng)重加權(quán)采樣法(CARS)對波段中的特征波長進(jìn)行提取,該算法是將蒙特卡洛采樣與PLSR模型回歸系數(shù)相結(jié)合的特征變量篩選方法。篩選特征波長后通過Kennard-Stone(KS)算法劃分訓(xùn)練集和測試集,通過PLSR、SVR和RBFNN 3種不同算法進(jìn)行模型構(gòu)建,采用R2、RMSE和相對分析誤差(RPD)3個參數(shù)對模型精度進(jìn)行評估。R2的取值范圍為0～1,數(shù)值越接近1且RMSE越小,說明預(yù)測模型的精度越高。而RPD通過判斷預(yù)測值與實測值之間的偏離情況,對模型的預(yù)測能力進(jìn)行說明,若RPD≤1.5,模型無法對樣本進(jìn)行預(yù)測;若1.5

(2)

(3)

(4)

2 結(jié)果與分析

2.1 Fv/Fm與原始光譜曲線分析

本試驗的108條Fv/Fm數(shù)據(jù)經(jīng)過整理后的結(jié)果如表1所示。以0.05為差值,將Fv/Fm分為 0.65≤Fv/Fm<0.7、0.7≤Fv/Fm<0.75、0.75≤Fv/Fm<0.80、0.80≤Fv/Fm<0.85這4個區(qū)間,并挑選出每個區(qū)間所對應(yīng)的原始光譜數(shù)據(jù)計算該區(qū)間平均光譜曲線,結(jié)果如圖1所示。由圖1可知,4個區(qū)間的原始光譜曲線趨勢基本一致,皆在550 nm附近出現(xiàn)反射峰,在680 nm附近出現(xiàn)吸收谷,但在 580～680 nm附近,4條曲線出現(xiàn)一定程度的差異,反映了Fv/Fm越高、光譜反射率越低的規(guī)律。這可能主要是葉綠素?zé)晒夤庾V范圍為640～800 nm的葉綠素?zé)晒鈪?shù)更為敏感[23];同時,由于Fv/Fm與相同環(huán)境下光合速率存在正相關(guān)關(guān)系[24],Fv/Fm值高的樣本,對光能的吸收率越大,對太陽輻射的反射越少,從而導(dǎo)致在葉綠素吸收波范圍內(nèi)原始光譜曲線反射率相比Fv/Fm值低的樣本更低。

表1 光系統(tǒng)Ⅱ最大光化學(xué)產(chǎn)量Fv/Fm

2.2 光譜預(yù)處理及基于CARS算法的特征波段篩選

本試驗在SG平滑的基礎(chǔ)上各使用SNV和MSC進(jìn)行散射校正,即使用SG、SG-SNV和SG-MSC 3種預(yù)處理方法對獲取的原始光譜數(shù)據(jù)進(jìn)行預(yù)處理,3種預(yù)處理方法中SG的多項式階數(shù)均設(shè)置為2,平滑窗口大小設(shè)置為11,結(jié)果如圖2所示。圖2-c和圖2-d相比圖2-a對光譜曲線的散射差異有明顯優(yōu)化,同一波段下不同樣本的反射率差異變小。由于SG僅完成對譜線的平滑,因此相對于原始光譜無明顯變化。

在完成對原始數(shù)據(jù)的平滑和散射校正后,使用CARS對處理后的3組光譜進(jìn)行特征波段的選取,CARS中主成分?jǐn)?shù)設(shè)置為25,交互驗證次數(shù)為5,篩選波長數(shù)為50。由圖3可知,SG、SG-SNV、SG-MSC 3種預(yù)處理方法分別在400～1 000 nm范圍內(nèi)篩選出10、24、20個特征波段。圖3-a中,10個特征點均在可見光范圍(400～780 nm)內(nèi),且主要集中在400～450 nm。圖3-b中,特征點主要集中在400～450 nm和550～650 nm,在該范圍內(nèi)存在多個影響植物光合作用的葉綠素a、葉綠素b和類胡蘿卜素等光合色素的吸收峰[25]。圖3-c中,特征點主要集中在400～500 nm和950～1 000 nm,有1個特征點位于747 nm處,而葉綠素?zé)晒夤庾V在 690 nm 和740 nm附近存在2個波峰[23]。

2.3 模型的構(gòu)建與分析

將上述3種預(yù)處理方法通過CARS算法篩選出的10、24、20個特征點分別作為自變量x輸入,使用PLSR、SVR和RBFNN構(gòu)建Fv/Fm預(yù)測模型,結(jié)果如表2所示。

表2 不同算法下的模型結(jié)果

由表2可知,在3種預(yù)處理方法下,SG-SNV和SG-MSC相較于SG,模型精度有較大提升;在SG-SNV和SG-MSC中,SVR和RBFNN 2種基于機(jī)器學(xué)習(xí)構(gòu)建的模型,從精度上相比于PLSR也有較大提升,這主要是因為機(jī)器學(xué)習(xí)的非線性擬合能力相對更強(qiáng)[26]。其中,RBFNN的建模精度略大于SVR,效果最優(yōu)為SG-SNV中的RBFNN,訓(xùn)練集R2為0.928 8,RMSE為0.008 8;測試集R2為0.907 2,RMSE為0.011 5,RPD為3.417 6,模型對樣本的預(yù)測能力極好。將該模型得出真實值與預(yù)測值進(jìn)行擬合,結(jié)果如圖4所示。由此表明,本試驗所使用的預(yù)處理方法可以有效去除光譜數(shù)據(jù)中的噪聲,且利用RBFNN模型對Fv/Fm有較好的預(yù)測效果。

3 討論與結(jié)論

本研究結(jié)果表明,基于機(jī)器學(xué)習(xí)所構(gòu)建的模型相比PLSR模型有顯著效果。在李斌等的研究中,以SNV-CARS-SPA-SVR建立的Fv/Fm預(yù)測模型精度最高,其測試集R2為0.911 7,RMSE為0.010 8[27],也證明了機(jī)器學(xué)習(xí)能有效提高模型對Fv/Fm的預(yù)測能力。

RBFNN作為機(jī)器學(xué)習(xí)算法中的一種,是一種性能優(yōu)良的前饋性神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),具備優(yōu)秀的自學(xué)能力,對非線性問題有較強(qiáng)的映射能力,在農(nóng)業(yè)領(lǐng)域獲得廣泛應(yīng)用。劉占宇等用主成分分析將一階微分光譜壓縮,把得到的主分量光譜輸入RBFNN,對病害嚴(yán)重度進(jìn)行預(yù)測,得出的RMSE為7.73%,結(jié)果證明可以對胡麻斑病導(dǎo)致的水稻病害程度進(jìn)行快速準(zhǔn)確的預(yù)測[28]。馮旭萍等在鑒定CRISPR/Cas9誘導(dǎo)水稻突變體的研究中,通過二階導(dǎo)數(shù)對特征波長進(jìn)行提取,輸入RBFNN模型,其建模集和驗證集的分別達(dá)到了92.25%和89.5%,表明使用高光譜成像技術(shù)結(jié)合化學(xué)計量學(xué)方法,鑒別水稻CRISPR/Cas9突變體是可行的,為快速準(zhǔn)確地鑒定水稻育種中大量突變體提供了理論基礎(chǔ)[29]。

本研究基于高光譜技術(shù),僅對薹期甘藍(lán)型油菜葉片F(xiàn)v/Fm進(jìn)行預(yù)測,在后續(xù)的試驗中應(yīng)對油菜全生育期進(jìn)行預(yù)測并對比,篩選出用于Fv/Fm預(yù)測的最佳時期。張永江等報道玉米同一葉片中不同部位Fm、Fv/Fm的參數(shù)值有顯著差異[30]。因此,甘藍(lán)型油菜葉片不同位置Fv/Fm差異性,應(yīng)加入到未來的研究方向中。同時模型的普適性還需要進(jìn)行驗證,需進(jìn)一步完成對模型的優(yōu)化,探索可用于Fv/Fm預(yù)測的最佳模型,為甘藍(lán)型油菜實時監(jiān)測提供更有力的技術(shù)。

本研究以甘藍(lán)型油菜薹期植株作為材料,采集葉片光譜與對應(yīng)的葉片F(xiàn)v/Fm,通過SG、SG-SNV和SG-MSC 3種方法完成對原始光譜的預(yù)處理,結(jié)果表明,SG-SNV和SG-MSC 2種方法對原始光譜曲線有明顯優(yōu)化。運用CARS算法完成特征波長的選取,基于3種預(yù)處理方法,分別篩選出10、24、20個特征點,進(jìn)而將所篩選的特征波長作為自變量x,輸入完成PLSR、SVR和RBFNN 3種預(yù)測模型的構(gòu)建。本研究結(jié)果表明,在上述3種構(gòu)建的模型中,SG-SNV-RBFNN的精度最高,該方式下建立的預(yù)測模型訓(xùn)練集R2為0.928 8,RMSE為0.008 8,測試集R2為0.907 2,RMSE為0.011 5,RPD為3.417 6。