聶珂楠，范玉文，王玉麗，李婷，黃家鈺，吳正奇

湖北工業(yè)大學(xué)生物工程與食品學(xué)院（武漢 430068）

茶被公認為三大最廣飲用的飲料之一，僅次于飲用水[1]。茶葉的有效成分對人體有一定的幫助，茶葉不僅有敗火明目、刮油去脂、抗菌、醒酒、抗衰老、提神醒腦、美容護膚等功效[2]，而且對一些疾病如癌癥、高血壓以及心腦血管疾病有一定的藥效[3-5]。綠茶主要含茶多酚[6-7]、咖啡因[8-9]、茶多糖[10]和茶氨酸[11]等營養(yǎng)和功能性成分?？Х纫颍╟affeine，CAF）是一種中樞神經(jīng)興奮劑[12]，茶葉中咖啡因的含量在2%～5%之間[13]?？Х纫蜻^多的攝入，會對人體造成一定的傷害[14]，例如產(chǎn)生焦慮癥[15]、睡眠失調(diào)、血壓升高[16]等；孕婦飲用含有咖啡因飲料會對胎兒產(chǎn)生一定的影響[17]；老年人喝含咖啡因的飲料會導(dǎo)致心律不齊、誘發(fā)骨質(zhì)疏松[18]等一系列疾病。茶多酚（Tea Polyphenols，TPP）是茶葉中全部酚類物質(zhì)的統(tǒng)稱，是茶葉最主要的營養(yǎng)、保健和藥理成分，其代表性物質(zhì)和化合物為表沒食子兒茶素沒食子酸酯（Epigallocatechin gallate，EGCG）。茶多酚具有防止動脈硬化、防止一些呼吸道疾病、抗病毒、抗菌[19]、調(diào)節(jié)腸道菌群[20]、減少皮膚皮脂的產(chǎn)生和治療尋常痤瘡[21]等多種生理活性和保健功能。據(jù)統(tǒng)計，2021年綠茶的消費量約為200萬 t，還有80萬 t過剩。綠茶與其他茶種相比保質(zhì)期相對較短，一般為六個月至一年。因此為了充分利用綠茶資源和減少綠茶資源的浪費，對綠茶進行深加工和研究出低咖啡因或者無咖啡因的綠茶深加工品，具有較好的發(fā)展前景和現(xiàn)實意義。

茶多酚因有多個酚羥基而具有酸性，堿性的咖啡因與酸性的茶多酚形成復(fù)鹽式的咖啡因-茶多酚復(fù)合物，這是茶乳酪形成的原因之一。在常溫下，復(fù)鹽式的咖啡因-茶多酚復(fù)合物的水溶性較小，而且溶解度隨溫度的下降而急劇降低。在堿性條件下，咖啡因失去了與茶多酚結(jié)合的能力，成為游離形式而呈現(xiàn)咖啡因的固有分子結(jié)構(gòu)，易溶于乙醇；由于酚羥基的離解，在堿性條件下茶多酚轉(zhuǎn)化為溶于水但難溶于乙醇的茶多酚鈉鹽，同時，氧氣在乙醇中的溶解度遠比水中小，乙醇能防止茶多酚鈉鹽的氧化。因此，采用乙醇為溶劑，氫氧化鈉調(diào)節(jié)堿性，以達到溶解和提取出茶葉中的咖啡因，實現(xiàn)咖啡因與茶多酚分離的目的。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

綠茶，市購。

色譜級乙酸（上海麥克林生化科技有限公司）；色譜級甲醇、色譜級乙腈、乙醇、氫氧化鈉（國藥集團化學(xué)試劑有限公司）；咖啡因（CAF）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）：杭州生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

ME 104 E/02電子天平（上海梅特勒-托利多儀器有限公司）；DK-S 22電熱恒溫水浴鍋（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；RJ-TGL-16G臺式離心機（無錫市瑞江分析儀器有限公司）；84-1 A磁力攪拌器（上海司樂儀器有限公司）；1-5 mL大龍移液槍（大龍新創(chuàng)實驗儀器有限公司）；Uitimate 3 000高效液相色譜儀（美國Thermo Fisher Scientific公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 咖啡因和EGCG標準曲線的制定

標準溶液的制備：準確稱取一定量的咖啡因（CAF）、表沒食子兒茶素沒食子酸酯（EGCG）標準品，定容至2 000 μg/mL，分別吸取0.5，1，2.5和5 mL母液，加水定容至10 mL，質(zhì)量濃度分別為100，200，500，1 000和2 000 μg/mL，混勻離心，過0.22 μm濾膜，待測。

測定方法：C18柱（5 μm，4.6 nm×250 mm），流動相：A相為2%乙酸、B相為乙腈、C相為甲醇、D相為10%甲醇；流速為1 mL/min；進樣量為10 μL；在波長280 nm處檢測；柱溫為40 ℃；洗脫方式：B相由6.5%變化15%（0～16 min），再從15%變化25%（16～25 min），最后25%變化6.5%（25～30 min）。制得標準曲線：CAF：Y=0.281 1x-0.289 2（R2=0.999 6）；EGCG：Y=0.128 3x+0.036 5（R2=0.999 7）。其中，x為樣品質(zhì)量濃度（μg/mL）；Y為峰面積。

1.3.2 提取次數(shù)對茶葉中CAF和EGCG的影響

稱取一定質(zhì)量的茶葉，控制NaOH用量0.1%、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度25 ℃、攪拌提取時間1.5 h，提取次數(shù)分別2，4，6和8次，合并提取堿性乙醇溶液，離心分離取上清液，經(jīng)0.45 μm膜過濾，濾液根據(jù)1.3.1小節(jié)的方法測定和計算CAF和EGCG含量，以式（1）～（5）計算EGCG的保留率、CAF的殘留率和EGCG與CAF的相對分離度。

式中：A為茶葉中EGCG的含量，%；B為茶葉中CAF的含量，%；C為堿性乙醇溶液中EGCG的質(zhì)量濃度，μg/mL；D為堿性乙醇溶液中CAF的質(zhì)量濃度，μg/mL；V為6次堿性乙醇提取所得乙醇溶液的總體積，mL；M為所用茶葉質(zhì)量，g。

1.3.3 NaOH用量對茶葉中CAF和EGCG的影響

稱取一定質(zhì)量的茶葉，控制料液比1∶10（g/mL）、提取溫度25 ℃、攪拌提取時間1.5 h和提取次數(shù)6次，使用NaOH用量分別為0，0.05%，0.1%和0.2%的堿性-乙醇溶液進行提取，離心分離取上清液，經(jīng)0.45 μm膜過濾，濾液根據(jù)1.3.1小節(jié)的方法測定和計算CAF和EGCG含量，根據(jù)1.3.2小節(jié)的公式計算EGCG的保留率、CAF的殘留率和EGCG與CAF的相對分離度。

1.3.4 料液比對茶葉中CAF和EGCG的影響

品比試驗采用間比法排列，無重復(fù)，4行區(qū)，面積20 m2，每6個品種設(shè)置1個對照品種。同一排首、末小區(qū)必須是對照品種，并設(shè)不少于4行的保護區(qū)。全區(qū)收獲計產(chǎn)，產(chǎn)量比較時以參試品種與兩個相鄰對照的平均值比較，計算增（減）產(chǎn)百分率，所有品種以增（減）產(chǎn)百分率的高低排序。

稱取一定質(zhì)量的茶葉，控制NaOH用量0.1%、提取溫度25 ℃、攪拌提取時間1.5 h和提取次數(shù)6次，使用料液比分別為1∶10，1∶15，1∶20和1∶30（g/mL）的堿性-乙醇溶液進行提取，離心分離取上清液，經(jīng)0.45 μm膜過濾，濾液根據(jù)1.3.1小節(jié)的方法測定和計算CAF和EGCG的含量，根據(jù)1.3.2小節(jié)的公式計算EGCG的保留率、CAF的殘留率和EGCG與CAF的相對分離度。

1.3.5 水和乙醇的比例對茶葉中CAF和EGCG的影響

稱取一定質(zhì)量的茶葉，控制NaOH用量0.1%、料液比1∶10（g/mL）、提取溫度25 ℃、攪拌提取時間1.5 h和提取次數(shù)6次，使用構(gòu)成比例分別為1∶99，2∶98，3∶97，5∶95和10∶90（V/V）的乙醇水溶液進行提取，離心分離取上清液，經(jīng)0.45 μm膜過濾，濾液根據(jù)1.3.1小節(jié)的方法測定和計算CAF和EGCG的含量，根據(jù)1.3.2小節(jié)的公式計算EGCG的保留率、CAF的殘留率和EGCG與CAF的相對分離度。

1.3.6 攪拌提取時間對茶葉中CAF和EGCG的影響

稱取一定質(zhì)量的茶葉，控制NaOH用量0.1%、料液比1∶10（g/mL）、水和無水乙醇的體積比3∶97（V/V）、提取溫度25 ℃和提取次數(shù)6次，按攪拌提取時間1.5，2，2.5，3和4 h分別進行提取，離心分離取上清液，經(jīng)0.45 μm膜過濾，濾液根據(jù)1.3.1小節(jié)的方法測定和計算CAF和EGCG的含量，根據(jù)1.3.2小節(jié)的公式計算EGCG的保留率、CAF的殘留率和EGCG與CAF的相對分離度。

1.3.7 提取溫度對茶葉中CAF和EGCG的影響

稱取一定質(zhì)量的茶葉，控制NaOH用量0.1%、料液比1∶10（g/mL）、水和無水乙醇的體積比3∶97（V/V）、攪拌提取時間2.5 h和提取次數(shù)6次，按提取溫度25，35，45，55和65 ℃分別進行冷凝回流提取，離心分離取上清液，經(jīng)0.45 μm膜過濾，濾液根據(jù)1.3.1小節(jié)的方法測定和計算CAF和EGCG的含量，根據(jù)1.3.2小節(jié)的公式計算EGCG的保留率、CAF的殘留率和EGCG與CAF的相對分離度。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取次數(shù)對茶葉中CAF的殘留率和EGCG的保留率影響的結(jié)果分析

從圖1可以看出，在堿性乙醇溶液提取的情況下，提取次數(shù)對EGCG的保留率沒有影響，但對CAF的殘留率有一定的影響，CAF的殘留率隨著提取次數(shù)的增多呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，當提取次數(shù)從6次到8次時，CAF的殘留率相差不多，8次提取次數(shù)中咖啡因的脫除率比6次提取次數(shù)高1%?？紤]到經(jīng)濟效益和不浪費資源，選擇提取次數(shù)6次。

圖1 提取次數(shù)對茶葉中CAF和EGCG的影響

2.2 NaOH用量對茶葉中CAF的殘留率和EGCG的保留率影響的結(jié)果分析

從圖2可以看出，NaOH用量的不同對EGCG的保留率和CAF的殘留率有不同的影響。當沒有添加NaOH時，EGCG的保留率為61%，EGCG的損失率為39%，CAF的殘留率為55%，這與想要達到在脫除CAF的同時盡可能保留多的EGCG的目的不相符。因此選擇在乙醇中添加NaOH，采用堿性-乙醇提取法，從圖2可以看出EGCG在添加NaOH的乙醇溶劑中沒有損失，CAF的殘留率呈現(xiàn)先上升后下降再上升的趨勢，在NaOH用量為0.1%時，CAF的殘留率最低，這說明CAF的脫除率在NaOH用量為0.1%最高。而且考慮EGCG在太強的堿性條件下可能被氧化和經(jīng)濟效益，所以選用NaOH用量為0.1%的堿性乙醇為溶劑。

圖2 NaOH用量對茶葉中CAF和EGCG的影響

2.3 料液比對茶葉中CAF的殘留率和EGCG的保留率影響的結(jié)果分析

從圖3可以看出，在NaOH用量為0.1%的情況下，不同的料液比對EGCG的保留率沒有影響，但對CAF的殘留率有一定的影響，CAF的殘留率隨著料液中液體占比的增大呈現(xiàn)持續(xù)遞增的趨勢，CAF的殘留率越高，說明CAF的脫除效果越不好。因此得出，NaOH用量為0.1%，料液比為1∶10（g/mL）時，咖啡因的脫除效果最好，CAF的脫除率為42%。

圖3 料液比對茶葉中CAF和EGCG的影響

2.4 水和乙醇的比例對茶葉中CAF的殘留率和EGCG的保留率影響的結(jié)果分析

從圖4可以看出，水和乙醇比例的不同對EGCG的保留率和CAF的殘留率有一定的影響。在水和乙醇比例為1∶99和2∶98（V/V）時，EGCG沒有損失，CAF的殘留率呈現(xiàn)遞減的趨勢。同樣的情況，隨著水的比例增大，EGCG的保留率和CAF的殘留率呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢。當水和乙醇比例由3∶97（V/V）增至10∶90（V/V）時，咖啡因的殘留率呈現(xiàn)平穩(wěn)趨勢，且殘留率較低，此時CAF的殘留率在12%左右，但EGCG的損失率在增大，水和乙醇比例為10∶90（V/V）時EGCG的保留率比3∶97（V/V）時要減少一半，這是因為EGEG在水中的溶解度比在乙醇中的溶解度大，所以隨著水的比例增大EGCG的保留率隨之減少。因此綜合考慮經(jīng)濟性和想要達到的效果，選擇水和乙醇的比例3∶97（V/V），此時CAF的脫除率為86%，EGCG的損失率為5%。

圖4 水和乙醇的比例對茶葉中CAF和EGCG的影響

2.5 攪拌提取時間對茶葉中CAF的殘留率和EGCG的保留率影響的結(jié)果分析

從圖5可以看出，隨著攪拌提取時間的增加，EGCG的保留率和CAF的殘留率有所變化。CAF的殘留率隨著攪拌提取時間的增加呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，超過2.5 h后CAF的殘留率減少幅度不大，殘留率在3%左右，但是EGCG的保留率在持續(xù)下降，4 h時EGCG的保留率為55%，EGCG的損失率為45%，這與想要達成分離效果不符，同時攪拌提取時間太長可能會加速EGCG在堿性乙醇溶液中氧化。因此，選擇攪拌時間2.5 h最為適宜，此時CAF的脫除率為97%，EGCG的損失率為5%。

圖5 攪拌提取時間對茶葉中CAF和EGCG的影響

2.6 提取溫度對茶葉中CAF的殘留率和EGCG的保留率影響的結(jié)果分析

從圖6可以看出，提取溫度的不同對EGCG的保留率和CAF的殘留率呈現(xiàn)出不同的變化趨勢。提取溫度的不同對CAF的殘留率影響不大，CAF的殘留率都在3%左右，可能是由于咖啡因易溶于堿性乙醇溶液和茶葉中咖啡因含量較低的緣故，CAF的脫除率達到想要的結(jié)果。但是隨著提取溫度的升高，EGCG的保留率呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，同時EGCG的損失率隨著提取溫度的升高呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢。因此提取溫度的升高，對EGCG的影響較大，溫度越高，EGCG含量的損失越大，與廖向前等[22]結(jié)論一致。同時，由于提取溫度太高可能會加速EGCG在堿性乙醇中的氧化，綜合考慮，提取溫度選擇25 ℃。

圖6 提取溫度對茶葉中CAF和EGCG的影響

2.7 各個因素對EGCG與CAF的相對分離度影響的結(jié)果分析

從圖7可以看出，提取次數(shù)不同時，EGCG與CAF的相對分離度呈現(xiàn)上升的趨勢，提取次數(shù)6次到8次時，EGCG與CAF的相對分離度趨勢增長緩慢。提取次數(shù)6次時，CAF的脫除率為41%；提取次數(shù)8時，CAF的脫除率為42%，秉著不浪費乙醇的原則，選擇提取次數(shù)6次，EGCG與CAF的相對分離度1.69，符合2.1小節(jié)的結(jié)果分析。在NaOH用量不同的情況下，EGCG與CAF的相對分離度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在NaOH用量為0.1%時，相對分離度最好，CAF的脫除率42%，EGCG全部保留，EGCG與CAF的相對分離度1.7，符合2.2小節(jié)的結(jié)果分析。隨著料液比的增大，EGCG與CAF的相對分離度呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，在料液比為1∶10（g/mL）時，CAF的脫除率42%，EGCG與CAF的相對分離度1.7，符合2.3小節(jié)的結(jié)果分析。在水和乙醇比例不同的條件下，EGCG與CAF的相對分離度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在水和乙醇比例為3∶97（V/V）時，相對分離度最好，這表明水和乙醇比為3∶97（V/V）時，CAF的脫除率最高，同時EGCG的損失率最少，EGCG與CAF的相對分離度為6.98，符合2.4小節(jié)的結(jié)果分析。在攪拌提取時間不同的情況下，EGCG和CAF的相對分離度呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在攪拌提取時間2.5 h時，相對分離度最好，CAF的脫除率97%，同時EGCG的損失率5%，EGCG與CAF的相對分離度30.13，符合2.5小節(jié)的結(jié)果分析。隨著提取溫度的升高，EGCG與CAF的相對分離度呈現(xiàn)持續(xù)下降的趨勢，在提取溫度為25 ℃時，相對分離度最好，CAF的脫除率97%，EGCG的損失率5%，EGCG與CAF的相對分離度30.16，符合2.6小節(jié)的結(jié)果分析。

圖7 各個因素對茶葉中EGCG與CAF的相對分離度的影響

3 結(jié)論

此試驗根據(jù)茶多酚和咖啡因的物理化學(xué)性質(zhì)的差異，采用堿性且高乙醇體積分數(shù)的乙醇水溶液為溶劑，以EGCG的保留率、CAF的殘留率、EGCG與CAF的相對分離度為指標，以提取次數(shù)、NaOH的用量、料液比、水和乙醇的比例、攪拌提取時間和提取溫度為因素，通過單因素試驗優(yōu)化了堿性-乙醇脫除綠茶咖啡因的最佳條件。最佳條件為提取次數(shù)6次、NaOH的用量0.1%、料液比1∶10（g/mL）、水和乙醇的比例3∶97（V/V）、攪拌提取時間2.5 h和提取溫度25℃。在此條件下，CAF的脫除率高達97%，殘留率僅為3%；EGCG的損失率僅為5%，保留率高達95%，EGCG與CAF的相對分離度為30.16。綠茶經(jīng)堿性-乙醇法脫除咖啡因后，可以制備低咖啡因含量和高茶多酚含量的綠茶提取物或者其他制品，為綠茶深加工提供提供理論支持。