馬振龍, 陶奕文, 趙亞琦, 宋 柳, 郭華榮,2??

(1. 中國海洋大學(xué)海洋生命學(xué)院, 海洋生物遺傳與育種教育部重點實驗室, 山東 青島 266003;2. 中國海洋大學(xué)海洋生物進(jìn)化與多樣性研究所, 山東 青島 266003)

病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移技術(shù)具有毒性小、致死率低、操作簡單和轉(zhuǎn)移效率高等優(yōu)點[1]。其中,哺乳動物病毒介導(dǎo)的有逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒、腺病毒和腺相關(guān)病毒表達(dá)系統(tǒng),昆蟲病毒介導(dǎo)的有昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)。根據(jù)病毒是否具囊膜,上述病毒又可分為兩類:腺病毒和腺相關(guān)病毒為不具囊膜病毒,病毒的衣殼是裸露的,衣殼蛋白決定了病毒的宿主專一性;而逆轉(zhuǎn)錄病毒、慢病毒和昆蟲桿狀病毒的最外層由囊膜包被,為具囊膜病毒,其囊膜蛋白在病毒侵染宿主細(xì)胞的過程中發(fā)揮識別和結(jié)合宿主受體的作用,決定著病毒侵染的宿主范圍及組織和細(xì)胞的特異性[2]。有研究表明,一種病毒的囊膜中可以插入其他病毒的囊膜蛋白,這種插入了另一種病毒囊膜蛋白的病毒被稱為假型病毒,假型病毒往往因為引入了其他病毒的囊膜蛋白而改變了其本身的宿主親嗜性[3]。本實驗室Pu等[4]最早通過共轉(zhuǎn)染的方法,將對蝦白斑綜合征病毒(WSSV)的囊膜蛋白VP19和VP28引入到逆轉(zhuǎn)錄病毒的囊膜中,發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的假型逆轉(zhuǎn)錄病毒具有了對蝦細(xì)胞親嗜性,可以感染對蝦原代培養(yǎng)血淋巴細(xì)胞,但是感染效率不高。隨后,本實驗室Chen等[5]采用類似的方法將VP19和VP28引入到慢病毒的囊膜中,發(fā)現(xiàn)所構(gòu)建的假型慢病毒可以感染對蝦原代培養(yǎng)血淋巴細(xì)胞和淋巴(Oka)器官原代培養(yǎng)細(xì)胞,感染和表達(dá)效率明顯優(yōu)于逆轉(zhuǎn)錄病毒。但上述兩種假型病毒在對蝦細(xì)胞中的感染和表達(dá)效率仍遠(yuǎn)低于哺乳動物細(xì)胞。與哺乳動物相比,昆蟲和對蝦的親緣關(guān)系更近,本實驗室Wu等[6]采用類似的方法,將對蝦WSSV病毒囊膜蛋白VP28引入昆蟲重組桿狀病毒(Bacmid-GUS)的囊膜中,發(fā)現(xiàn)VP28可以顯著提高上述桿狀病毒的包裝效率及其在對蝦中的親嗜性,尤其是對蝦成體組織,在幾乎所有染毒對蝦的組織中均可檢測到β-葡萄糖苷酸酶基因(GUS)的表達(dá),但是具有明顯的組織特異性。本文作者推測,VP28-假型昆蟲桿狀病毒所表現(xiàn)的對蝦組織特異性可能與VP28的引入有關(guān),但是VP28對于上述假型病毒的對蝦組織特異性的貢獻(xiàn)有多大以及對蝦WSSV病毒其他囊膜蛋白是否有相似的貢獻(xiàn)尚不清楚。

VP19和VP24是對蝦WSSV病毒另外兩種重要的囊膜蛋白。VP19蛋白由121個氨基酸組成,存在兩個跨膜結(jié)構(gòu)域,可錨定在WSSV囊膜中發(fā)揮作用[7]。在病毒中和實驗中,抗rVP19血清可顯著降低WSSV感染對蝦的死亡率,表明VP19可能在對蝦的感染中起重要作用[8-9]。Pu等[4]和Chen等[5]將VP19分別引入到逆轉(zhuǎn)錄病毒和慢病毒表達(dá)系統(tǒng)中發(fā)現(xiàn),兩種方式均明顯提高了假型病毒對對蝦細(xì)胞的親嗜性。因此,本文作者關(guān)注到VP19對于假型昆蟲桿狀病毒(Bacmid-GUS/VP19)的對蝦組織特異性的貢獻(xiàn)如何這一問題。VP24蛋白含有208個氨基酸,其N端存在一段跨膜結(jié)構(gòu)[10]。Niu等[11]發(fā)現(xiàn)對蝦MarsupenaeusjaponicuspIgR是一種WSSV受體,與囊膜蛋白VP24相互作用,WSSV可通過pIgR-CaM-網(wǎng)格蛋白的內(nèi)吞途徑進(jìn)入對蝦細(xì)胞。有研究表明,斑節(jié)對蝦細(xì)胞表面的幾丁質(zhì)結(jié)合蛋白(PmCBP)可以與VP24結(jié)合,促使WSSV進(jìn)入對蝦細(xì)胞內(nèi)[12]。因此,VP24成為本研究第二個關(guān)注的對蝦WSSV囊膜蛋白。Syed Musthaq等[13]構(gòu)建了對蝦WSSV囊膜蛋白VP28的重組桿狀病毒表達(dá)載體,發(fā)現(xiàn)過表達(dá)的VP28蛋白定位于昆蟲包裝細(xì)胞的細(xì)胞膜上,為VP28可被引入重組桿狀病毒的囊膜上提供了直接的實驗證據(jù)。而將VP19和VP24引入假型昆蟲桿狀病毒時是否也能定位于昆蟲包裝細(xì)胞的細(xì)胞膜上,是否也可以提高假型病毒的包裝效率以及其對于假型病毒的對蝦組織特異性的貢獻(xiàn)如何,尚不清楚。

因此,為了探究VP28以及另外兩種囊膜蛋白VP19和VP24對該假型重組桿狀病毒的對蝦組織特異性的貢獻(xiàn),本研究擬通過共轉(zhuǎn)染的方法分別將上述3種對蝦病毒囊膜蛋白引入到昆蟲桿狀病毒(Bacmid-GUS)的囊膜中,然后比較上述3種假型病毒的包裝效率及其在對蝦中的組織特異性,并進(jìn)一步分析上述3種囊膜蛋白在包裝細(xì)胞(Sf9)中的亞細(xì)胞定位。本研究成果將拓展人們對于對蝦WSSV病毒囊膜蛋白的生物學(xué)功能的認(rèn)知,并為假型昆蟲桿狀病毒介導(dǎo)的基因轉(zhuǎn)移與表達(dá)系統(tǒng)的構(gòu)建及其在對蝦活體基因轉(zhuǎn)移中的應(yīng)用提供指導(dǎo)。

1 材料與方法

1.1 對蝦和小龍蝦

健康的刀額新對蝦(Metapenaeusensis),體質(zhì)量為15～20 g,體長為10～15 cm,購自山東省青島市南山水產(chǎn)品市場,于過濾的充氣海水中暫養(yǎng),每日換水1次,禁食,用于病毒感染實驗。

克氏原螯蝦(Procambarusclarkii)又稱小龍蝦,體質(zhì)量為20～25 g,體長為13～20 cm,購自山東省青島市南山水產(chǎn)品市場,于淺層的曝氣自來水中暫養(yǎng)。取感染W(wǎng)SSV致死的凍存小龍蝦的肌肉組織,制備病毒粗提液,以肌肉注射的方式感染小龍蝦,制備WSSV染毒小龍蝦,用于提取WSSV全基因組。

1.2 Sf9細(xì)胞

Sf9細(xì)胞系來源于草地貪夜蛾(Spodopterafrugiperda)的卵巢組織,復(fù)蘇后置于含10%胎牛血清(FBS)的SIM培養(yǎng)基(Sino biological公司)中,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng),每隔2～3 d傳代一次,用于桿狀病毒的包裝和滴度測定。

1.3 表達(dá)質(zhì)粒

基礎(chǔ)質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His購自Invitrogen公司,克隆質(zhì)粒pMD19-T購自TaKaRa公司,表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VP19、pcDNA3.1-VP28、pcDNA3.1-VP28-△TAA/mCherry和昆蟲桿狀病毒GUS報告基因重組表達(dá)質(zhì)粒Bacmid-GUS為實驗室前期構(gòu)建[4,6]。

表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VP24的構(gòu)建方法如下:根據(jù)對蝦WSSV病毒囊膜蛋白VP24的開放閱讀框(ORF)序列設(shè)計特異性引物,并在引物兩端加上酶切位點EcoRⅠ和BamHⅠ,引物序列見表1。WSSV染毒小龍蝦的肌肉組織總DNA的提取采用TIANamp Genomic DNA Kit試劑盒(TianGen公司),利用超微量分光光度計和瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA的質(zhì)量和濃度。以WSSV染毒小龍蝦的肌肉組織總DNA基因組為模板,使用Premix TaqTM試劑盒(TaKaRa公司)擴(kuò)增VP24基因的編碼框,PCR產(chǎn)物凝膠電泳,切膠回收并與克隆載體pMD19-T連接,測序驗證后,利用EcoR Ⅰ和BamHⅠ雙酶切,將VP24基因片段定向插入表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1/V5-His,構(gòu)建pcDNA3.1-VP24重組表達(dá)質(zhì)粒。

表1 PCR引物Table 1 PCR primers used in this study

為驗證對蝦病毒囊膜蛋白(VP19和VP24)在包裝細(xì)胞(Sf9)中的亞細(xì)胞定位,本文進(jìn)一步構(gòu)建了紅色熒光蛋白(mCherry)標(biāo)記的VP19囊膜蛋白的融合表達(dá)重組質(zhì)粒:pcDNA3.1-VP19-△TAA/mCherry,以及綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記的VP24囊膜蛋白融合表達(dá)重組質(zhì)粒:pcDNA3.1-VP24-△TAA/eGFP,所用引物序列見表1。其中,mCherry和eGFP均標(biāo)記在上述2個囊膜蛋白的羧基端(C端),并分別刪除了其前面的囊膜蛋白的終止密碼子(△TAA)。將無終止密碼子的VP19和VP24基因片段分別插入到BamHⅠ和EcoRⅠ 之間,將mCherry和eGFP報告基因片段分別插入到其后的EcoRⅠ和NotⅠ之間。

上述以pcDNA3.1/V5-His為基礎(chǔ)質(zhì)粒的重組表達(dá)質(zhì)粒的純化采用FastPure EndoFree Plasmid Maxi Kit試劑盒(諾唯贊生物公司)。Bacmid-GUS重組質(zhì)粒的純化采用PureLinkTMHiPure Plasmid DNA Purification Kits試劑盒(Invitrogen公司),直接從Bacmid-GUS重組菌株DH10BacTM中提取[6]。所使用的溶菌肉湯(LB)液體培養(yǎng)基中含50 μg/mL卡那霉素、7 μg/mL慶大霉素和10 μg/mL四環(huán)素。各種表達(dá)質(zhì)粒凍存于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.4 3種假型昆蟲桿狀病毒的包裝、濃縮和純化

3種假型昆蟲桿狀病毒的包裝、濃縮和純化參照Wu等[6]的方法進(jìn)行,采用了Wu等[6]所報道的VP28-假型桿狀病毒包裝時的最佳共轉(zhuǎn)染條件,包括囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒與昆蟲桿狀病毒表達(dá)質(zhì)粒(Bacmid-GUS)的共轉(zhuǎn)染比例為3∶1,轉(zhuǎn)染試劑(L)∶質(zhì)粒(g)=5∶1,以及轉(zhuǎn)染后第5天收集病毒等。其中,3種對蝦WSSV囊膜蛋白(VP19、VP24和VP28)對于假型桿狀病毒的包裝效率的影響實驗在48孔細(xì)胞培養(yǎng)板中進(jìn)行,分別比較了其在最佳轉(zhuǎn)染條件和非最佳轉(zhuǎn)染條件下的包裝效率。具體方法如下:將Sf9細(xì)胞均勻接種到48孔板中,待細(xì)胞鋪板率達(dá)到80%～90%時,采用Cellfectin Ⅱ Reagent(Gibco公司)進(jìn)行轉(zhuǎn)染。其中,最佳轉(zhuǎn)染條件為:于1.5 mL離心管中,在終體積為200 μL的無血清無抗生素的Grace昆蟲培養(yǎng)基(供應(yīng)商:Gibco公司)中溶解0.375 μg Bacmid-GUS重組質(zhì)粒、0.125 μg囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VP19(或pcDNA3.1-VP24,或pc-DNA3.1-VP28)和2.5 μL Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑,混勻,室溫孵育30 min;棄除舊培養(yǎng)基,將200 μL/孔上述脂質(zhì)體-DNA復(fù)合物加入到48孔板中,于28 ℃培養(yǎng)4～5 h后,更換培養(yǎng)液為含10% FBS的SIM培養(yǎng)基;繼續(xù)孵育5 d后,進(jìn)行X-gluc染色,檢測GUS基因的表達(dá)。與此不同的是,非最佳轉(zhuǎn)染條件為:每孔0.15 μg Bacmid-GUS重組質(zhì)粒、0.05 μg囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒和1 μL CellfectinⅡ轉(zhuǎn)染試劑,其他條件同上。

GUS基因的表達(dá)產(chǎn)物為β-葡萄糖苷酸酶,是一個水解酶,X-gluc(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-葡萄糖苷酸)是該酶的水解底物,可被該酶水解產(chǎn)生無色的吲哚氧基中間產(chǎn)物,吲哚氧基中間產(chǎn)物可被進(jìn)一步氧化成為藍(lán)色沉淀,沉積于組織和細(xì)胞的原位,因而可根據(jù)X-gluc染色的結(jié)果來檢測GUS基因的表達(dá)。X-gluc染色方法:首先棄除舊培養(yǎng)基,每孔加200 μL PBS溶液(8 mg/mL NaCl、0.2 mg/mL KCl、3 mg/mL Na2HPO4(12H2O和0.2 mg/mL KH2PO4,pH=6.8)洗滌1次;其次加125 μL固定液,固定5 min,用PBS洗滌2次;然后加入125 μL X-gluc細(xì)胞染液(含1 mg/mL X-gluc、5 mmol/L K3Fe(CN)6、5 mmol/L K4Fe(CN)6和2 mmol/L MgCl2的PBS溶液)[6],孵育過夜;最后第二天棄染液,用PBS洗滌1次,加500 μL PBS后,觀察拍照。

3種假型病毒:Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28的包裝實驗在直徑10 cm的細(xì)胞培養(yǎng)皿內(nèi)進(jìn)行,采用前面提及的最佳轉(zhuǎn)染條件,不同的是,在終體積為500 μL的無血清無抗生素的Grace培養(yǎng)基中溶解15 μg Bacmid-GUS質(zhì)粒、5 μg pcDNA3.1-VP19(或pcDNA3.1-VP24,或pcDNA3.1-VP28)表達(dá)質(zhì)粒以及100 μL Cellfectin Ⅱ轉(zhuǎn)染試劑。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)孵育5 d后,收集細(xì)胞培養(yǎng)基上清,離心去除細(xì)胞碎片,獲得P1代病毒上清;將6個直徑10 cm細(xì)胞培養(yǎng)皿中分別接種上400 μL P1代病毒上清,感染5 d后,收集所有培養(yǎng)基上清并離心,獲得P2代病毒上清。

病毒的濃縮方法如下:用0.45 μm濾膜過濾收集到的P2代病毒上清,并轉(zhuǎn)移到超速離心管中;在離心管底部加入25%的蔗糖溶液,于4 ℃下80 000g離心75 min,進(jìn)行病毒的濃縮和純化,加入100 μL的無菌PBS溶液重懸病毒顆粒,分裝儲存于-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

濃縮后的假型病毒的滴度測定方法如下:將Sf9細(xì)胞接種到96孔板,待細(xì)胞密度達(dá)到80%～90%時,分別接種經(jīng)無血清無抗生素的SIM培養(yǎng)基梯度稀釋(10-1～10-8)的假型昆蟲桿狀病毒:Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28,每孔添加100 μL病毒稀釋液,于28 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)5 d后,進(jìn)行X-gluc染色,檢測GUS基因的表達(dá)。轉(zhuǎn)導(dǎo)單位(TU)指可以感染并進(jìn)入到靶細(xì)胞中的病毒基因組數(shù)。病毒滴度(TU/mL)=陽性細(xì)胞百分?jǐn)?shù)×細(xì)胞總數(shù)×稀釋倍數(shù)/病毒稀釋液體積(mL)。

1.5 囊膜蛋白VP19、VP24和VP28在包裝細(xì)胞Sf9中的細(xì)胞膜定位

將Sf9細(xì)胞接種到12孔培養(yǎng)板中的細(xì)胞爬片上,待細(xì)胞鋪板率達(dá)到70%～80%時,將Bacmid-GUS分別同pcDNA3.1-VP19-△TAA/mCherry、pcDNA3.1-VP24-△TAA/eGFP和pcDNA3.1-VP28-△TAA/mCherry按照最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件共轉(zhuǎn)染到Sf9細(xì)胞中。轉(zhuǎn)染96 h后在激光共聚焦顯微鏡下觀察上述3種融合表達(dá)的囊膜蛋白在細(xì)胞中的表達(dá)并拍照。

1.6 3種假型昆蟲桿狀病毒感染對蝦成體

根據(jù)3種假型昆蟲桿狀病毒的滴度來確定其在對蝦成體組織中的最高和最低注射劑量,如表2所示。對照組對蝦注射PBS溶液,實驗組分別注射三種假型病毒。采用肌肉注射的感染方式,注射部位為第一、二腹足之間。注射完畢后,摁壓針眼10 s左右以防止病毒溶液漏出。感染5 d后,分別取染毒對蝦的心臟、Oka器官、腸、鰓和肌肉組織,置于1.5 mL EP管中;然后加入X-gluc組織染液(1 mol/L磷酸鈉緩沖液、0.5 mol/L Na2EDTA、10% Triton X-100、50 mmol/L K3Fe(CN)6和50 mg/mL X-gluc)[6],浸沒組織;置于37 ℃培養(yǎng)箱孵育12 h,棄除染液,加PBS洗滌后,于體視顯微鏡下觀察并拍照。

表2 3種假型病毒在對蝦成體組織中的注射劑量Table 2 The injection doses of three pseudotyped viruses in adult shrimps

為了檢測假型病毒在對蝦組織中是否具有復(fù)制和增殖能力,選擇上述3種假型昆蟲桿狀病毒的最大劑量感染對蝦,取GUS表達(dá)陽性的組織進(jìn)行透射電鏡分析。其中,假型病毒Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28的對單個對蝦最大劑量分別是1×109、1×109和1×1011個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,前2種假型病毒的GUS表達(dá)陽性組織為心臟和肌肉,另外一種假型病毒的GUS表達(dá)陽性組織為心臟、鰓和肌肉。分別取大小為1～2 mm3的組織塊,于4 ℃預(yù)冷的2.5%戊二醛固定液中4 ℃固定12 h,然后送至青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院進(jìn)行透射電子顯微鏡分析和觀察。

1.7 統(tǒng)計學(xué)分析

所有實驗至少重復(fù)3次。應(yīng)用軟件Image J計算3種假型昆蟲桿狀病毒在Sf9細(xì)胞中的感染與表達(dá)效率。陽性GUS信號的百分比通過以下公式計算:

(具有GUS信號的陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù))×100%。

采用SPSS軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析。

2 實驗結(jié)果

2.1 真核表達(dá)載體pcDNA3.1-VP24的構(gòu)建

如圖1所示,成功擴(kuò)增得到對蝦WSSV囊膜蛋白VP24基因的編碼框,大小位于500～750 bp之間,符合預(yù)期(見圖1A)。測序結(jié)果如圖1C所示,VP24擴(kuò)增片段與WSSV印度株的VP24基因序列一致(見圖1D)。這表明含VP24的表達(dá)質(zhì)粒:pcDNA3.1-VP24已構(gòu)建成功(見圖1B)。

(A. VP24基因的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的凝膠電泳結(jié)果。其中:泳道M為Trans2K Plus DNA maker;泳道1和2均為VP24擴(kuò)增產(chǎn)物。B. pcDNA3.1-VP24的質(zhì)粒圖譜。C. VP24基因的測序結(jié)果。其中下劃線分別代表酶切位點BamHⅠ和EcoRⅠ。方框標(biāo)出起始密碼子(ATG)和終止密碼子(TAA)。D. 2種VP24基因的同源比對結(jié)果。VP24:PCR擴(kuò)增片段。VP24-Ⅰ:WSSV印度株(GenBank No. DQ681068.1)。A. The agarose gel electrophoresis analysis of PCR products of VP24 gene. Lane M: Trans2K Plus DNA maker. Lanes 1 and 2: PCR products of VP24 gene. B. The plasmid map of pcDNA3.1-VP24. C. sequence analysis of VP24 gene. The endonuclease cleavage sites of BamHⅠ and EcoRⅠ are underlined. The initiation codon (ATG) and termination codon (TAA) are boxed. D. the alignment result of two nucleic acid sequences of VP24 gene. VP24, the sequence of amplified VP24 gene in this study. VP24-Ⅰ, the sequence of VP24 gene of the Indian strain (GenBank No. DQ681068.1).)

2.2 3種對蝦病毒囊膜蛋白對假型昆蟲桿狀病毒包裝效率的影響

如圖2A1—F1所示,在最佳轉(zhuǎn)染條件下,Bacmid-GUS重組表達(dá)質(zhì)粒單獨轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率為(85.7±3.4)%,而Bacmid-GUS分別同3種對蝦病毒囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-VP19、pcDNA3.1-VP24和pcDNA3.1-VP28共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率分別為(90.7±0.3)%、(87.3±1)%和(85±1)%。由于GUS報告基因的表達(dá)效率同病毒的包裝效率正相關(guān),因此,上述結(jié)果提示,同非假型病毒Bacmid-GUS相比,上述3種假型病毒的包裝效率沒有得到明顯提高。換言之,在最佳轉(zhuǎn)染條件下對蝦病毒3種囊膜蛋白(VP19、VP24和VP28)對其假型病毒(Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28)的包裝效率沒有明顯的促進(jìn)作用。

(A1—F1為最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染結(jié)果,即Bacmid-GUS質(zhì)粒為0.375 μg/孔。A2—F2為非最佳轉(zhuǎn)染條件下的轉(zhuǎn)染結(jié)果,即Bacmid-GUS質(zhì)粒為0.15 μg/孔。A1和A2分別為不加Bacmid-GUS質(zhì)粒的陰性對照。B1和B2為Bacmid-GUS單獨轉(zhuǎn)染結(jié)果。C1和C2為Bacmid-GUS與pcDNA3.1-VP19共轉(zhuǎn)染結(jié)果。D1和D2為Bacmid-GUS與pcDNA3.1-VP24共轉(zhuǎn)染結(jié)果。E1和E2為Bacmid-GUS與pcDNA3.1-VP28共轉(zhuǎn)染結(jié)果。F1為B1—E1的轉(zhuǎn)染效率的柱狀圖。F2為B2—E2的轉(zhuǎn)染效率柱狀圖。轉(zhuǎn)染效率為平均值(標(biāo)準(zhǔn)誤(n=9)。表示差異顯著,單因素方差分析,P<0.05。標(biāo)尺,100 μm。Panels A1 to F1 are the results obtained under the optimal co-transfection condition, the amount of Bacmid-GUS plasmid used is 0.375 μg/well. Panels A2 to F2 are the results obtained under non-optimal transfection condition, the amount of Bacmid-GUS plasmid used is 0.15 μg/well. Panels A1 and A2, the un-transfected control Sf9 cells. Panels B1 and B2: The Sf9 cells transfected by Bacmid-GUS. Panels C1 and C2, the Sf9 cells co-transfected by Bacmid-GUS and pcDNA3.1-VP19. Panels D1 and D2: The Sf9 cells co-transfected by Bacmid-GUS and pcDNA3.1-VP24. Panels E1 and E2: The Sf9 cells co-transfected by Bacmid-GUS and pcDNA3.1-VP28. Panels F1 shows the corresponding packaging efficiencies of Panels B1 to E1. F2 shows the corresponding packaging efficiencies of panels B2 to E2. Data for transfection efficiency is expressed as average(standard error (n=9). represents significant difference, One-way ANOVA, P<0.05. Scale bar, 100 μm.)

考慮到在最優(yōu)轉(zhuǎn)染條件下GUS轉(zhuǎn)染效率過高,可能會掩蓋上述3種對蝦病毒囊膜蛋白對假型病毒包裝效率的促進(jìn)作用。因此,本文又進(jìn)一步比較了非最佳轉(zhuǎn)染條件下GUS轉(zhuǎn)染效率,即將Bacmid-GUS質(zhì)粒的量降低為0.15 μg/孔。結(jié)果發(fā)現(xiàn),如圖2A2—F2所示,Bacmid-GUS的單獨轉(zhuǎn)染效率為(43.3±3.1)%,而Bacmid-GUS同pcDNA3.1-VP19、pcDNA3.1-VP24和pcDNA3.1-VP28的共轉(zhuǎn)染效率分別為(57.4±6.2)%、(54.8±3.4)%和(55.0±4.0)%?？梢?同Bacmid-GUS昆蟲桿狀病毒相比,上述3種假型病毒Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28的包裝效率分別提高了14.1%、11.5%和11.7%,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。這表明,對蝦病毒3種囊膜蛋白(VP19、VP24和VP28)對3種假型病毒的包裝效率具有明顯的促進(jìn)作用。但是其促進(jìn)包裝的具體機(jī)制尚不清楚。

2.3 過表達(dá)囊膜蛋白(VP19、VP24和VP28)在包裝細(xì)胞Sf9中的亞細(xì)胞定位

如圖3所示,將紅色熒光蛋白(mCherry)或綠色熒光蛋白(eGFP)標(biāo)記的VP19、VP24和VP28融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-VP19-△TAA/mCherry、pcDNA3.1-VP24-△TAA/eGFP和pcDNA3.1-VP28-△TAA/mCherry)分別同Bacmid-GUS質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞Sf9中,均可在感染后細(xì)胞中檢測到明亮的紅色或綠色熒光信號,這表明本研究新構(gòu)建的VP19-mCherry融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-VP19-△TAA/mCherry)和VP24-eGFP融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-VP24-△TAA/eGFP)以及實驗室前期構(gòu)建的VP28-mCherry融合蛋白表達(dá)質(zhì)粒(pcDNA3.1-VP28-△TAA/mCherry)均是成功的。激光共聚焦顯微鏡觀察結(jié)果表明,紅色熒光信號(VP19和VP28)與綠色熒光信號(VP24)的分布呈明顯的環(huán)狀,位于細(xì)胞核之外?？梢?3種融合表達(dá)囊膜蛋白主要定位于Sf9細(xì)胞的細(xì)胞膜上。

2.4 3種假型昆蟲桿狀病毒的滴度測定結(jié)果

將濃縮純化后的Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28三種假型病毒分別感染Sf9細(xì)胞,然后X-gluc染色檢測GUS基因的表達(dá),結(jié)果如圖4所示,上述3種假型病毒的單位體積(mL)滴度分別為1.3×1013、9.5×1010和1.2×1011個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。

(A、B和C為未感染病毒的Sf9細(xì)胞(對照),A′、B′和C′分別為假型病毒Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28感染Sf9細(xì)胞的GUS表達(dá)結(jié)果。標(biāo)尺:100 μm。Panels A, B and C, the uninfected Sf9 cells (control). Panels A′, B′ and C′, GUS expression results of the Sf9 cells infected by pseudotyped baculoviruses of Bacmid-GUS/VP19, Bacmid-GUS/VP24 and Bacmid-GUS/VP28, respectively. Scale bar: 100 μm.)

2.5 3種假型昆蟲桿狀病毒感染對蝦成體組織的結(jié)果

將3種假型病毒(Bacmid-GUS/VP19、Bacmid-GUS/VP24和Bacmid-GUS/VP28)以不同的注射劑量感染成體對蝦,5 d后分別取染毒對蝦的心臟、Oka器官、腸、鰓和肌肉組織于1.5 mL EP管中,以進(jìn)行X-gluc染色以檢測GUS報告基因的表達(dá),結(jié)果如圖5—7所示。結(jié)果表明,攜帶不同囊膜蛋白的假型病毒在感染對蝦成體時具有不同的最低感染劑量和不同的組織特異性。其中,心臟組織中有弱的GUS本底表達(dá),而所檢測的其他組織中則沒有GUS本底表達(dá)。

假型病毒Bacmid-GUS/VP19的包裝效率和病毒滴度是最高的,因而對單個對蝦的最高染毒劑量可達(dá)到1×1011個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。其感染結(jié)果如圖5所示,該假型病毒只能感染對蝦的心臟和肌肉組織,不能感染Oka器官、腸和鰓組織,具有明顯的組織特異性。但是其單個對蝦感染劑量在1×108個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位時,染毒對蝦心臟組織的GUS陽性信號才明顯高于對照組織;而單個對蝦肌肉組織的感染劑量則需要達(dá)到1×1011個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位時才能檢測到GUS信號。

假型病毒Bacmid-GUS/VP24的滴度是最低的,因而其對單個對蝦的最高染毒劑量只能達(dá)到1×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,感染結(jié)果如圖6所示,該假型病毒與Bacmid-GUS/VP19相似,也是只能感染對蝦的心臟和肌肉組織,不感染Oka器官、腸和鰓組織,具有明顯的組織特異性。但是其在單個對蝦心臟中的最低感染劑量為1×107個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,在單個對蝦肌肉組織中的最低感染劑量為1×108個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。

假型病毒Bacmid-GUS/VP28的滴度介于前述兩種假型病毒之間,其個體最高染毒劑量也只能達(dá)到1×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,感染結(jié)果如圖7所示,與前述VP19和VP24兩種假型病毒的組織特異性不同,該假型病毒不僅能夠感染對蝦的心臟和肌肉組織,還可以感染鰓組織,但是不能感染淋巴器官和腸組織。而且其對單個對蝦的最低感染劑量,在心臟組織中為1×107個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,在鰓組織中為1×108個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,在肌肉組織中為1×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。

(同圖6圖注)

綜上所述,上述假型病毒在成體對蝦中具有不同的組織特異性和不同的最低感染劑量。

2.6 假型昆蟲桿狀病毒在對蝦成體組織中的感染是復(fù)制缺陷的

上述3種假型病毒感染陽性的對蝦成體組織的透射電鏡分析結(jié)果如圖8所示。結(jié)果表明,在染毒和未染毒對蝦的肌肉、心臟和鰓組織中均沒有觀察到假型桿狀病毒顆粒。僅在感染了假型病毒Bacmid-GUS/VP28的鰓組織細(xì)胞內(nèi),觀察到有異常的圓形結(jié)構(gòu),直徑大約為90 nm(見圖8B3),以及感染假型病毒Bacmid-GUS/VP24的心臟組織細(xì)胞內(nèi)觀察到有不規(guī)則的線性結(jié)構(gòu),長度為100～400 nm(見圖8C2)。這說明同哺乳動物細(xì)胞中的感染結(jié)果相似,假型昆蟲桿狀病毒在對蝦成體組織中的感染也是復(fù)制缺陷的。也就是說,假型病毒可以感染對蝦組織和細(xì)胞,甚至可以在對蝦宿主細(xì)胞內(nèi)表達(dá)病毒的蛋白和核酸,但是在異源細(xì)胞內(nèi)失去了包裝為成熟病毒粒子的能力。具體機(jī)制尚不清楚。

(A1—A3:未感染病毒對蝦的肌肉、心臟和鰓組織的電鏡分析結(jié)果。B1—B3:感染假型病毒Bacmid-GUS/VP28的對蝦肌肉、心臟和鰓組織的電鏡分析結(jié)果,B3′為B3圖中方框的放大結(jié)果,B3′圖中箭頭指示異常圓形結(jié)構(gòu)。C1和C2分別為感染假型病毒Bacmid-GUS/VP24的對蝦肌肉和心臟組織的電鏡分析結(jié)果,C2′為C2圖中方框的放大結(jié)果,C2′圖中箭頭指示不規(guī)則線性結(jié)構(gòu)。D1和D2分別為感染假型病毒Bacmid-GUS/VP19的對蝦肌肉和心臟組織的電鏡分析結(jié)果標(biāo)尺,2 μm。Panels A1 to A3 were the results of muscle, heart and gill tissue of uninfected shrimps. Panels B1 to B3 were the results of muscle, heart and gill tissue of shrimps infected by the pseudotyped baculovirus of Bacmid-GUS/VP28, and B3′ was the enlargement of the box in Panel B3. The arrow in the Panel B3′ indicates an abnormal circular structure. Panels C1 and C2 were the results of muscle and heart tissue of shrimps infected by pseudotyped baculovirus of Bacmid-GUS/VP24, respectively. C2′ is the enlargement of the box in Panel C2. The arrow in Panel C2′ indicated an irregular linear structure. Panels D1 and D2 were the results of muscle and heart tissue of shrimps infected by pseudotyped baculovirus of Bacmid-GUS/VP19, respectively.)

3 討論

囊膜蛋白是位于具囊膜病毒囊膜上的一類病毒蛋白,一般具有至少一個跨膜結(jié)構(gòu)域,其在病毒侵染過程中主要發(fā)揮識別和結(jié)合宿主細(xì)胞的作用,與病毒侵染的宿主范圍和組織與細(xì)胞特異性有關(guān)[2]。假型病毒是指囊膜中插入了另一種病毒的囊膜蛋白的病毒,外源囊膜蛋白的引入,往往導(dǎo)致假型病毒的親嗜性發(fā)生改變。共轉(zhuǎn)染是制備假型病毒的常用方法,即在病毒包裝時,將病毒載體質(zhì)粒、包裝表達(dá)質(zhì)粒和囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染至包裝細(xì)胞中,從而獲得假型病毒[3]。其中載體質(zhì)粒攜帶外源基因,包裝質(zhì)粒攜帶病毒復(fù)制和包裝的遺傳信息,表達(dá)質(zhì)粒攜帶其他病毒的囊膜蛋白基因。因此,過表達(dá)的囊膜蛋白能否定位于包裝細(xì)胞的細(xì)胞膜上是決定假型病毒制備能否成功的前提條件。Syed Mustha等[13]已報道,過表達(dá)的對蝦WSSV病毒囊膜蛋白VP28可定位于Sf9細(xì)胞的細(xì)胞膜上,并用免疫實驗證明了包裝出的昆蟲桿狀病毒的囊膜上攜帶了VP28。本研究采用紅色(mCherry)和綠色(eGFP)熒光蛋白報告基因分別標(biāo)記對蝦WSSV病毒的VP19和VP24兩種囊膜蛋白,進(jìn)一步分析了VP19和VP24在Sf9細(xì)胞中過表達(dá)后的亞細(xì)胞定位,發(fā)現(xiàn)這兩種囊膜蛋白同VP28類似,過表達(dá)后均可定位于包裝細(xì)胞Sf9的細(xì)胞膜上,表明昆蟲桿狀病毒從Sf9細(xì)胞中出芽和釋放時可攜帶WSSV病毒囊膜蛋白,這為VP19-和VP24-假型昆蟲桿狀病毒的成功制備奠定了基礎(chǔ)。

本研究中還發(fā)現(xiàn),VP19、VP24和VP28的表達(dá)均可不同程度地提高假型病毒的包裝效率,其中,以VP19的促包裝效果最明顯,但是其促進(jìn)包裝的具體機(jī)制尚不清楚。Chen等[5]采用類似的方法將VP19和VP28引入到慢病毒表達(dá)系統(tǒng),也明顯提高了假型慢病毒的包裝效率,分別比非假型慢病毒高出52.9%和129.4%?？梢?VP19和VP28在哺乳動物包裝細(xì)胞(293T)中的促包裝效果遠(yuǎn)高于其在昆蟲細(xì)胞中的結(jié)果(14.1%和11.7%)。本文作者認(rèn)為,這可能同VP19和VP28的表達(dá)質(zhì)粒在不同包裝細(xì)胞中的表達(dá)效率有關(guān)。上述囊膜蛋白表達(dá)質(zhì)粒中采用的啟動子為CMV啟動子,該啟動子在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)為強(qiáng)啟動子,活性高,但是其在昆蟲細(xì)胞中為弱啟動子[14]。此外,還發(fā)現(xiàn)報告質(zhì)粒pcDNA3.1-VP28-△TAA/mCherry單獨轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞時的CMV啟動子活性更低,紅色熒光信號很弱;但是,將其與Bacmid-GUS共轉(zhuǎn)染Sf9細(xì)胞時,紅色熒光信號明顯變強(qiáng),但是轉(zhuǎn)染效率仍遠(yuǎn)低于其在哺乳動物細(xì)胞(HeLa)中的轉(zhuǎn)染效率(結(jié)果未發(fā)表)。可見,昆蟲桿狀病毒的表達(dá)產(chǎn)物可以激活CMV啟動子的活性。

Wu等[6]已報道了VP28-假型病毒感染對蝦活體的研究結(jié)果,發(fā)現(xiàn)VP28-假型病毒僅感染對蝦的心臟、鰓和腸組織,不能感染Oka器官和肌肉組織,具有組織特異性。其在單個對蝦的心臟和鰓組織中的最低感染劑量為1.5×107個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,在單個對蝦腸組織中最低感染劑量為3×107個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。本文在VP28-假型病毒感染對蝦成體的組織特異性及其最低感染劑量上的研究結(jié)果同Wu等[6]的結(jié)果不完全相同。首先,在病毒感染的組織特異性上,本研究中沒有在腸組織中檢測到陽性結(jié)果,這可能與腸道中有食物殘渣,尤其是大腸桿菌有關(guān)。因為大腸桿菌可表達(dá)GUS蛋白,導(dǎo)致腸道出現(xiàn)假陽性結(jié)果。因此,在對蝦成體染毒前,一定要將對蝦進(jìn)行饑餓處理,以降低假陽性出現(xiàn)的概率。另外,本文發(fā)現(xiàn)當(dāng)病毒對單個對蝦的感染劑量為1×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位時,可在肌肉組織中檢測到GUS信號,即VP28-假型病毒在單個對蝦肌肉組織中的最低感染劑量為1×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,而Wu等[6]的工作中所檢測的對單個對蝦的最大染毒劑量為6×108個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,從而導(dǎo)致其在肌肉組織中出現(xiàn)假陰性的檢測結(jié)果。最后,本文在單個對蝦鰓組織中的最低感染劑量為1×108個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位,高于Wu等[6]結(jié)果,這說明在更低的感染劑量下假型病毒也能感染對蝦的鰓組織。

本文首次將VP19和VP24引入到昆蟲桿狀病毒表達(dá)系統(tǒng)(Bacmid-GUS)中,探究了其對假型昆蟲桿狀病毒在對蝦活體組織中的親嗜性的影響。發(fā)現(xiàn)與VP28-假型病毒不同,VP19-和VP24-假型病毒僅能感染對蝦的心臟和肌肉組織。尤其是3種假型病毒在肌肉中的最低感染劑量差異明顯,VP19、VP24和VP28的假型病毒在單個對蝦肌肉中的最低感染劑量分別為1×1011、1×108和1×109個轉(zhuǎn)導(dǎo)單位。這說明上述3種囊膜蛋白在對蝦WSSV病毒感染肌肉組織時的貢獻(xiàn)可能也是不同的。

已有研究表明,昆蟲桿狀病毒可以感染哺乳動物細(xì)胞并表達(dá)外源基因,但是其在哺乳動物細(xì)胞內(nèi)不能進(jìn)行增殖,是復(fù)制缺陷的[15]。因此,昆蟲桿狀病毒在異源的對蝦組織中是否能夠復(fù)制和增殖也是本文作者想了解的一個科學(xué)問題。本文通過透射電鏡觀察了上述3種假型病毒感染陽性的對蝦心臟、肌肉和鰓組織,但未在感染組織中觀察到成熟的桿狀病毒粒子。僅在感染VP28-假型病毒的對蝦鰓組織細(xì)胞內(nèi)觀察到異常的圓形結(jié)構(gòu),以及感染VP24-假型病毒的對蝦心臟組織細(xì)胞內(nèi)觀察到不規(guī)則的線性結(jié)構(gòu)。其中,圓形結(jié)構(gòu)直徑為90 nm左右,線性結(jié)構(gòu)長度為100～400 nm,與成熟的昆蟲桿狀病毒大小(30～60 nm×250～300 nm)不符合。在對蝦成體中能檢測到上述假型昆蟲桿狀病毒含GUS基因的表達(dá)產(chǎn)物,但未觀察到成熟的病毒粒子,這表明,與昆蟲桿狀病毒感染哺乳動物細(xì)胞的結(jié)果類似,昆蟲桿狀病毒在對蝦細(xì)胞內(nèi)可能也無法進(jìn)行復(fù)制或包裝,是復(fù)制缺陷的。

綜上所述,本研究成果拓展了人們對于對蝦WSSV病毒囊膜蛋白在假型昆蟲桿狀病毒的包裝及其侵染對蝦的組織特異性上的作用的認(rèn)知。