王子君,鄭 媚,解舉民,b*

(湖北理工學(xué)院 a.醫(yī)學(xué)院,b.腎臟疾病發(fā)生與干預(yù)湖北省重點實驗室,湖北 黃石 435003)

丹參(Salviamiltiorrhiza)具有祛瘀止痛、活血通經(jīng)、清心除煩的功效,可以顯著增加冠脈流量,是心腦血管疾病中成藥的重要成分[1-2]。我國心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上,為首位死因[3]?，F(xiàn)代藥理研究表明,丹參可以用于治療多種疾病,且丹參酮對動脈粥樣硬化、心肌梗死(Myocardial Infarction, MI)、心肌肥厚和慢性心力衰竭(Heart Failure,HF)等心血管和腦血管疾病具有顯著的療效,但其藥理作用尚不明晰[4-6]。

因此,本文利用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與分子對接技術(shù),結(jié)合中藥治療疾病的多靶點、多途徑特點,進(jìn)一步探究丹參治療心血管疾病的分子機(jī)制,為丹參臨床應(yīng)用及心血管疾病的治療提供藥用分子、作用靶點及信號通路。丹參治療心血管疾病的分子機(jī)制流程圖如圖1所示。

1 材料與方法

1.1 丹參活性成分收集及靶點預(yù)測

采用中藥藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(TCMSP,http://lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php;TCMID,http://www.megabionet.org/tcmid/;TCM-ID,http://bidd.group/TCMID/index.html)檢索丹參活性成分,以O(shè)B≥30%和DL≥0.18為條件對丹參有效成分進(jìn)行初篩,利用SWISS ADME中胃腸道吸收值(GI)和類藥性中Yes為3個及以上為條件再次篩選藥用活性成分。利用Swiss Target Prediction對篩選出來的丹參活性成分進(jìn)行靶點預(yù)測,保留Probability≥0.1的靶點。

1.2 心血管疾病靶點庫及“丹參-成分-共同靶點-心血管疾病”的構(gòu)建

在GeneCards (https://www.genecards.org/)、PharmGKB (https://www.pharmgkb.org/)、OMIM(https://omim.org/)和TTD (http://db.idrblab.net/ttd/)數(shù)據(jù)庫中分別檢索心血管疾病相關(guān)靶點,共同構(gòu)建心血管疾病靶點庫,并利用韋恩圖獲得交集靶點。

1.3 丹參治療心血管疾病PPI分析及核心靶點篩選

將丹參活性成分與心血管疾病的交集靶點輸入STRING數(shù)據(jù)庫中,限定物種為人,進(jìn)行PPI網(wǎng)絡(luò)分析,并利用Cytoscape 3.8.0拓?fù)浞治鰧?dǎo)出數(shù)據(jù),按照degree數(shù)值≥中間值的2倍、betweenness數(shù)值≥中間值、closeness數(shù)值≥中間值篩選核心靶點。

1.4 GO功能富集分析

將交集靶點導(dǎo)入David網(wǎng)站(https://david.ncifcrf.gov/),以P≤0.01為條件進(jìn)行篩選,得到生物學(xué)過程(Biological Process,BP)、細(xì)胞成分(Cellular Component,CC)、分子功能(Molecular Function,MF)和KEGG富集信息,再將GO-BP、GO-CC、GO-MF、KEGG分別導(dǎo)入易漢博(http://www.ehbio.com/ImageGP/index.php/Home/Index/index.html)進(jìn)行可視化分析。

1.5 KEGG通路富集分析及“心血管疾病通路-靶點”的構(gòu)建

整理KEGG通路富集信息,作氣泡圖直觀表示顯著富集通路,對應(yīng)靶點建立Network和Type表,導(dǎo)入Cytoscape 3.8.0 進(jìn)行可視化分析。

1.6 丹參活性成分與關(guān)鍵靶點的分子對接

在TCMSP數(shù)據(jù)庫下載活性成分的mol2結(jié)構(gòu),在PDB(https://www.pdbus.org/)數(shù)據(jù)庫中獲取關(guān)鍵靶點3D結(jié)構(gòu),采用AutoDock及PyMOL軟件對大分子受體蛋白及小分子配體進(jìn)行去水、加氫、加電荷等前處理,再利用AutoDock Vina進(jìn)行分子對接,獲得靶蛋白與配體的最小結(jié)合自由能,根據(jù)結(jié)合能大小判斷其親和力,驗證其結(jié)合活性。利用PyMol軟件對對接結(jié)果進(jìn)行可視化,最后根據(jù)結(jié)合能在Sangerbox在線分析平臺中作出分子對接的熱圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 丹參活性成分的獲取及成分靶點預(yù)測結(jié)果

在TCMSP中檢索到65個丹參的活性組分,在TCMID中檢索到166個,在TCM-ID中檢索到120個,運用韋恩圖取交集得到13個活性成分,再次篩選,最后有10個丹參活性成分符合要求,丹參活性成分表見表1。將有效成分進(jìn)行靶點預(yù)測,在Swiss Target Prediction中共篩選出317個成分靶點。

2.2 心血管疾病靶點庫及“丹參-成分-共同靶點-心血管疾病”構(gòu)建結(jié)果

“丹參-成分-共同靶點-心血管疾病”網(wǎng)絡(luò)圖如圖2所示。GeneCards數(shù)據(jù)庫中檢索到的3 608個cardiovascular disease 靶點,高于Relevance score的靶點有577個,在OMIM中搜索到143個,TTD中76個,PharmGKB中48個,共獲得740個心血管疾病靶點。利用韋恩圖將心血管疾病靶點與丹參活性成分靶點取交集,得到丹參抗心血管疾病的78個作用靶點。

圖2 “丹參-成分-共同靶點-心血管疾病”網(wǎng)絡(luò)圖

2.3 心血管疾病PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點結(jié)果

將78個交集靶點導(dǎo)入到STRING數(shù)據(jù)庫,除去獨立蛋白,得到蛋白PPI網(wǎng)絡(luò)。根據(jù)Degree值分析蛋白網(wǎng)絡(luò),Degree值越大,則該靶點抗病作用可能性越大。從78個靶點中篩選核心靶點,有SRC、PTGS2、EGFR、PPARG、MMP9、ACE、STAT3、HIF1等。

2.4 GO功能富集分析結(jié)果

GO富集分析圖如圖3所示。

圖3 GO富集分析圖

在DAVID數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行GO分析,得到GO-BP、GO-CC和GO-MF通路分別為216、36和66條。篩選P≤0.01的通路,其中GO-BP包括凋亡過程的負(fù)調(diào)控、DNA模板介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄正調(diào)控、藥物反應(yīng)等;GO-CC為質(zhì)膜細(xì)胞質(zhì)側(cè)的外在成分、細(xì)胞外空隙、細(xì)胞質(zhì)等17個條目;GO-MF包括鋅離子結(jié)合、酶結(jié)合等17個條目。

2.5 KEGG通路富集分析結(jié)果及“心血管疾病通路-靶點”圖

將KEGG通路篩選于Cytoscape里進(jìn)行可視化,構(gòu)建心血管疾病通路-靶點圖如圖4所示。通路分析氣泡圖如圖5所示。KEGG疾病通路共34條,其中P≤0.01的顯著富集通路有17個,關(guān)鍵疾病通路包括HIF-1信號通路、CAMP信號通路、TNF信號通路等,提示丹參可以通過多通路作用于心血管疾病。

圖4 心血管疾病通路-靶點圖

圖5 通路分析氣泡圖

2.6 分子對接結(jié)果

將新隱丹參酮、隱丹參酮、丹參醇B等前6個活性成分作為配體和ACE、EGFR、ESR1等前9個關(guān)鍵靶點分別進(jìn)行分子對接。發(fā)現(xiàn)黃芩苷、新隱丹參酮、隱丹參酮等成分與SRC、PPARG、STAT3、MMP9等關(guān)鍵靶點具有良好結(jié)合能力,與EGFR等可在自然狀態(tài)下對接。結(jié)果顯示,同一靶點可與多種化合物有較好結(jié)合活性,提示丹參治療心血管疾病的多成分之間或存在協(xié)同作用。根據(jù)結(jié)合能在Sangerbox網(wǎng)站中作熱圖。以靶點SRC、PPARG、STAT3、MMP9為例,利用PyMOL對結(jié)果進(jìn)行可視化展示,關(guān)鍵靶點信息表見表2。分子對接模型如圖6所示,其中隱丹參酮與STAT3活性位點HIS-315、ARG-316形成氫鍵相互作用,結(jié)合性最好。

表2 關(guān)鍵靶點信息表

圖6 分子對接模型

3 討論與展望

本研究發(fā)現(xiàn)隱丹參酮、黃芩苷、丹參醇的關(guān)鍵成分可以通過多靶點、多途徑治療心血管疾病。隱丹參酮作為丹參中主要的脂溶性成分具有活血化瘀的功效,已廣泛應(yīng)用于治療心血管疾病[7]。研究發(fā)現(xiàn),參酮IIA能降低SRC的表達(dá),從而抑制動脈粥樣硬化。黃芩苷可激活A(yù)MPK和TFG-β/S mads通路,抑制心肌纖維發(fā)展,保護(hù)心肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞,抑制心肌重塑[8-10]。

富集分析和通路分析結(jié)果表明,丹參治療心血管疾病主要與HIF-1信號通路、CAMP信號通路、TNF信號通路等多條通路相關(guān)。HIF通路是缺血缺氧環(huán)境中重要的信號傳遞分子,調(diào)控心肌細(xì)胞等細(xì)胞中相關(guān)因子的表達(dá)[11]。此外,PIK3CG、EGFR共同涉及鈣信號通路、HIF-1信號通路等。這些通路具有保護(hù)血腦屏障,減輕心肌細(xì)胞凋亡,促進(jìn)缺血后的心肌恢復(fù)等作用[12]。因此,挖掘這些通路是丹參治療心血管疾病的可參考作用機(jī)制之一。

本文運用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)和分子對接技術(shù)探究丹參中活性成分及其治療心血管疾病的作用靶點,通過多成分、多靶點、多通路方式開展分析與預(yù)測,證明了丹參在心血管治療中的重要作用,為其臨床應(yīng)用提供理論指導(dǎo)與參考。