林裕衛(wèi),黃晁康,彭曉宏

(1.佛山金萬達(dá)科技股份有限公司,廣東 佛山 528000; 2.華南理工大學(xué),廣東 廣州 510641)

傳統(tǒng)傷口敷料如干紗布、油紗布、繃帶、棉布等,起著保護(hù)傷口的基礎(chǔ)物理作用,而實(shí)際的創(chuàng)面情況是非常復(fù)雜的,包括細(xì)菌滋生、創(chuàng)口開裂等。傳統(tǒng)傷口敷料不能保持創(chuàng)面濕潤(rùn),在愈合期間,創(chuàng)面的新生組織與紗布粘連,更換敷料時(shí)容易觸動(dòng)肉芽組織,導(dǎo)致患者不適。潮濕環(huán)境下肉芽組織的發(fā)育速度更快,濕傷口新形成的表皮細(xì)胞層的厚度和數(shù)量均大于干傷口[1],在創(chuàng)面保持濕潤(rùn)狀態(tài)能夠促進(jìn)傷口愈合,濕性敷料成為近幾年的重點(diǎn)研究方向。

水凝膠濕性敷料的親水特性能夠保持創(chuàng)面濕潤(rùn),形成濕傷口,在傷口細(xì)胞的增殖過程中,肌原纖維通過使傷口收縮促進(jìn)傷口逐漸變小[2]。近幾年,功能化水凝膠敷料的大部分研究著重于藥物負(fù)載和釋放,過低的有效藥物濃度不能滿足加快傷口愈合的要求,過高的濃度存在一定細(xì)胞毒性,進(jìn)一步破壞傷口組織,引起傷口發(fā)炎、壞死等情況。此外,水凝膠敷料通常無組織黏附性,直接使用容易掉落,不利于長(zhǎng)時(shí)間將水凝膠固定在創(chuàng)口表面以達(dá)到持續(xù)治愈的效果。Li等[3]研究表明可以通過在水凝膠表面施加橋接聚合物的方式增加組織黏附性。

貽貝足絲分泌的黏蛋白能夠在潮濕環(huán)境下與大部分表面形成鍵合,具有強(qiáng)大的耐濕性黏合力[4],本文基于傷口收縮理論以及擬貽貝的結(jié)構(gòu),經(jīng)兒茶酚基團(tuán)偶聯(lián)法改性殼聚糖(CCS),并將其負(fù)載到功能化溫敏性水凝膠中,制備一種具有機(jī)械活性的水凝膠黏合劑敷料(HA),測(cè)試該敷料的性能,以用于藥物輸送系統(tǒng)、止血材料、組織工程材料和生物傳感器。

1 實(shí)驗(yàn)部分

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備

主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備如表1所示。

表1 主要實(shí)驗(yàn)儀器與設(shè)備Tab.1 Main experimental instruments and equipment

1.2 實(shí)驗(yàn)材料與試劑

主要實(shí)驗(yàn)原料與試劑如表2所示。

表2 主要實(shí)驗(yàn)原料與試劑Tab.2 Main raw materials and reagents for the experiment

2 仿生機(jī)械活性黏合劑敷料制備

2.1 殼聚糖-g-兒茶酚橋接聚合物(CCS)的制備

將殼聚糖(CS)溶解在50 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的乙酸溶液中,充氮?dú)夤呐?0 min以除去氧氣;將一定質(zhì)量比的1-乙基-(3-二甲基氨基丙基)碳二亞胺鹽酸鹽(EDC)和3,4-二羥基苯丙酸(HBC)[5]充分溶解在25 mL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液中,將混合溶液加入至殼聚糖溶液中,在室溫下攪拌反應(yīng)24 h。將上述溶液在透析膜中,用pH值為4.5的鹽酸溶液透析2 d,以除去未反應(yīng)單體,用去離子水透析5 h;最后用冷凍干燥機(jī)在-40℃條件下將樣品溶液凍干24 h,得到最終產(chǎn)物水凝膠殼聚糖-g-兒茶酚(CCS)。CCS合成原料配方如表3所示。

表3 CCS合成的原料配方Tab.3 Formulations of CCS

2.2 HKUST-1功能化溫敏性水凝膠(PAGel-H)的制備

通過溶液法制備銅金屬有機(jī)框架(HKUST-1),將0.15 mmol醋酸銅一水合物和0.1 mmol 1,3,5-苯三甲酸分別溶于4 mL去離子水和無水乙醇中,然后將醋酸銅一水合物溶液逐滴滴加到1,3,5-苯三甲酸的乙醇溶液當(dāng)中,均勻攪拌約30 min以獲得藍(lán)色懸浮液;以5 000 r/min轉(zhuǎn)速離心懸浮液8 min,分離獲得HKUST-1納米粒子;用體積分?jǐn)?shù)為50%的乙醇溶液洗滌產(chǎn)物,重復(fù)洗滌3次以除去殘留的反應(yīng)物,將收集的樣品在真空下干燥,密封保存在干燥器中。

利用自由基聚合反應(yīng)與離子交聯(lián)反應(yīng)制備聚(N-異丙基丙烯酰胺)/海藻酸鈣(Alg)溫敏性水凝膠(PAGel-H)。將一定量的N-異丙基丙烯酰胺(NIPAm)、丙烯酸十八酯(SA)、交聯(lián)劑甲基丙烯酰胺基苯乙酮和促引發(fā)劑N、 N,N′,N′-四甲基乙二胺添加于裝有10 mL去離子水的燒杯中,在室溫下將混合溶液攪拌均勻后,通入氮?dú)怛?qū)氧30 min;然后加入一定比例HKUST-1納米粒子,短時(shí)間攪拌后迅速將混合溶液倒入由2塊玻璃板和硅膠墊片制成的模具當(dāng)中,反應(yīng)24 h后將水凝膠樣品置于去離子水中浸泡48 h,定期換水以去除未反應(yīng)的單體;最后將樣品用凍干機(jī)冷凍干燥,密封置于4℃冰箱保存?zhèn)溆?合成配方如表4所示。

表4 PAGel-H水凝膠合成配方Tab.4 Formulations of PAGel-H

2.3 仿生機(jī)械活性黏合劑敷料(HA)的制備

采用涂布法制備水凝膠黏合劑,在室溫下將CCS溶解在去離子水中,相比于未改性的CS,CCS的水溶性更佳[6],攪拌均勻制得橋接聚合物溶液;將CCS溶液均勻涂覆于PAGel-H的一側(cè)表面制得HA,應(yīng)用時(shí)將涂有CCS的一面貼敷于傷口表面即可。

3 測(cè)試與表征

3.1 核磁共振氫譜(1H-NMR)測(cè)試

將CS和CCS溶于2%氘代乙酸溶液和氧化氘中,使用AVANCE III HD 400型核磁共振氫譜儀對(duì)其進(jìn)行1H-NMR表征,以分析其組成。

3.2 紫外光譜(UV-Vis)測(cè)試

參照GB/T 26813—2011《雙光束紫外可見分光光度計(jì)》,使用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定CCS上兒茶酚基團(tuán)的接枝率,具體方法為:

①兒茶酚標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的測(cè)定。準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量的3,4-二羥基苯丙酸(HBC),用去離子水定容至100 mL,然后稀釋配制成濃度分別為0.025、0.050、0.100、0.200、0.400 mmol/L的溶液,用紫外-可見分光光度計(jì)在波長(zhǎng)范圍為200～800 nm內(nèi)掃描,測(cè)定它們?cè)讦?280 nm下的吸光度。

②CCS兒茶酚基團(tuán)接枝率的測(cè)定。用去離子水溶解CCS制備質(zhì)量濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液,然后用紫外-可見分光光度計(jì)測(cè)定樣品溶液在波長(zhǎng)280 nm處的吸光度,由標(biāo)準(zhǔn)工作曲線得出兒茶酚基團(tuán)的濃度,每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),計(jì)算平均值。CCS兒茶酚基團(tuán)的接枝率(GR)的計(jì)算公式[9]為:

(1)

式中:Mcat為兒茶酚基團(tuán)的相對(duì)分子質(zhì)量;Ccat為由標(biāo)準(zhǔn)曲線讀出的兒茶酚基團(tuán)濃度,mmol/L;V為樣品溶液的體積,mL;WCCS為樣品溶液中CCS的質(zhì)量,mg。

3.3 抗氧化性能測(cè)試

抗氧化性能參考文獻(xiàn)[7]中方法進(jìn)行測(cè)試,并根據(jù)本文研究情況略加改動(dòng)。

①ABTS自由基清除測(cè)試。準(zhǔn)確稱量一定質(zhì)量的2,2’-聯(lián)氨-雙-(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)-二氨鹽(ABTS)和過硫酸鉀(K2S2O8)溶于去離子水中,分別制得ABTS儲(chǔ)備液(7.4 mmol/L)和K2S2O8儲(chǔ)備液(2.6 mmol/L)。各取5 mL混合均勻,室溫下鋁箔包裹避光孵育16 h;調(diào)節(jié)混合溶液的濃度使其在波長(zhǎng)734 nm處的紫外吸光度為(0.7±0.02),以獲得ABTS+工作液。分別取CCS溶液加入ABTS+工作液,在37℃下培養(yǎng)6 min,紫外-分光光度計(jì)測(cè)量在波長(zhǎng)734 nm處的吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。ABTS自由基清除率(Ca)的計(jì)算公式為:

(2)

式中:Aa0為對(duì)照組的吸光度,L/(g·cm);Aai為不同樣品溶液的吸光度,L/(g·cm)。

②超氧自由基清除測(cè)試。分別取不同質(zhì)量的CCS樣品加入到12 mL Tris-HCl溶液(50 mmol/L、pH值8.1)中,搖勻溶液至充分溶解后加入2 mL鄰苯三酚溶液(3 mmol/L),然后將混合物放置于37℃恒溫恒濕培養(yǎng)箱,避光培養(yǎng)5 min;最后加入0.5 mL 鹽酸溶液(8 mmol/L)終止反應(yīng),紫外-分光光度計(jì)測(cè)量在波長(zhǎng)320 nm處的吸光度。每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn),取平均值。超氧自由基清除率(Cc)的計(jì)算公式為:

(3)

式中:Ac0為對(duì)照組的吸光度;Aci為不同樣品溶液的吸光度。

3.4 組織黏附性能測(cè)試

采用搭接剪切法對(duì)水凝膠黏合劑的組織黏附性進(jìn)行表征。將從市場(chǎng)購買的新鮮豬皮剪成長(zhǎng)75 mm、寬25 mm的樣條;將水凝膠黏合劑黏附在2塊豬皮中間,其中重疊搭接區(qū)域大小為25 mm×25 mm。使用電子萬能材料試驗(yàn)機(jī)對(duì)樣品進(jìn)行單軸拉伸測(cè)試,拉伸速率為5 mm/min,結(jié)束條件為水凝膠破裂或從豬皮上剝離。每個(gè)樣品重復(fù)5次實(shí)驗(yàn),計(jì)算平均值作為結(jié)果。黏合強(qiáng)度(AS)定義為拉伸過程中最大拉伸力與搭接區(qū)域面積之比,其計(jì)算公式為:

(4)

式中:Fm為最大拉伸力,N;A為搭接區(qū)域面積,m2。

3.5 體外抗菌性能測(cè)試

通過平板菌落計(jì)數(shù)法表征水凝膠的抗菌活性。預(yù)先制備圓柱狀水凝膠樣品,并放置在紫外光照射下正反面滅菌0.5 h,置于6孔細(xì)菌培養(yǎng)板備用,每孔加入1 mL PBS緩沖液,使用酶標(biāo)儀測(cè)量波長(zhǎng)在 600 nm處的吸光度(OD值),隨后加入PBS緩沖液將菌液按濃度梯度稀釋至1×106CFU/mL。將6孔板放入37 ℃的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)24 h。將6孔板置于超聲波清洗器中超聲波處理1 min,移取混合溶液并依次以10倍梯度稀釋,待培養(yǎng)基吸收菌液后倒置放于37 ℃的二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)18 h,計(jì)算瓊脂培養(yǎng)基上的菌落數(shù),每個(gè)樣品重復(fù)3次實(shí)驗(yàn)。細(xì)菌存活率(BV)的計(jì)算公式為:

(5)

式中:ABV0為對(duì)照組菌落數(shù),CFU;ABVi為水凝膠實(shí)驗(yàn)組菌落數(shù),CFU。

3.6 體外傷口閉合測(cè)試

在新鮮外植的大鼠皮膚上進(jìn)行體外傷口閉合測(cè)試。使用穿孔器(直徑10 mm),記錄原始傷口大小,然后把黏合劑樣品裁剪,將其按壓至傷口并冷敷10 min,將皮膚于37℃下培養(yǎng)24 h;拍攝傷口,用Imagine J測(cè)量傷口大小。體外傷口閉合率(EWC)的計(jì)算公式為:

(6)

式中:S為傷口的原始面積,mm2;St為處理后的傷口面積,mm2。

3.7 體內(nèi)創(chuàng)面愈合測(cè)試

對(duì)8～10周齡的SPF級(jí)大鼠用質(zhì)量分?jǐn)?shù)5%的水合氯醛麻醉,在無菌條件下用直徑為10 mm的穿孔器勒出傷口,每1組大鼠為5只,第1組大鼠傷口用PBS緩沖液(40 μL)處理作為空白對(duì)照;其余3組分別將聚丙烯酰胺/海藻酸銅水凝膠黏合劑(PAAm-Alg+CCS)、機(jī)械活性水凝膠黏合劑(PAGel+CCS)和抗菌機(jī)械活性水凝膠黏合劑(HA)貼敷于傷口表面,其中PAGel+CCS和HA需先冷敷5 min。通過Imagine J測(cè)量傷口大小,表征水凝膠黏合劑促進(jìn)大鼠傷口愈合的作用,通過式(7)計(jì)算體內(nèi)傷口愈合率(IWC):

(7)

式中:S0為第0天的傷口面積,mm2;Sn為第n天的傷口面積(n=1、3、5、8、11、14),mm2。

3.8 體外細(xì)胞毒性測(cè)試

使用CCK-8法評(píng)估藻酸鈣-聚(N-異丙基丙烯酰胺)雜化網(wǎng)絡(luò)水凝膠(PAGel)、PAGel-H和CCS的細(xì)胞毒性。將滅菌后的水凝膠樣品浸泡在去離子水中(5 mg/mL),并在37 ℃下孵育24 h以收集浸出液;此外,將CCS溶解在去離子水中,以收集溶液。培養(yǎng)小鼠成纖維細(xì)胞(L929),并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù);調(diào)整含量為3×103個(gè)/mL,取100 μL細(xì)胞液接種在96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中,并放入二氧化碳培養(yǎng)箱預(yù)培養(yǎng)24 h,然后向細(xì)胞液中加入含有樣品浸出液的DMEM培養(yǎng)基,在37℃下放入二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng),對(duì)照組用PBS代替樣品浸出液進(jìn)行細(xì)胞培養(yǎng)。分別在第1、4和7 d取出96孔板,加入10 μL CCK-8試劑培養(yǎng)4 h,然后使用酶標(biāo)儀測(cè)量細(xì)胞懸液在λ=450 nm處的吸光度(OD)。通過Calcein-AM/PI雙染細(xì)胞法進(jìn)行細(xì)胞活/死染色測(cè)試,取一定量與細(xì)胞懸液共培養(yǎng)第1和4 d的樣品液進(jìn)行染色,然后使用激光共聚焦顯微鏡觀察細(xì)胞活/死情況,拍照記錄。

4 結(jié)果與討論

4.1 1H-NMR分析

HBC、CS和CCS的1H-NMR結(jié)果如圖1所示。

圖1 HBC、CS和CCS的1H-NMR圖Fig.1 1H-NMR spectra of HBC, CS and CCS

HBC在δ=6.72、6.64、6.51處出現(xiàn)3個(gè)吸收峰,分別歸屬于苯環(huán)上的3個(gè)質(zhì)子,在δ=2.66和δ=2.45顯示了位置a和b 2個(gè)亞甲基上質(zhì)子的吸收峰;CS分子鏈上位置f的質(zhì)子峰在δ=3.06處出現(xiàn),而在位置g～j上的質(zhì)子峰分別對(duì)應(yīng)δ=3.61～3.80范圍內(nèi)的吸收峰,乙?；谆姆宄霈F(xiàn)在δ=1.95處。相比之下,CCS中均出現(xiàn)上述質(zhì)子峰,表明兒茶酚基團(tuán)成功接枝到CS上。

4.2 UV-Vis分析

通過UV-Vis測(cè)試分析CCS的組成,對(duì)兒茶酚基團(tuán)的接枝率進(jìn)行計(jì)算。如圖2(a)所示,不同濃度的HBC溶液在λ=280 nm處出現(xiàn)屬于苯環(huán)的吸收峰。測(cè)定不同濃度HBC溶液在λ=280 nm處的吸光度,吸光度與HBC濃度工作曲線如圖2(b)所示。測(cè)定同一濃度下不同制備參數(shù)的CCS的吸光度,計(jì)算CCS上兒茶酚基團(tuán)的接枝率。CCS中兒茶酚基團(tuán)的接枝率如表5所示。隨著HBC用量從0.15%增加到0.75%,CS能夠與更多的HBC進(jìn)行反應(yīng),接枝率從5.90%上升至11.53%。

圖2 CS和不同濃度的HBC的反應(yīng)分析Fig.2 Reaction analysis of CS and different concentrations of HBC.(a)UV-visible absorption spectra;(b)Standard operating curve of HBC

表5 CCS中兒茶酚基團(tuán)的接枝率Tab.5 Grafting rate of catechin group in CCS

4.3 抗氧化性能分析

不同接枝率與CCS質(zhì)量濃度對(duì)ABTS自由基的清除率如圖3所示。ABTS自由基清除經(jīng)過氧化鉀氧化后形成離子自由基ABTS+,加入CCS后會(huì)與ABTS+發(fā)生反應(yīng)使其還原成ABTS。在同一質(zhì)量濃度下對(duì)比CS與CCS-1～CCS-5的自由基清除率可知,CCS具有較好的清除能力(均大于CS),由此可知兒茶酚基團(tuán)具有一定的抗氧化作用;在50 μg/mL的質(zhì)量濃度下,不同接枝率的CCS-1～CCS-5樣品的清除率分別為63.82%、72.57%、88.30%、98.00%和98.29%,由此可以說明增加兒茶酚基團(tuán)能夠有效提高自由基清除率。

不同接枝率與CCS質(zhì)量濃度對(duì)超氧自由基的清除率如圖4所示。鄰苯三酚法測(cè)試CCS的超氧自由基清除能力的原理是鄰苯三酚在堿性溶液中發(fā)生氧化反應(yīng),生成超氧陰離子。CCS的超氧自由基清除能力與兒茶酚基團(tuán)的濃度成正相關(guān),通過提高兒茶酚基團(tuán)的接枝率和CCS質(zhì)量濃度的方法可以增強(qiáng)超氧自由基的清除能力,在測(cè)試范圍內(nèi)可達(dá)97.50%(CCS-5、5 mg/mL)。

4.4 組織黏附性能分析

根據(jù)水凝膠耗能黏合機(jī)制[8],高黏附性需要在強(qiáng)韌性水凝膠和黏附性橋接層的協(xié)同作用下實(shí)現(xiàn)。水凝膠黏合劑的皮膚組織黏附示意圖如圖5所示。

CCS作為橋接聚合物涂覆于水凝膠的表面,可提高水凝膠的黏附性能,兒茶酚基團(tuán)與皮膚組織上的氨基、巰基等活潑基團(tuán)逐漸發(fā)生不可逆的共價(jià)反應(yīng),增強(qiáng)長(zhǎng)期黏附力[9-10]。

不同HKUST-1質(zhì)量分?jǐn)?shù)的PAGel-H樣品的黏附力-位移曲線和黏合強(qiáng)度如圖6所示。當(dāng)HKUST-1用量為0.05%時(shí),黏附強(qiáng)度下降了0.39 kPa,而后隨著PAGel-H中HKUST-1用量增加,PAGel-H1～PAGel-H5的黏合強(qiáng)度分別為1.66、2.82、3.98、4.05和5.46 kPa,與水凝膠的拉伸強(qiáng)度成正相關(guān)。這是因?yàn)楫?dāng)水凝膠的力學(xué)性能更優(yōu)時(shí),在拉伸過程中表現(xiàn)為斷裂時(shí)所需的載荷更高。

圖6 不同PAGel-H樣品的組織黏附性能測(cè)試結(jié)果Fig.6 Test results of tissue adhesion performance of different PAGel-H samples.(a)Adhesion displacement curve; (b)Adhesion strength diagram

不同黏合界面的HA的黏附力-位移曲線和黏合強(qiáng)度如圖7所示。無界面溶液、PBS緩沖液和HBC溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)2%)界面的HA黏合強(qiáng)度較低,僅為1.60、1.19和1.39 kPa;界面的HA有所提升,黏合強(qiáng)度為2.29 kPa;CCS界面的HA最高,達(dá)到5.46 kPa。當(dāng)界面中存在CS或CCS時(shí),CS通過靜電吸引作用附著在皮膚表面,同時(shí)兒茶酚基團(tuán)可發(fā)生氧化反應(yīng)繼而形成共價(jià)連接,證明CCS作為橋接聚合物溶液能夠有效提高水凝膠黏合劑的黏合強(qiáng)度。

不同兒茶酚接枝率的HA的黏附力-位移曲線和黏合強(qiáng)度如圖8所示。隨著接枝率升高,黏合強(qiáng)度呈上升趨勢(shì),當(dāng)接枝率為5.90%(CCS-1)時(shí),其黏合強(qiáng)度僅為2.62 kPa,而接枝率提升至11.53%(CCS-5)時(shí),黏合強(qiáng)度提高至5.46 kPa。這歸因于同一CCS濃度下,增加兒茶酚基團(tuán)數(shù)能夠使HA與皮膚組織產(chǎn)生更多黏附反應(yīng)位點(diǎn),橋接聚合物可以將水凝膠牢牢地固定在皮膚上。

圖8 不同兒茶酚接枝率的HA的黏附性能測(cè)試結(jié)果Fig.8 Adhesion performance test results of HA with different catechol grafting rates.(a) Adhesion displacement curve;(b) Adhesion strength graph

不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CCS的HA的黏附力-位移曲線和黏合強(qiáng)度如圖9所示。橋接聚合物CCS質(zhì)量分?jǐn)?shù)對(duì)黏合強(qiáng)度存在一定影響。在本文實(shí)驗(yàn)用量范圍內(nèi),隨著CCS質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加,黏合強(qiáng)度先增強(qiáng)后減弱,當(dāng)質(zhì)量分?jǐn)?shù)從0.50%提高至1.25%,黏合強(qiáng)度從2.48 kPa升至5.46 kPa;然而CCS質(zhì)量分?jǐn)?shù)到達(dá)1.50%時(shí),黏合強(qiáng)度降低了1.65 kPa。這是因?yàn)楫?dāng)CCS質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低時(shí),橋接聚合物溶液的黏合強(qiáng)度較低。黏合強(qiáng)度隨著CCS質(zhì)量分?jǐn)?shù)增加而驟增,超過一定閾值后其溶液流動(dòng)性較差,反而作為一種潤(rùn)滑劑使水凝膠在皮膚上滑移。

圖9 不同質(zhì)量分?jǐn)?shù)CCS的HA的黏附性能測(cè)試結(jié)果Fig.9 Adhesion performance test results of HA with different CCS concentrations.(a) Adhesion displacement curves; (b) Adhesion strength plots

不同黏合時(shí)間的HA的黏附力-位移曲線和黏合強(qiáng)度如圖10所示。由黏合機(jī)制可知兒茶酚基團(tuán)會(huì)發(fā)生氧化并與皮膚組織上的氨基反應(yīng),因此根據(jù)黏合時(shí)間(氧化程度)的不同,黏合強(qiáng)度發(fā)生變化。隨著黏合時(shí)間增長(zhǎng),黏合強(qiáng)度明顯得到提升,可從5.46 kPa(0.5 h)提高至15.49 kPa(8 h)。

圖10 不同黏合時(shí)間的HA的黏附性能測(cè)試Fig.10 Adhesion performance test of HA with different adhesion times. (a) Adhesion displacement curve; (b)Adhesion strength graph

4.5 體外抗菌性能分析

不同水凝膠樣品的菌落涂布圖、大腸桿菌(E.coli)和金黃色葡萄球菌(S.aureus)的細(xì)菌存活率如圖11所示。根據(jù)公式計(jì)算得出在HKUST-1質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.05%、0.10%、0.15%、0.20%、0.25%時(shí),對(duì)于大腸桿菌的細(xì)菌存活率分別為20.6%、8.9%、7.8%、2.0%和1.3%,對(duì)于金黃色葡萄球菌的細(xì)菌存活率分別為25.8%、15.7%、12.5%、2.5%和1.9%。

圖11 不同水凝膠樣品的抗菌性能分析Fig.11 Analysis of antibacterial properties of different hydrogel samples. (a)Colony coating diagram of different hydrogel samples; (b)E. coli bacterial survival rate;(c) S. aureus bacterial survival rate

水凝膠的抗菌性能與細(xì)菌的接觸方式和銅離子的釋放行為有關(guān),將接種細(xì)菌后的水凝膠放置于37℃下,一部分細(xì)菌與水凝膠直接接觸并且被固定的銅離子殺死;另一部分會(huì)與隨著水分子而被擠出水凝膠外的游離的銅離子相互作用,繼而被滅活。當(dāng)增加HKUST-1用量時(shí),更多的銅離子與細(xì)菌發(fā)生生理學(xué)反應(yīng),細(xì)菌存活率逐漸下降。HA對(duì)于大腸桿菌和金黃色葡萄球菌的抗菌率分別為1.7%和1.6%,這與PAGel-H5水凝膠的實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致。

4.6 體外皮膚組織收縮性能分析

本文模仿創(chuàng)口處肌原纖維促使皮膚收縮從而加快傷口愈合的生物策略,制備具有機(jī)械活性的水凝膠黏合劑HA。該水凝膠黏合劑一方面作為物理屏障,能夠構(gòu)建一個(gè)適合傷口恢復(fù)的濕潤(rùn)微環(huán)境;另一方面可以施加足以促進(jìn)主動(dòng)傷口閉合的收縮力,使創(chuàng)面周圍的皮膚組織收縮,發(fā)揮加快傷口愈合的作用。HA的體外皮膚組織收縮示意如圖12所示。

圖12 HA的體外皮膚組織收縮示意圖Fig.12 Schematic diagram of skin tissue contraction of HA in vitro

不同水凝膠黏合劑處理后的皮膚組織和體外傷口閉合率如圖13所示。HA與PAAm-Alg+CCS對(duì)體外傷口閉合存在顯著差異,HA處理后傷口面積從9.86 mm2減小至5.03 mm2,這是因?yàn)樵贖A的溫敏自收縮性和組織黏附雙重作用下,拉動(dòng)失活的皮膚緊縮,宏觀上表現(xiàn)為創(chuàng)口面積縮減,這為HA作為機(jī)械活性水凝膠敷料提供了可能性。

4.7 體內(nèi)創(chuàng)面愈合分析

為了表征水凝膠黏合劑對(duì)于傷口愈合的影響,本文采用大鼠背部缺損模型進(jìn)行動(dòng)物實(shí)驗(yàn),減弱大鼠傷口周圍皮膚因愈合而主動(dòng)收縮的影響,實(shí)驗(yàn)結(jié)果如圖14所示。

注:“*”代表實(shí)驗(yàn)組與PBS對(duì)照組存在顯著性差異,P<0.05。圖14 水凝膠黏合劑對(duì)于傷口愈合的影響圖Fig.14 Influence of hydrogel adhesive on wound healing.(a)Photographs of rat wound treated with different adhesives on 0d, 1d,3d, 5d, 8d, 11d and 14d; (b) Internal wound closure; (c)Photographs of rat wound in the initial coverage phase

由圖14(a)(b)可知,實(shí)驗(yàn)中大鼠傷口大小均隨著時(shí)間逐漸縮小,手術(shù)后第1 d,所有傷口均出現(xiàn)炎癥;除PBS緩沖液處理的傷口外,其余3組經(jīng)水凝膠黏合劑貼敷的傷口都保持濕潤(rùn)。在第3 d,經(jīng)PAAm-Alg+CCS、PAGel+CCS和HA處理后的創(chuàng)面愈合率分別為21.36%、25.28%和30.82%,均大于PBS緩沖液處理的傷口(7.93%),表明通過在水凝膠黏合劑中引入銅離子和溫度響應(yīng)網(wǎng)絡(luò)的2種方法都有利于修復(fù)損傷創(chuàng)面。

銅離子的釋放降低創(chuàng)面?zhèn)诒患?xì)菌感染的風(fēng)險(xiǎn),誘導(dǎo)血管生成,促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌生長(zhǎng)因子(VEGF)[10];具有機(jī)械活性的水凝膠黏合劑能夠施加一個(gè)主動(dòng)收縮傷口附近皮膚的機(jī)械力加快愈合的能力。

此外,可在覆蓋初期階段評(píng)價(jià)水凝膠的機(jī)械活性(圖14(c))。在冷敷結(jié)束后0.5 h,水凝膠黏合劑逐漸變白,結(jié)合上述創(chuàng)面愈合率的分析,共同說明了具有機(jī)械活性的水凝膠黏合劑在貼合過程中,能夠感應(yīng)溫度而發(fā)生相轉(zhuǎn)變行為,證明HA水凝膠黏合劑能夠通過主動(dòng)收縮皮膚的方式促進(jìn)傷口愈合。

不同黏合劑處理后第3、8和14 d組織染色照片如圖15所示。在手術(shù)后第3 d,所有染色組織中均觀察到不同程度的中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)現(xiàn)象,此時(shí)傷口處于炎癥期。經(jīng)PBS處理的傷口中可以觀察到80%以上數(shù)量的中性粒細(xì)胞,表明傷口發(fā)炎嚴(yán)重,而經(jīng)PAAm-Alg+CCS和HA處理后的傷口中性粒細(xì)胞數(shù)量不到20%,這歸因于水凝膠的HKUST-1的抗菌效果。在第8 d,可以看到實(shí)驗(yàn)組的創(chuàng)面出現(xiàn)少量成纖維細(xì)胞和膠原纖維,其中經(jīng)HA處理的傷口顯示出相對(duì)均勻和密集的膠原纖維,這說明HA可以促進(jìn)肉芽組織的形成和傷口的再上皮化。在手術(shù)后14 d,所有創(chuàng)面均愈合良好。上述結(jié)論進(jìn)一步證實(shí)了HA可作為傷口敷料促進(jìn)傷口愈合。

圖15 不同黏合劑處理第3、8和14 d組織染色照片F(xiàn)ig.15 Photographs of HA staining tissue treated with different adhesives on 3 d, 8 d and 14 d

4.8 細(xì)胞相容性分析

由CCK-8法測(cè)定樣品浸提液與L929細(xì)胞共同培養(yǎng)第1、4和7 d的OD值,其結(jié)果如圖16(a)所示,所有樣品在4和7 d的OD值均出現(xiàn)明顯上升,這說明樣品并未對(duì)L929細(xì)胞的增殖行為造成顯著影響,其細(xì)胞毒性較低。此外,在激光共聚焦顯微鏡觀察下的細(xì)胞活/死染色情況(如圖16(b)所示),其中綠色斑點(diǎn)為活細(xì)胞,紅色斑點(diǎn)為死細(xì)胞。不同樣品與L929細(xì)胞共同培養(yǎng)96 h后活細(xì)胞明顯增多,L929細(xì)胞能夠在樣品的影響下維持正常的生理活動(dòng),這同樣說明樣品的細(xì)胞毒性較低,與CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。綜上所述,生物相容性良好的PAGel-H水凝膠和CCS能夠?yàn)閼?yīng)用于創(chuàng)口醫(yī)用敷料的水凝膠黏合劑提供低毒性的愈合環(huán)境。

注:“*”代表實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組存在顯著性差異,P<0.05。圖16 生物相容性分析圖Fig.16 Biocompatibility analysis diagram.(a)OD values of L929 cells cultured with PAGel, PAGel H, and CCS on 1d, 4 d and 7 d;(b)Cell viability/mortality staining photos on 1 d and 4 d of culture

5 結(jié) 論

本文通過偶聯(lián)法制備殼聚糖-g-兒茶酚(CCS),并且以聚N-異丙基丙烯酰胺(PNIPAm)和海藻酸鈣(Alg)為主要網(wǎng)絡(luò)的HKUST-1負(fù)載的抗菌活性溫敏性交聯(lián)互穿水凝膠(PAGel-H)為基體,通過涂布法制備水凝膠黏合劑(HA),測(cè)試和表征結(jié)果表明:

①1H-NMR譜圖中顯示了官能團(tuán)的特征質(zhì)子峰,證明CCS已經(jīng)成功合成;根據(jù)UV-Vis譜圖中吸光度的差異,計(jì)算出HBC質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.15%、0.30%、0.45%、0.60%、0.75%時(shí),兒茶酚基團(tuán)在CCS結(jié)構(gòu)上的接枝率分別為5.90%、6.44%、8.37%、10.4%、11.53%;CCS的抗氧化能力均隨著CCS濃度和兒茶酚基團(tuán)接枝率的提高而增強(qiáng)。

②CCS作為橋接聚合物溶液可有效提升水凝膠皮膚黏合強(qiáng)度,同時(shí)分別提高水凝膠基體的強(qiáng)度、兒茶酚接枝率和黏合時(shí)間可對(duì)皮膚黏附性能起促進(jìn)作用。

③PAGel-H具有明顯的抗菌效果,當(dāng)HKUST-1負(fù)載量增加時(shí),抑菌圈直徑逐漸擴(kuò)大,細(xì)菌存活率逐漸下降;在37℃下HA水凝膠黏合劑能夠發(fā)生自收縮現(xiàn)象,同時(shí)可以施加致使皮膚收緊的收縮力,在大鼠背部缺損模型中,經(jīng)水凝膠黏合劑處理后的創(chuàng)面所需愈合天數(shù)最少(11 d),愈合速率最快;PAGel、PAGel-H和CCS的吸光度(OD)值均隨著時(shí)間而上升,說明負(fù)載HKUST-1的PAGel-H和CCS的細(xì)胞毒性較弱。