諶琴麗,徐 劍,潘凱進(jìn),程震勇*

(1.湖北理工學(xué)院 醫(yī)學(xué)院,湖北 黃石 435003;2.勁牌有限公司 勁牌研究院,湖北 黃石 435100)

山楂、桑葉[1-3]、甘草的中藥提取物均具有藥食同源的性質(zhì),具有抗氧化、降血脂的功效,常被加入到白酒中作為功效成分。但是,關(guān)于這3種中藥提取物對(duì)腸道收縮舒張的調(diào)節(jié)作用的研究甚少。鑒于此,將家兔作為研究對(duì)象,選取其十二指腸開(kāi)展離體小腸平滑肌實(shí)驗(yàn),探究3種中藥提取物對(duì)腸道收縮舒張的影響,旨在為合理搭配加入白酒的中藥提取物提供實(shí)驗(yàn)資料。

1 材料與儀器

1.1 動(dòng)物

健康普通級(jí)日本大耳白兔(由湖北武漢萬(wàn)千佳興生物科技有限公司實(shí)驗(yàn)中心提供),實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)為SCXK(鄂)2018-0022,雌雄不拘,體重在2.0 kg左右。本動(dòng)物實(shí)驗(yàn)程序按照湖北理工學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物倫理原則進(jìn)行(動(dòng)物倫理備案號(hào):20210226)。

1.2 藥物

山楂、甘草、桑葉3種中藥材均來(lái)自勁牌研究院中藥資源與中藥組方研究室。經(jīng)王道清工程師鑒定,采用的薔薇科落葉灌木山楂的果實(shí)、豆科植物甘草的干燥根和根莖、?？浦参锷５母稍锶~等均為純正藥材,符合《中國(guó)藥典》(2015年版)要求。 以上3種藥材的提取物經(jīng)勁牌研究院天然藥化研究室醇提工藝得到,提取條件均為:70%乙醇,溫度70 ℃,浸提時(shí)間2 h,料液比1∶10。將得到的固體提取物配制成0.1、1、10 mg/mL 3種濃度。山楂、甘草、桑葉的中藥提取物均以15%(v∶v)基酒完全溶解。

1.3 試劑

臺(tái)式液由7種成分配制而成,分別稱量氯化鈉8.0 g、氯化鉀0.2 g、無(wú)水氯化鈣0.2 g、碳酸氫鈉1.0 g、磷酸二氫鈉0.05 g、氯化鎂0.1 g、葡萄糖1.0 g(試劑生產(chǎn)廠家均為天津科密歐化學(xué)試劑有限公司),加水溶解并定容為1 000 mL,靜置待用。

基酒(即山楂、桑葉、甘草提取物的溶媒):取15 mL的無(wú)水乙醇,加入純水調(diào)節(jié)容積至100 mL,配成15%(v∶v)的基酒待用。

1.4 儀器

恒溫平滑肌實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)(中國(guó)成都泰盟儀器公司,型號(hào)HW200S);張力信號(hào)傳感器(中國(guó)成都泰盟儀器公司,型號(hào)FT-100)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 家兔小腸標(biāo)本制備與平滑肌收縮信號(hào)記錄

共計(jì)使用健康家兔8只,每次實(shí)驗(yàn)使用1只,實(shí)驗(yàn)前禁食10 h。用木槌擊打頭部處死家兔后,常規(guī)解剖家兔,在胃幽門下端取十二指腸4～6 cm, 放入盛有臺(tái)式液的培養(yǎng)皿中,除去腸中內(nèi)容物,洗凈,將小腸兩端用外科縫合線打結(jié),制成離體標(biāo)本;然后放入恒溫平滑肌實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)標(biāo)本浴槽,與標(biāo)本掛鉤相連,腸段一端與肌張力傳感器相連。肌張力傳感器與BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)相連,打開(kāi)BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)軟件,在電腦屏幕上觀察小腸正常收縮的曲線,以及加入中藥提取物后收縮張力改變的曲線,記錄小腸平滑肌最大收縮張力數(shù)值和收縮頻率。

2.2 統(tǒng)計(jì)方法

BL-420S生物機(jī)能實(shí)驗(yàn)系統(tǒng)自動(dòng)記錄家兔十二指腸平滑肌收縮頻率和收縮最大張力,用“均值±標(biāo)準(zhǔn)差”表示,使用SPSS16.0統(tǒng)計(jì)軟件,使用單因素方差分析方法(one-way ANOVO)和t檢驗(yàn)方法比較組間均值之間的差異,P<0.05為組間均值有顯著性差異。

3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

山楂、桑葉、甘草的中藥提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮頻率的影響見(jiàn)表1。觀察正常組、溶媒對(duì)照組以及3種中藥提取物組間家兔的十二指腸平滑肌收縮頻率,發(fā)現(xiàn)溶媒對(duì)照組與正常組相比無(wú)顯著性差異,加中藥提取物后小腸平滑肌收縮頻率與正常組相比有顯著性差異。

表1 山楂、桑葉、甘草的中藥提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮頻率的影響

3.1 家兔十二指腸平滑肌正常收縮張力曲線

經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證(重復(fù)次數(shù)超過(guò)8次)以及統(tǒng)計(jì),家兔十二指腸平滑肌正常收縮張力平均為5.0 ±0.2 g,家兔十二指腸平滑肌正常收縮張力曲線如圖1所示。

3.2 溶媒(15%基酒)對(duì)十二指腸平滑肌收縮的影響

待十二指腸平滑肌收縮信號(hào)穩(wěn)定以后,加入溶媒(15%基酒)1 mL,觀察平滑肌收縮張力信號(hào)的改變,溶媒(15%基酒)對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響如圖2所示。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證(重復(fù)次數(shù)超過(guò)8次),家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為5.20±0.36 g,經(jīng)t檢驗(yàn)統(tǒng)計(jì)分析,加入15%基酒后,十二指腸收縮張力值與正常收縮張力值相比無(wú)顯著性差異(P>0.05),說(shuō)明山楂、甘草、桑葉的中藥提取物提取過(guò)程中使用的溶媒(15%基酒)對(duì)十二指腸平滑肌收縮張力無(wú)明顯影響。

3.3 山楂提取物對(duì)家兔十二指腸收縮力的影響

觀察并記錄小腸平滑肌在正常情況下的收縮張力值,再往浴槽中按照濃度梯度依次加入0.1、1、10 mg/mL山楂提取物,每次1 mL,每次加入后觀察并記錄小腸收縮張力值。加入不同濃度的山楂提取物的家兔十二指腸收縮力的變化曲線如圖3所示。不同濃度的山楂提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響如圖4所示。經(jīng)反復(fù)檢驗(yàn)(重復(fù)次數(shù)超過(guò)8次)以及統(tǒng)計(jì),加入0.1 mg/mL的山楂提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為6.00±0.22 g,與正常組相比P>0.05,無(wú)顯著性差異。加入1 mg/mL的山楂提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為7.50±0.17 g,與正常組相比P<0.05,有顯著性差異。加入10 mg/mL的山楂提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為8.60±0.32 g,與正常組相比P<0.01,有極顯著性差異。

圖4 不同濃度的山楂提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響(與正常組相比,*P<0.05,**P<0.01)

加入山楂提取物后小腸平滑肌的收縮張力與小腸正常張力值相比有顯著性差異(P<0.05),收縮張力明顯增大,顯示山楂提取物對(duì)小腸有加強(qiáng)收縮作用,并且呈濃度依賴性,加入的提取物的濃度越大,小腸平滑肌的收縮力越強(qiáng)。

3.4 甘草提取物對(duì)家兔十二指腸收縮力的影響

觀察并記錄小腸平滑肌在正常情況下的收縮張力值,再往浴槽中按照濃度梯度依次加入0.1、1、10 mg/mL的甘草提取物,每次1 mL,每次加入后觀察并記錄小腸收縮張力值。加入不同濃度的甘草提取物的家兔十二指腸收縮力的變化曲線如圖5所示,不同濃度的甘草提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響如圖6所示。

(a) 0.1 mg/mL

圖6 不同濃度的甘草提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響(與正常組相比,**P<0.01)

經(jīng)反復(fù)檢驗(yàn)(重復(fù)次數(shù)超過(guò)8次)以及統(tǒng)計(jì),加入0.1 mg/mL的甘草提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為5.10±0.24 g,與正常組相比P>0.05,無(wú)顯著性差異。加入1 mg/mL的甘草提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為4.2±0.2 g,與正常組相比P>0.05,無(wú)顯著性差異。加入10 mg/mL的甘草提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為1.8±0.16 g,與正常組相比P<0.01,有極顯著性差異。

經(jīng)單因素方差統(tǒng)計(jì)分析,加入甘草提取物后,小腸平滑肌的收縮張力與小腸正常張力值相比有顯著性差異(P<0.05),小腸收縮張力明顯減小,顯示甘草提取物對(duì)小腸有舒張作用,并且呈濃度依賴性,其提取物的濃度越大,舒張作用越強(qiáng)。

3.5 桑葉提取物對(duì)家兔十二指腸收縮力的影響

觀察并記錄小腸平滑肌在正常情況下的收縮張力值,再往浴槽中按照濃度梯度依次加入0.1、1、10 mg/mL的桑葉提取物,每次1 mL,每次加入后觀察并記錄小腸收縮張力值。加入不同濃度的桑葉提取物的家兔十二指腸收縮力的變化曲線如圖7所示,不同濃度的桑葉提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響如圖8所示。經(jīng)反復(fù)驗(yàn)證(重復(fù)次數(shù)超過(guò)8次)以及單因素方差統(tǒng)計(jì)分析,加入0.1 mg/mL的桑葉提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為3.2±0.27 g,與正常組相比P>0.05,無(wú)顯著性差異。加入1 mg/mL的桑葉提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為2.5±0.16 g,與正常組相比,P<0.01,有顯著性差異。加入10 mg/mL的桑葉提取物后,家兔十二指腸平滑肌收縮張力平均為1.4±0.34 g,與正常組相比P<0.001,有極顯著性差異。加入桑葉提取物后,小腸平滑肌的收縮張力與小腸正常張力值相比有顯著性差異(P<0.05),張力明顯減小,顯示桑葉提取物對(duì)小腸有舒張作用,并且呈濃度依賴性,提取物的濃度越大,舒張作用越強(qiáng)。

(a) 0.1 mg/mL

圖8 不同濃度的桑葉提取物對(duì)家兔十二指腸平滑肌收縮力的影響(“1 mg/mL”vs“15%的基酒”,**P<0.01;“10 mg/mL”vs“15%的基酒”,***P<0.001)

4 結(jié)論

經(jīng)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證,濃度為1 mg/mL和10 mg/mL的山楂提取物乙醇溶液對(duì)小腸平滑肌有明顯加強(qiáng)收縮的作用,濃度為10 mg/mL的甘草提取物乙醇溶液、濃度為1 mg/mL和10 mg/mL的桑葉提取物乙醇溶液對(duì)家兔小腸平滑肌具有明顯加強(qiáng)舒張的作用,且桑葉提取物的舒張作用強(qiáng)于甘草提取物。3種中藥提取物對(duì)小腸的收縮或者舒張作用強(qiáng)度呈現(xiàn)濃度依賴性。

5 討論

山楂、桑葉、甘草3種中藥提取物常加入我國(guó)白酒中作為功效成分。部分中藥提取物或引起腸道收縮增強(qiáng),或引起腸道舒張?jiān)鰪?qiáng),如何科學(xué)地搭配中藥提取物,使腸道收縮功能處于正常穩(wěn)態(tài)是非常有意義的研究?jī)?nèi)容。我們發(fā)現(xiàn)山楂提取物使收縮頻率顯著性降低,而桑葉和甘草則使小腸收縮頻率顯著性增加,與收縮力正好是相反的實(shí)驗(yàn)結(jié)果。原因可能是收縮力和收縮頻率是相互協(xié)調(diào)的,假如收縮頻率和收縮力同時(shí)增加,則必然耗費(fèi)平滑肌更多能量,維持不了更長(zhǎng)時(shí)間,小腸的正常收縮必然受到影響,所以對(duì)收縮頻率的影響還牽涉到小腸收縮的自我調(diào)節(jié)機(jī)制。

小腸平滑肌自動(dòng)節(jié)律收縮活動(dòng)就是由位于“縱行肌”和“環(huán)形肌”之間的Cajal間質(zhì)細(xì)胞(Interstitial Cells of Cajal,ICC)產(chǎn)生的慢波節(jié)律而起步的。而這種自發(fā)活動(dòng)的產(chǎn)生和傳導(dǎo)易受到神經(jīng)遞質(zhì)、離子、胃腸激素等生物活性物質(zhì)和藥物的影響[4]。ICC產(chǎn)生一種起搏電流觸發(fā)的慢波電流,屬于L2型Ca2+電流[5],因此平滑肌的舒縮依賴于細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的變化。肌細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度增加主要通過(guò)胞內(nèi)鈣庫(kù)的釋放和胞外攝入兩個(gè)途徑。平滑肌收縮活動(dòng)可因胞內(nèi)Ca2+濃度的降低而減弱,反之增強(qiáng)。另外,小腸平滑肌受副交感神經(jīng)纖維支配占優(yōu)勢(shì),當(dāng)副交感神經(jīng)纖維興奮時(shí),神經(jīng)末梢釋放神經(jīng)遞質(zhì)乙酰膽堿(Ach),小腸平滑肌細(xì)胞膜上分布有M型膽堿受體,乙酰膽堿(Ach)會(huì)和M型膽堿受體結(jié)合并激動(dòng)M受體。如果山楂提取物中含有激動(dòng)M型受體的成分或者能抑制膽堿酯酶的成分,類似于毛果蕓香堿或新斯的明,則會(huì)引起平滑肌收縮增強(qiáng),若桑葉提取物或者甘草提取物含有M受體阻斷劑的成分,類似于阿托品,則會(huì)引起平滑肌松弛。

山楂、桑葉、甘草的提取物中含有多糖、黃酮、多酚等數(shù)十種成分,到底是哪一種單體成分發(fā)揮作用尚不清楚,以山楂為例,山楂確有消食之功效,消化不良者服用非常合適,但是空腹者或者有胃炎、胃潰瘍者服用卻并不適合,因?yàn)槠淇梢源碳し谜呶杆岽罅糠置?胃酸的分泌與胃粘膜壁細(xì)胞上M膽堿受體有密切關(guān)系,典型的M膽堿受體阻斷劑哌侖西平可以抑制胃酸分泌,所以山楂中可能含有激動(dòng)M膽堿受體的成分。因此,以上3種中藥提取物引起小腸平滑肌收縮增強(qiáng)或者舒張?jiān)鰪?qiáng)的詳細(xì)機(jī)制涉及小腸平滑肌細(xì)胞膜上的M型膽堿受體、副交感神經(jīng)-小腸平滑肌接頭間隙內(nèi)AchE的抑制以及平滑肌細(xì)胞內(nèi)的Ca2+濃度變化等,十分復(fù)雜,詳細(xì)機(jī)制尚有待進(jìn)一步深入研究。