王冠萱, 陳萌萌, 仇汝龍, 范志宇, 胡 波, 宋艷華, 魏后軍, 葛 雷, 徐為中, 王 芳, 錢(qián)鶯娟

(1.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院獸醫(yī)研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部獸用生物制品工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210014;2.南京農(nóng)業(yè)大學(xué)動(dòng)物醫(yī)學(xué)院/教育部動(dòng)物健康與食品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部動(dòng)物細(xì)菌學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江蘇南京 210095)

兔出血癥(rabbit hemorrhagic disease,RHD)是一種急性、烈性、高度接觸性傳染病[1-4],由兔出血癥病毒(rabbit hemorrhagic disease virus,RHDV)引起。于1984年首次在中國(guó)發(fā)現(xiàn)[2],并迅速傳播至歐洲、澳大利亞、非洲等地[3,5-6],該疾病死亡率高達(dá)90%,嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展[3]。2010年,一種新的RHDV毒株在法國(guó)被發(fā)現(xiàn),不同于經(jīng)典RHDV毒株的血清型,被命名為RHDV2[7]。目前,RHDV2在歐洲、亞洲、非洲、澳大利亞、北美等地廣泛流行[5,8],并逐漸取代經(jīng)典RHDV和RHDVa成為當(dāng)?shù)氐膬?yōu)勢(shì)毒株[8-9]。我國(guó)于2020年出現(xiàn)由RHDV2毒株引起的RHD暴發(fā)[10],由于目前使用的針對(duì)經(jīng)典RHDV毒株制備的疫苗對(duì)RHDV2的交叉保護(hù)效果有限[11-12],導(dǎo)致RHDV2在國(guó)內(nèi)迅速流行,國(guó)內(nèi)呈現(xiàn)經(jīng)典RHDV和RHDV2這2種基因型共同流行的情況。

RHDV是杯狀病毒科(Calicivirus)[13]兔病毒屬(Lagovirus)成員,目前引起RHD的RHDV有GI.1和GI.2這2個(gè)基因型。截至2010年,經(jīng)典RHDV分離株屬于GI.1基因型。 2010年,在歐洲發(fā)現(xiàn)了一種新的變異RHDV,該毒株在系統(tǒng)發(fā)育和抗原方面與GI.1基因型不同,被命名為RHDV2或RHDVb,屬于GI.2基因型[7,14]。RHDV為單股正鏈RNA病毒[1],基因組全長(zhǎng)為7437個(gè)核苷酸,衣殼由單個(gè)結(jié)構(gòu)蛋白VP60構(gòu)建[15],包含有2個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORF)[16]。

感染RHDV1和RHDV2的家兔臨床癥狀相似,均會(huì)出現(xiàn)死亡、厭食、發(fā)熱等癥狀,剖檢可見(jiàn)肝臟出血、壞死,脾腫大,全身彌漫性血管內(nèi)凝血(DIC)[3,17-18]等,所以僅靠臨床癥狀無(wú)法準(zhǔn)確區(qū)分,需要依靠分子生物學(xué)診斷技術(shù)進(jìn)行鑒別[19]。TaqMan RT-qPCR技術(shù)與普通RT-PCR相比,具有污染少、定量準(zhǔn)確、實(shí)時(shí)檢測(cè)、敏感性高等優(yōu)點(diǎn)[20-21],而且可以在同一個(gè)反應(yīng)管中同時(shí)檢測(cè)多種基因,大大提高了反應(yīng)效率[21]。因此本研究采用TaqMan RT-qPCR 技術(shù)建立一種可以在同一個(gè)反應(yīng)管中鑒別RHDV1和RHDV2型病原的方法,以便于臨床和實(shí)際生產(chǎn)中兔出血癥的快速診斷和防控。

1 材料與方法

1.1 病毒株與樣品

兔出血癥病毒1型(RHDV1)、兔出血癥病毒2型(RHDV2)、輪狀病毒(Rotavirus,RV)、兔支氣管敗血波氏菌、兔多殺性巴氏桿菌、綠膿桿菌、沙門(mén)氏菌cDNA由筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存。臨床待檢樣品來(lái)自2021年12月之后山東、福建等地養(yǎng)兔場(chǎng)送檢的疑似RHDV感染兔肝臟及筆者所在實(shí)驗(yàn)室模擬動(dòng)物試驗(yàn)中獲取的鼻肛拭子。

1.2 試劑與儀器

RNAiso Plus(病毒RNA提取試劑)從TaKaRa公司購(gòu)買(mǎi),HiScriptⅡ Q RT SuperMix for qPCR (+gDNA wiper)(反轉(zhuǎn)錄試劑)、AceQ qPCR Probe Master Mix(TaqMan熒光定量試劑盒)均從諾唯贊生物有限公司購(gòu)入;凝膠成像儀從上海天能(Tanon)科技有限公司購(gòu)入。 電泳儀購(gòu)自(Bio- Rad)公司。QuantStudio 1 熒光定量 PCR 儀從美國(guó)Applied Biosystems公司購(gòu)入。PCR 儀從艾本德(Eppendorf)中國(guó)有限公司購(gòu)入。

1.3 引物和探針

根據(jù)GenBank中的RHDV1分離株WF 2007(登錄號(hào):FJ794180)和RHDV2分離株SC 2020/04(登錄號(hào):MT383749)的基因序列,利用Primer Express3.0.1軟件針對(duì)保守VP60基因序列設(shè)計(jì)2組特異性引物和TaqMan探針(表1)。引物和探針由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

表1 RHDV1型和RHDV2型TaqMan qPCR 特異性引物與TaqMan探針

1.4 標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒的構(gòu)建

采用RHDV1分離株WF2007、RHDV2分離株SC 2020/04的VP60基因全長(zhǎng)引物克隆目的基因,將獲得的基因序列連接到pMD18-T載體上,將篩選驗(yàn)證成功的pMD18-T-WF2007-VP60、pMD18-T-SC2020-VP60質(zhì)粒送去生物公司進(jìn)行測(cè)序,將測(cè)序結(jié)果進(jìn)行比對(duì)符合預(yù)期結(jié)果。測(cè)定重組質(zhì)粒濃度并計(jì)算拷貝數(shù),用ddH2O稀釋為1×1010copies/μL,作為模板標(biāo)準(zhǔn)品。

1.5 雙重 TaqMan qPCR體系和反應(yīng)條件的優(yōu)化

以“1.4”節(jié)中質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板,按照TaqMan熒光定量試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行擴(kuò)增,總反應(yīng)體系為 20 μL。對(duì)退火溫度(55～65 ℃)、引物濃度(0.1～1 μL)、探針濃度(0.1～1 μL)進(jìn)行優(yōu)化,確定最佳反應(yīng)體系和條件。

1.6 雙重 TaqMan qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將“1.4”節(jié)中稀釋后的2種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品1 ∶ 1混合后進(jìn)行10倍倍比稀釋,選擇1×108～1×104copies/μL 5個(gè)梯度質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品作為陽(yáng)性模板進(jìn)行擴(kuò)增。根據(jù)熒光定量 PCR 儀自帶軟件 Quant StudioTMDesign &Analysis Software 自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.7 特異性試驗(yàn)

以兔多殺性巴氏桿菌、兔支氣管敗血波氏菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒(RV)的基因組DNA為模板,以雙蒸水為陰性對(duì)照,以構(gòu)建的RHDV1型和RHDV2型標(biāo)準(zhǔn)品質(zhì)粒1 ∶ 1混合后作為陽(yáng)性對(duì)照模板,進(jìn)行熒光定量PCR特異性檢測(cè)。

1.8 敏感性試驗(yàn)

以1×108copies/μL作為2種質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的起始濃度,進(jìn)行10倍倍比稀釋,使用1×108～1×101copies/μL 的混合質(zhì)粒作為反應(yīng)模板,以ddH2O為陰性對(duì)照模板,進(jìn)行TaqMan RT-qPCR和普通RT-PCR擴(kuò)增,檢測(cè)其敏感性。

1.9 重復(fù)性試驗(yàn)

以1×106～1×104copies/μL的混合質(zhì)粒為模板進(jìn)行TaqMan RT-qPCR擴(kuò)增,分別進(jìn)行組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn),整理CT值并計(jì)算變異系數(shù),評(píng)價(jià)其重復(fù)性。

1.10 臨床樣本的檢測(cè)

使用本研究建立的TaqMan雙重?zé)晒舛?RT-PCR 方法和普通RT-PCR方法對(duì)2021年12月之后收到的來(lái)自山東、福建等地的疑似RHDV感染的家兔肝臟樣品、鼻肛拭子以及以及筆者所在實(shí)驗(yàn)室模擬動(dòng)物實(shí)驗(yàn)的樣本進(jìn)行檢測(cè),比較本研究建立的方法與常規(guī) RT-PCR 方法的檢出率。

2 結(jié)果與分析

2.1 雙重 TaqMan qPCR 反應(yīng)體系及參數(shù)優(yōu)化

優(yōu)化后的20 μL反應(yīng)體系:2×AceQ qPCR Probe Master Mix10 μL,1型上下游引物各0.4 μL(10 μmol/L),2型上下游引物各0.2 μL(10 μmol/L),RHDV-1-Probe 0.2 μL(10 μmol/L),RHDV-2-Probe 0.2 μL(10 μmol/L),50×ROX ReferenceⅠ 0.4 μL,質(zhì)粒cDNA模板2 μL,dd2O 6 μL。反應(yīng)程序:95.0 ℃預(yù)變性5 min;95.0 ℃10 s,60 ℃ 30 s,40個(gè)循環(huán)。

2.2 雙重 TaqMan qPCR 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將10倍倍比稀釋的1×108～1×104copies/μL混合質(zhì)粒按照優(yōu)化后的反應(yīng)體系和參數(shù)進(jìn)行擴(kuò)增,軟件自動(dòng)生成標(biāo)準(zhǔn)曲線(圖1):RHDV1型標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)r2=0.999,標(biāo)準(zhǔn)方程為y= -3.347x+14.764,目的基因的擴(kuò)增效率為98.952%;RHDV2型標(biāo)準(zhǔn)曲線決定系數(shù)r2=0.999,標(biāo)準(zhǔn)方程為y= -3.331x+9.833,目的基因的擴(kuò)增效率為99.615%。結(jié)果顯示,本研究建立的兔出血癥病毒1、2型TaqMan雙重?zé)晒舛?PCR 方法有良好的線性關(guān)系。

2.3 雙重 TaqMan qPCR 的特異性試驗(yàn)

用“1.5”節(jié)優(yōu)化好的體系及參數(shù)對(duì)兔支氣管敗血波氏菌、兔多殺性巴氏桿菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒(RV)進(jìn)行檢測(cè),同時(shí)設(shè)置陰陽(yáng)性對(duì)照,結(jié)果(圖2)顯示,除RHDV1型、RHDV2型產(chǎn)生特異性的擴(kuò)增曲線外,其他病原體及雙蒸水均不產(chǎn)生擴(kuò)增曲線,說(shuō)明該方法具有良好的特異性。

2.4 雙重 TaqMan qPCR 的敏感性試驗(yàn)

選取稀釋度為1×108～1×101copies/μL的質(zhì)粒作為模板進(jìn)行TaqMan RT-qPCR和常規(guī)RT-PCR擴(kuò)增。RT-qPCR擴(kuò)增結(jié)果顯示,該方法的敏感性可達(dá)到100～1 000 copies/μL;普通RT-PCR結(jié)果顯示,當(dāng)質(zhì)粒pMD-18T-WF濃度在1×104copies/ μL、pMD-18T-SC濃度在1×103copies/μL 時(shí)有模糊的目的條帶出現(xiàn)。由此可見(jiàn),TaqMan qPCR 的靈敏度約為常規(guī)PCR的10～100倍(圖3)。

2.5 雙重 TaqMan qPCR 的重復(fù)性檢測(cè)

2種重組質(zhì)粒分別選取106、105、104這3 個(gè)稀釋度,每個(gè)稀釋度重復(fù)3次,進(jìn)行重復(fù)性試驗(yàn)。并根據(jù)熒光定量PCR 得到的CT值,計(jì)算結(jié)果見(jiàn)表2。結(jié)果顯示,組內(nèi)和組間的重復(fù)試驗(yàn)變異系數(shù)在0.01%～1.61%之間,說(shuō)明該雙重?zé)晒舛縋CR方法重復(fù)性良好。

表2 雙重 TaqMan qPCR 的重復(fù)性試驗(yàn)

2.6 臨床樣本檢測(cè)

利用已經(jīng)建立的TaqMan RT-qPCR和常規(guī) RT-PCR 方法分別對(duì)來(lái)自全國(guó)不同兔場(chǎng)疑似RHDV感染的49份臨床樣品以及筆者所在實(shí)驗(yàn)室保存的42份鼻肛拭子進(jìn)行檢測(cè)。TaqMan RT-qPCR方法檢測(cè)49份臨床肝臟樣品,檢出14份RHDV1型,19份RHDV2型,2份RHDV1、2型混合感染;檢測(cè)42份鼻肛拭子樣品,檢出3份RHDV1型,19份RHDV2型;用常規(guī)RT-PCR方法檢出12份RHDV1型,15份RHDV2型;鼻肛拭子中檢出0份RHDV1型,10份RHDV2型(表3)。 結(jié)果顯示,本試驗(yàn)建立的雙重?zé)晒舛縋CR方法的敏感性顯著高于普通RT-PCR。

表3 臨床樣品的檢測(cè)結(jié)果

3 討論

2020年至今,RHDV2型已在我國(guó)發(fā)生了廣泛的流行,相比于RHDV1型,RHDV2型不僅感染成年家兔,還可以感染幼年家兔和野兔[12],嚴(yán)重危害養(yǎng)兔業(yè)的發(fā)展和自然生態(tài)環(huán)境。目前,我國(guó)已有建立的單獨(dú)檢測(cè)RHDV1型的診斷方法,如RT-PCR方法[22]、ELISA方法[23]等,但均無(wú)法應(yīng)用于RHDV2型的檢測(cè)。筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立了單獨(dú)檢測(cè)RHDV2型的TaqMan qPCR方法[19],但是無(wú)法同時(shí)檢測(cè)2種不同血清型的RHDV,不利于疫病的檢測(cè)和診斷。因此,建立一種可以同時(shí)檢測(cè)RHDV1型和RHDV2型的方法來(lái)應(yīng)對(duì)RHD的診斷和防控十分必要。

應(yīng)用軟件Primer Express 3.0分別針對(duì)RHDV1型和RHDV2型保守的VP60序列設(shè)計(jì)引物和探針,篩選出最合適的引物和探針,并優(yōu)化反應(yīng)條件和反應(yīng)體系,成功建立了雙重TaqMan RT-qPCR方法。繪制RHDV1型和RHDV2型標(biāo)準(zhǔn)曲線,決定系數(shù)r2均為0.999,可見(jiàn)線性關(guān)系良好;使用該TaqMan RT-qPCR 方法檢測(cè)RHDV1型、RHDV2型時(shí),與兔多殺性巴氏桿菌、兔支氣管敗血波氏菌、沙門(mén)氏菌、綠膿桿菌、輪狀病毒均無(wú)交叉反應(yīng),說(shuō)明該方法特異性良好;該方法對(duì)RHDV1型、RHDV2型的靈敏度可以達(dá)到1 μL 100～1 000拷貝數(shù),比筆者所在實(shí)驗(yàn)室建立的鑒別經(jīng)典 RHDV 與 RHDV2的普通 RT-PCR 方法[24]靈敏10～100倍;重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果表明,組內(nèi)和組間重復(fù)性試驗(yàn)CV值在0.01%～1.61%之間,說(shuō)明該方法有良好的重復(fù)性。

綜上,本試驗(yàn)建立的TaqMan雙重 RT-qPCR方法可以在同一個(gè)反應(yīng)管中檢測(cè)RHDV1型和RHDV2型,具有特異性好、敏感性高的優(yōu)點(diǎn),可以很大程度上提高臨床檢測(cè)效率,有助于實(shí)際生產(chǎn)中對(duì)RHD的診斷和防控,為開(kāi)發(fā)快速診斷試劑盒奠定了基礎(chǔ)。